一种抗流感病毒寡核苷酸的结构、制备方法和用途的制作方法

专利名称：一种抗流感病毒寡核苷酸的结构、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域及有机合成领域，具体地说是一种靶向程序细胞死 tia 5 (PDCD5, Programmed cell deathprotein 5) ^n^fiJit^^l^ (IV, influenza virus) 感染的寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列药物的新结构、修饰方法及其治疗药物。
背景技术：
流感病毒感染可引起急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。甲型流感威胁最大，且易发生变异，易引起暴发流行。1918年至1920年，著名的"西班牙流感〃在全球范围内造成了 2000万-4000万人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2)所致的〃亚洲流感"、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的"香港流感"、1977年由甲型流感病毒(HlNl)所致的"俄罗斯流感"、1997年以来出现的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)，以及2009年出现的甲型流感病毒(HlNl)感染，都严重威胁了人们健康和正常生活。流感作为急性呼吸道传染病严重威胁着人们的健康，对于儿童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其严重，而且也已成为社会劳动力损失、医疗负担加重乃至社会不安定的主要原因之一。由于流感病毒变异，常规疫苗不能有效预防流感的发生和流行。过去用于治疗流感的两种较低廉的抗病毒药物三环癸胺(amantadine)和金刚乙胺(remantadine)对人体内流感病毒几乎不起作用，且耐药较为普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂(例如达菲和帕纳米韦)虽效果较好，但随着临床广泛应用，耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺乏可靠的方法对流感的发生和流行进行有效的控制，有效的预防和控制流感病毒方法的已成当务之急。因此研究特异性高、毒副作用小的新型抗流感病毒药物对治疗与预防具有重要现实意义。病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必需的细胞机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病毒信号或者阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生的频率。PD⑶5是一种凋亡效应分子，表达广泛，进化保守，具有促进凋亡和促进 Parapotosis的效应，其编码区全长559bp，编码的PDCD5蛋白由125个氨基酸组成，具有促进多种肿瘤细胞凋亡和抑制增殖的效应。流感病毒感染引起细胞病变(cytopathic effect, CPE)和凋亡，因此，抑制PD⑶5可能保护细胞免受病毒伤害。核酸药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特别是近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。目前几乎所有大的国际制药公司均投入巨资进行核酸药物的研发，如诺华和辉瑞公司分别与ISIS和Eyetech公司共同开发的核酸药物Vitravene和Macugen已批准上市，另有几十个正在进行临床研究。反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15 30个核苷酸。 通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡核苷酸作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。反义药物，其能与特定基因杂交，进而在基因水平干扰致病蛋白的产生，具有比传统药物更高的特异性和高效性。但是由于反义寡核苷酸的作用靶点必须定位于胞内，反义核酸只有在进入细胞内才能起到其应有的效果，但它本身是阴离子多聚体，相对分子质量大、极性强、电负性强，这些特性使其难以透过细胞膜的类脂双分子层进入细胞，故反义药物细胞摄取率低。有报道称仅有 2%的反义药物被细胞摄取，因此，细胞摄取是反义药物研发过程中的一大挑战，所以导向入胞是反义药物及其他细胞摄取率的药物研究的一项重要任务。目前提高反义药物细胞摄取量的方法主要有偶联多聚阳离子、与阳离子脂质体形成反义寡核苷酸脂质体复合物、偶联跨膜肽等。这些物质虽然能有效地提高反义药物的细胞摄取量，但由于它们潜在的细胞毒性使其临床应用受到了一定的限制，因此亟待寻找更加合适的靶向修饰分子，提高反义寡核苷酸类化合物的胞内摄取与药效。金刚乙胺是一种人工合成抗病毒药，通过阻止病毒进入宿主细胞，并抑制病毒的复制，从而抑制病毒繁殖，起到抗病毒的效果。虽然目前金刚乙胺是不错的抗流感病毒药物，但流感病毒的抗原漂移使其对金刚乙胺产生了一定的耐药性。本实验室以宿主基因PDCD5为靶点，设计合成了反义核酸药物，并证明了其对流感病毒感染所致细胞病变(cytopathic effect, CPE)有抑制作用，我们命名该序列为 PR0P5，进一步为了提高该序列的抗流感活性，克服PR0P5的细胞摄取率低的缺点，本研究利金刚乙胺或者脂肪链偶联到PR0P5分子上，以期能够借助金刚乙胺的透膜性及靶向性提高PR0P5在细胞中的摄取量，并提高其治疗流感的效用。修饰后对该序列的抗流感活性进行检测，发现该序列的抗流感活性有了很大的提高。用荧光标记的修饰及未修饰序列，流式细胞术检测细胞中的荧光强度，发现经过修饰的序列进入细胞的速度和量都有很大程度的提尚。

发明内容
本发明的目的在于提供一种抗流感病毒药物设计的靶向宿主靶标PDCD5阻断流感病毒复制、抑制流感病毒致病的寡核苷酸序列修饰结构，制备方法及其药物。本发明的主要内容是利用化学合成方法用脂肪链或金刚乙胺修饰靶向宿主蛋白 PD⑶5抗甲型流感活性较高的ASODN序列PR0P5，提高了其透膜性，并因此提高该序列的抗流感活性。设计了分别在3，、5，修饰脂肪链(P-ZF、ZF-P)或者金刚乙胺(P_JG、JG-P)和在 3’端修饰脂肪链并在5’端修饰金刚乙胺(JG-P-ZF) 5种针对反义寡核苷酸PR0P5的修饰方法，初步筛选结果显示3’端脂肪链修饰(P-JG)抑制病毒Hmi (A/京防/86-1)所致CPE 作用最佳，JG-P和P-zf次之。进而实验结果证明，修饰后的PR0P5序列对H3N2(A/鲁防/9/93)及金刚乙胺耐药株H3N2(A/京防/073103/2009)流感病毒所致CPE抑制IC5tl都降低了 30% 60%，进一步用荧光素(FAM)标记的PR0P5序列及金刚乙胺修饰的PR0P5序列验证了修饰对细胞摄取反义序列的影响，结果表明金刚乙胺修饰在一定程度上提高了细胞对反义序列的摄取，说明修饰都是提高细胞对反义核酸序列摄取的有效修饰手段。根据本发明，对新型生物工程药物ASODN可以进行有效的化学修饰。根据本发明，P-JG、JG-P, P-ZF, ZF-P, JG-P-ZF能特异性抑制流感病毒的复制，有可能成为治疗及预防流感病毒感染相关疾病的新型生物工程药物。根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明包含了 PR0P5硫代修饰、甲基修饰、金刚乙胺修饰或脂肪链修饰。根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的制剂。根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其他寡核苷酸及其衍生物形式，还可以含有治疗上可以接受的载体材料，如脂质体、融合肽或病毒载体等。根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。本发明的实施对严重危害人类健康的流感病毒感染的治疗具有重要的社会效益和经济效益。


图1 PR0P5单端金刚乙胺修饰形成螯合物的成路线图
图2 PR0P5单端脂肪链修饰形成螯合物合成路线3 PR0P5的金刚乙胺或脂肪链螯合物剂量依赖性抑制Hmi型流感病毒所致CPE图4 PR0P5的金刚乙胺或脂肪链螯合物剂量依赖性抑制H3N2型流感病毒所致CPE图5 PR0P5的金刚乙胺或(和)脂肪链螯合物剂量依赖性抑制金刚乙胺耐药株 H3N2型流感病毒所致CPE图6 RP-HPLC分析PR0P5纯度图像图7 RP-HPLC分析P-JG纯度图像图 8 RP-HPLC 分析 FAM-P-JG 纯度图像图9荧光倒置显微镜观察0 32小时不同时间点细胞对FAM-P和FAM-P-JG的摄取图10流式细胞术检测0 32小时细胞内的荧光强度值图11流式细胞术测定0 32小时金刚乙胺修饰对PR0P5透膜的促进率图12荧光倒置显微镜观察0 60分钟不同时间点A549细胞对FAM-P和 FAM-P-JG的摄取图13流式细胞术检测0 60分钟细胞内的荧光强度值图14流式细胞术测定0 60分钟金刚乙胺修饰对PR0P5透膜的促进率
具体实施例方式实施例一本实施例主要说明经过金刚乙胺及脂肪链修饰的PR0P5的合成及其在体外A549 细胞或者MDCK细胞水平抑制Hmi型、H3N2所致CPE活性的研究。材料与方法1.寡核苷酸PR0P5的设计和合成检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的PD⑶5 mRNA参考序列 NM_004708. 2，对其进行RNA 二级结构的计算机模拟，选择了 5个不稳定的茎环结构作为反义寡核苷酸的作用靶点。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达，在基因上的靶位为151 170，命名该序列为PR0P5。其序列为5，CCCTGTGCTTTGCTTCCTGT3，。寡核苷酸采用8909型自动DNA合成仪合成全硫代修饰的反义寡核苷酸。合成完毕浓氨水切割并脱保护15小时(hour，h) 后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo Prep 0P120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20°C保存备用。2. PR0P5单端修饰金刚乙胺(JG)的螯合物的设计合成设计合成5 ’端金刚乙胺修饰的PROP 5序列(JG-P)，3 ’端金刚乙胺修饰的PROP 5 序列(P-JG)，并进行纯化与纯度分析。合成路线图见附图1，偶联的工艺设计及化合物合成步骤如下1)盐酸金刚乙胺经碱性化合物处理后加入到含有琥珀酸酐的有机溶剂中，于0 60°C条件下搅拌1 12小时，蒸除溶剂后重结晶得到白色结晶(化合物2)。2)将化合物2溶解于有机溶剂中，加入2- (4-氨基丁基)_1，3_丙二醇和缩水剂， 于0 50°C条件搅拌1 6小时，反应结束后蒸除溶剂，重结晶得白色结晶(化合物3)。3)将化合物3溶解于有机溶剂中，然后将DMTCl加入到反应体系中，于-10 50°C 下反应1 3小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的白色固体(化合物4)。4)化合物4溶解于有机溶剂中，然后将琥珀酸酐加入到反应体系中，于10 80°C 下反应1 4小时，蒸除溶剂重结晶得白色固体(化合物5)。5)化合物4溶解于有机溶剂中，然后将磷酰化试剂加入到反应体系中，于-10 40°C下惰性气体保护反应0.5 4小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的白色固体(化合物6)。6)将化合物5的溶液与CPG混合，0 50°C下反应5 40小时，过滤的白色载体 7。7)将载体7 (20. OOmg)装入DNA合成仪，合成P-JG，然后浓氨水切割，过OPC柱， HPLC分离纯化。离心抽干。8)将固体6溶解，装入DNA合成仪，合成JG_P。反应结束后经浓氨水切割，过OPC 柱，HPLC分离纯化。离心抽干。在上述过程1)中，反应所使用的碱性化合物可以是无机碱性化合物CaO、MgO、 Na2C03、NaHCO3> Κ0Η、NaOH、K2CO3, KHCO3, KF其中之一。在2~)中反应所使用的缩水剂为羰基二咪唑(⑶I)，N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)酯，N-羟基苯并三唑酯(HOBt)，二环己基碳二亚胺(DCC)，二异丙基碳二亚胺(DIC)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)，4-N， N-二甲基吡啶(DMAP)，4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉氯化物(DMT-MM)中的一种或
7几种。在上述各步反应中，所用有机溶剂为乙腈、丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基亚酰胺、二甲基亚砜、1，2_ 二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、和二氧六环其中之一；重结晶所用溶剂为水、乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、石油醚中的一种或几种。3. PR0P5单端修饰脂肪链形成螯合物的设计合成设计合成5’端脂肪链修饰的PROP 5序列(ZF-P)，3’端脂肪链修饰的PROP 5序列(P-ZF)，并进行纯化与纯度分析。合成路线见附图2，偶联的工艺设计及操作过程如下 1)将二十二酸1溶解于有机溶剂中，将氨基醇2的溶液加入到其中，加入缩水剂DCC，于0 60°C条件下搅拌1 12小时，蒸除溶剂后重结晶得浅黄色结晶(化合物3)。2)将化合物3溶解于有机溶剂中，然后将DMTCl加入到反应体系中，于-10 50°C 下反应1 3小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的浅黄色蜡状固体(化合物4)。3)化合物4溶解于有机溶剂中，然后将琥珀酸酐加入到反应体系中，于10 80°C 下反应1 4小时，蒸除溶剂重结晶得浅黄色固体(化合物5)。4)化合物4溶解于有机溶剂中，然后将磷酰化试剂加入到反应体系中，于-10 40°C下惰性气体保护反应0. 5 4小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的白色泡沫状固体(化合物6)。5)将化合物5的溶液与CPG混合，0 50°C下反应5 40小时，过滤得白色载体 7。6)将载体7装入DNA合成仪，合成P-ZF，然后浓氨水切割，过OPC柱，HPLC分离纯
化。离心抽干。7)将固体6溶解，装入DNA合成仪，合成ZF_P。反应结束后经浓氨水切割，过OPC 柱，HPLC分离纯化。离心抽干。4. PR0P5 3’端脂肪链修饰并且5’端金刚乙胺修饰螯合物(JG_P_ZF)的合成参照材料与方法3合成的固体7，将载体7装入DNA合成仪，合成P_ZF，参照材料与方法2合成的固体6，并溶解，装入DNA合成仪，合成JG-P-ZF。反应结束后经浓氨水切割， 过OPC柱，HPLC分离纯化。离心抽干。5. A549细胞、MDCK细胞、病毒和对照药物病毒在10日龄SPF鸡胚传代，收集尿囊液，测定其血凝(Hemagglutination，HA) 效价，取HA价>1 26者，混勻、分装、保存于-70°C备用。使用的病毒毒株为A/京防 /86-1 (HlNl)、A/ 鲁防 /9/93 (H3N2)，金刚乙胺耐药病毒株 A/ 京防 /073103/2009 (H3N2)。 A549细胞培养液为含10%胎牛血清(Gibco)的FlI培养液；MDCK细胞培养液为含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培养液，细胞孵育培养条件为5%浓度C02，37°C，病毒感染和CPE测定时使用含胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的维持液。抗流感病毒阳性对照药物为金刚乙胺。6.偶联金刚乙胺及脂肪链后的PR0P5抑制Hmi型流感病毒所致CPE的剂量依赖作用A549细胞贴壁培养至对数生长期，胰酶消化收集细胞，将A549细胞铺96孔细胞培养板，次日60 80%长满。用含FBS的FlI培养基倍比稀释PR0P5、JG-P, P-JG,ZF-P 及 P-ZF 至 0. 125,0. 25,0. 5,1. 0,2. 0 μ mol/L( μ Μ)。以 PBS (ρΗ7. 5)冲洗一次，加入 100TCID50/0. Iml 的 Η3Ν2 型病毒稀释液 50 μ 1，37°C感染孵育 60min。再以 PBS (pH7. 5)冲洗一次，分别加入100 μ 1不同浓度的JG-P、P-JG, ZF-P, P-ZF和同浓度PR0P5，同时设立盐酸金刚乙胺阳性药对照、病毒感染对照和正常Α549细胞对照。37°C培养2天(d)。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 试剂盒(Promega 产品)测定 CPE 程度(以 OD490 表示)，计算药物抑制Hmi型流感病毒所致CPE抑制率和IC5(1。7.偶联金刚乙胺及脂肪链后的PR0P5抑制H3N2型流感病毒所致CPE的剂量依赖作用参照实施例一材料与方法6将A549细胞铺96孔细胞培养板，次日60 80%长满。用含 1 % FBS 的 F12K 培养基倍比稀释 PR0P5、JG-P、P-JG, ZF-P 及 P-ZF 至 0. 1,0. 2、 0. 4,0. 8、1. 6μΜ。用 PBS(ρΗ7. 5)冲洗一次，加入 100TCID50/0. Iml 的 Η3Ν2 型病毒稀释液50μ 1，37°C感染孵育60min。再以PBS(pH7. 5)冲洗一次，分别加入100 μ 1不同浓度的 JG-P、P-JG、ZF-P、P-ZF和同浓度PR0P5，同时设立盐酸金刚乙胺阳性药对照、病毒感染对照和正常 A549 细胞对照。37°C培养 2 天(d)。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 试剂盒(Promega产品)测定CPE程度(以OD49tl表示)，计算药物抑制H3N2型流感病毒所致 CPE抑制率和IC5tl。8.偶联金刚乙胺及脂肪链后PR0P5抑制金刚乙胺耐药毒株H3N2型流感病毒所致 CPE的剂量依赖作用参照实施例一材料与方法6将MDCK细胞铺板96孔细胞培养板，次日60 80 % 长满。用含1 % FBS的DMEM培养基倍比稀释PR0P5、JG-P, P-JG, ZF-P, P-ZF及JG-P-ZF至 0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6μΜ。以 PBS(pH7. 5)冲洗一次，加入 100TCID50/0. Iml 的金刚乙胺耐药H3N2型病毒稀释液50μ 1，37°C感染孵育60min。再以PBS (pH7. 5)冲洗一次，分别加入 100 μ 1不同浓度的JG-P、P-JG、ZF-P、P-ZF、JG-P-ZF和同浓度PR0P5，同时设立盐酸金刚乙胺阳性药对照、病毒感染对照和正常A549细胞对照。37°C培养3天(d)。利用CellTiter96 Aqueous One Solution试剂盒(Promega产品)测定CPE程度(以OD49tl表示)，计算药物抑制H3N2型流感病毒所致CPE抑制率和IC5tl。结果1.偶联化合物的合成合成分别得到新PR0P5的5’端或3’端金刚乙胺修饰的化合物JG-P和P-JG ；PR0P5 的5’端或3’端脂肪链修饰的化合物ZF-P和P-ZF ；及5’端金刚乙胺并且3’脂肪链修饰的化合物JG-P-ZF，对合成后样品进行RP-HPLC分析，化合物纯度在95%以上。RP-HPLC分析结果显示，未进行任何修饰的反义寡核苷酸PR0P5与螯合物的色谱保留时间不一致，偶联后化合物的色谱保留时间增加。2.偶联金刚乙胺或脂肪链后的PR0P5抑制Hmi型流感病毒所致CPE的剂量依赖作用PR0P5、JG-P, P-JG, ZF-P, P-ZF及金刚乙胺抑制Hmi型流感病毒所致CPE检测结果得出，PR0P5组抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl为0. 625 μ Μ,盐酸金刚乙胺阳性药对照组抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl为0. 746 μ Μ, P-ZF组抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl为0. 137 μ Μ，如图3所示，与未修饰相比，3’端脂肪链修饰后PR0P5对流感病毒所致CPE的抑制IC5tl降低了 78%左右，5，端金刚乙胺修饰后JG-P抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl为0. 141 μ Μ，3’端金刚乙胺修饰后P-JG抑制Hmi型流感病毒所致CPE的 IC50为0. 214 μ Μ，5，端或者3，端金刚乙胺修饰后JG-P或者P-JG抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl为分别下降了 77%或者65%左右。3.偶联金刚乙胺或脂肪链后的PR0P5抑制Η3Ν2型流感病毒所致CPE的剂量依赖作用PR0P5、JG-P, P-JG, ZF-P, P-ZF及金刚乙胺抑制Η3Ν2型流感病毒所致CPE检测结果得出，PR0P5组抑制Η3Ν2型流感病毒所致CPE的IC5tl为0. 325 μ Μ,盐酸金刚乙胺对Η3Ν2 型流感病毒所致CPE抑制作用剂量依赖关系不明显，P-ZF组抑制Η3Ν2型流感病毒所致CPE 的IC5tl为0. 175 μ Μ，如图4所示，与未修饰相比，3’端脂肪链修饰后PR0P5对流感病毒所致 CPE的抑制IC5tl降低了 46%左右，5，端金刚乙胺修饰后JG-P抑制Hmi型流感病毒所致CPE 的IC5tl为0. 213 μ Μ，3，端金刚乙胺修饰后P-JG抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl为 0. 141 μ Μ，5’端或者3’端金刚乙胺修饰后JG-P或者P-JG抑制Hmi型流感病毒所致CPE 的IC5tl为分别下降了 34%或者56%左右。4.偶联金刚乙胺及脂肪链后PR0P5抑制金刚乙胺耐药毒株Η3Ν2型流感病毒所致 CPE的剂量依赖作用PJG抑制金刚乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒所致CPE检测结果得出，PR0P5组抑制金刚乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒所致CPE的IC5tl为0. 391 μ Μ，盐酸金刚乙胺对金刚乙胺耐药 Η3Ν2型流感病毒所致CPE抑制作用无剂量依赖性，JG-P-ZF组抑制金刚乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒所致CPE的IC5tl为0. 316 μ Μ, P-ZF组抑制金刚乙胺耐药Η3Ν2型流感病毒所致CPE 的IC5tl为0. 164 μ Μ，如图5所示，与未修饰相比，3’端脂肪链修饰后PR0P5对金刚乙胺耐药 Η3Ν2型流感病毒所致CPE的IC5tl降低了 47%左右。结论通过3’端偶联金刚乙胺或者脂肪链，或者5’端偶联金刚乙胺可以在各个浓度下都提高了 PR0P5对流感病毒Hmi所致CPE抑制率，并有效降低抑制流感病毒Hmi所致CPE 的 ic5Q。通过3’端偶联金刚乙胺或者脂肪链，或者5’端偶联金刚乙胺可以在各个浓度下都提高了 PR0P5对流感病毒H3N2所致CPE抑制率，并有效降低抑制流感病毒H3N2所致CPE 的 ic5Q。通过3’端偶联脂肪链，PR0P5对金刚乙胺耐药流感病毒H3N2所致CPE抑制IC5tl 降低了 47%。PR0P5对甲型流感病毒的抑制存在普遍性，金刚乙胺修饰或者脂肪链修饰后， PR0P5抵抗甲型流感病毒感染的活性增强。实施例二 ；本实施例主要说明靶向人PDCD5基因抗流感病毒反义寡核苷酸(PR0P5)金刚乙胺修饰物荧光标素(FAM)标记的设计、合成和促进细胞摄取效率的验证。材料与方法1. A549 细胞A549细胞培养液为含10%胎牛血清(Gibco)的FlI培养液，贴壁培养至对数生长期，用胰酶消化收集细胞，铺6孔培养板，贴壁培养至70%细胞融合加药进行试验。细胞孵育培养条件为5%浓度C02，37°C，加药时使用含胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的维持液。2.金刚乙胺与PR0P5的偶联及荧光素修饰参照实施例材料与方法1和2，使用优化合成路线及各步反应条件进行合成，合成高纯度的3’端与金刚乙胺偶联的PR0P5-金刚乙胺序列(P-JG)并借助各类分析手段确保得到的偶联化合物纯度高、结构正确。所得产物在5’端修饰荧光素(FAM)得到5’端FAM 标记3’端金刚乙胺修饰的螯合物(FAM-P-JG)。参照实施例材料与方法1合成PR0P5序列， 将PR0P5序列同样用荧光素标记得到5’端FAM修饰的PR0P5序列(FAM-P)。3.荧光显微镜观察细胞对FAM-P和FAM-P-JG的摄取一用含1 %胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的F12K培养基稀释FAM-P和FAM-P-JG至 1. ομ M，细胞1. 0 μ M给药0、l、2、4、8、16、32h后将细胞培养液弃去，用PBS (pH = 7. 4)将6 孔培养板中的细胞洗3遍，洗去胞外的荧光物质，之后向6孔培养板中加入2ml PBS (pH = 7. 4)缓冲液，置荧光显微镜下观察荧光强度并拍照。4.流式细胞仪分析检测细胞对FAM-P和FAM-P-JG的摄取一用含1 %胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的F12K培养基稀释FAM-P和FAM-P-JG至 1.0μM，细胞1.0μM给药0、l、2、4、8、16、32h后将细胞培养液弃去，PBS(pH = 7. 4)洗3遍， 胰酶消化并收集细胞，PBS (pH = 7. 4)重悬细胞后，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀用含
0.胎牛血清的PBS重悬成均勻的细胞悬液，采用流式细胞仪检测不同时间点的胞内荧光值强度。5.荧光显微镜观察细胞对FAM-P和FAM-P-JG的摄取二用含1 %胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的F12K培养基稀释FAM-P和FAM-P-JG至
1.Ομ M，细胞1. O μ M给药0、15、30、45、60min后将细胞培养液弃去，用PBS (pH = 7. 4)将6 孔培养板中的细胞洗3遍，洗去胞外的荧光物质，之后向6孔培养板中加入2ml PBS (pH = 7. 4)缓冲液，置荧光显微镜下观察荧光强度并拍照。6.流式细胞仪分析检测细胞对FAM-P和FAM-P-JG的摄取二用含1 %胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的F12K培养基稀释FAM-P和FAM-P-JG至 1. ΟμΜ，细胞1. ΟμΜ给药0、15、30、45、60min后后将细胞培养液弃去，PBS (pH = 7. 4)洗3 遍，胰酶消化并收集细胞，PBS (pH = 7. 4)重悬细胞后，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀用含0. 胎牛血清的PBS重悬成均勻的细胞悬液，采用流式细胞仪检测不同时间点的胞内荧光值强度。结果1.金刚乙胺与PR0P5螯合物的合成合成得到新的5 ’端FAM修饰和3 ’端金刚乙胺修饰PR0P5的化合物FAM-P-JG和5 ’ 端FAM修饰PR0P5的化合物FAM-P，对合成后样品进行RP-HPLC分析，化合物纯度在95 %以上(FAM-P-JG纯度81. 27%). RP-HPLC分析结果显示，只进行FAM任何修饰的反义寡核苷酸FAM-P与偶联化合物FAM-P-JG的色谱保留时间不一致，偶联金刚乙胺后化合物FAM-P-JG 的色谱保留时间增加，典型的分析图像如图6、图7、图8所示。2.荧光显微镜观察PR0P5偶联金刚乙胺前后的胞内摄取一
由于FAM-P与FAM-P-JG的5，端都带有荧光素(FAM)，FAM在波长480 520nm范围内激发出绿色荧光，因此可以利用FAM在激发光下发出绿色荧光的强度比较其细胞摄取量的多少。荧光显微镜观察结果如图9所示，PR0P5与金刚乙胺偶联后形成的化合物FAM-P-JG 作用于A549细胞后的荧光强度强于FAM-P，在Ih之前，显微镜观察FAM-P-JG与FAM-P的荧光强度相差不大，而在4h时，FAM-P-JG荧光强度比FAM-P要强，且均比池时的荧光强度强， 随着孵育时间增加，荧光强度进一步增强，且FAM-P-JG组的荧光强度明显强于FAM-P组。3.流式细胞术定量分析PR0P5偶联金刚乙胺后细胞摄取的差异一荧光显微镜检测可以直接的观察到药物在细胞内的分布，但由于其无法准确定量，因此采用流式细胞术定量检测PR0P5偶联金刚乙胺前后A549细胞对药物FAM-P和 FAM-P-JG摄取的差异。各个时间点金刚乙胺修饰组的荧光强度值都比未用金刚乙胺修饰的要高，并且在0 32h中强度值一直在增加，如图10所示，但计算修饰后对细胞摄取的促进增加的百分比可以得出，随着时间的延长，修饰对细胞摄取的促进的程度在降低，各个时间点的促进程度如图11所示。由于在Ih细胞内的荧光强度，已经相当高，所以下步实验将 O-Ih的时间段进行了进一步的细化。4.荧光显微镜观察PR0P5偶联金刚乙胺前后胞内摄取二荧光显微镜观察结果如图12所示，PR0P5与金刚乙胺偶联后形成的化合物 FAM-P-JG作用于A549细胞后的荧光强度强于FAM-P。在45min以前，FAM-P-JG与FAM-P的荧光强度看似相差不大，而在45min及其以后，FAM-P-JG荧光强度明显比FAM-P要强。5.流式细胞术定量分析不同时间点PR0P5偶联金刚乙胺后细胞摄取的差异二采用流式细胞术定量检测0-60min各个时间点PR0P5偶联金刚乙胺前后(FAM-P 与FAM-P-JG)A549细胞对药物摄取(细胞自发荧光值2. 6左右)的差异，发现0-60min各个时间点FAM-P-JG组的荧光强度值都比FAM-P的要高，如图13所示，但计算修饰后对细胞摄取的促进增加的百分比可以得出，随着时间的延长，在0-60min中修饰对细胞摄取的促进的程度先降低后升高，各个时间点的促进程度如图14所示。流式细胞术检测结果证明FAM-P-JG组的细胞摄取能力均比FAM-P组强，且细胞摄取量呈现时间依赖性。但在各个时间点上，偶联金刚乙胺对反义序列PR0P5进入细胞的促进效率不同，在加入反义药物的几秒钟内，FAM-P-JG组的细胞荧光强度比FAM-P组增强了 90% 130%，而在30分钟 (minute,min)时促进度降低到了 80%左右，在60min时，促进程度又回升到了 120%左右， 可能是因为FAM-P-JG的极性较低，比FAM-P序列对细胞膜有着更高的亲和力，FAM-P-JG初加入时就比FAM-P更多的吸附在细胞膜上，所以用流式细胞术进行检测时，实验结果显示金刚乙胺修饰对反义序列入胞的促进度非常高，在加入反义序列的30min左右应该是反义序列在细胞膜上吸附与脱落达到平衡的一个时间段，此时反义序列在细胞膜表面分布尚未大量进入细胞，所以该时间点的荧光数据应该是明确显示了修饰对反义序列与细胞亲和作用的提高，此后，反义序列开始进入细胞，由于细胞表面FAM-P-JG比FAM-P序列的浓度要高，所以更快的在细胞中累积，所以促进程度又有可能上升。加入反义序列Ih至3 整个过程中，金刚乙胺修饰对反义序列入胞的促进程度逐渐降低，原因可能是金刚乙胺修饰后反义序列入胞较快，培养基中的序列浓度降低也比FAM-P快，降低了序列靠近细胞膜的几率，同时修饰后细胞内FAM-P-JG反义序列浓度的升高也比FAM-P快，FAM-P-JG有可能比 FAM-P在细胞内外产生更高的序列浓度差，这样就增加了 FAM-P-JG进入细胞的难度，所以FAM-P-JG与FAM-P序列在细胞中的浓度也逐渐趋于平衡。结论FAM-P-JG比FAM-P具有更高的细胞摄取效率，金刚乙胺修饰可以降低ASODN序列的电负性，提高细胞对反义序列的摄取效率，提高反义药物的细胞利用度。
权利要求
1.一种脂肪链或金刚乙胺修饰的寡核苷酸的结构、制备方法，及其在制备用于治疗流感病毒感染及其相关疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的脂肪链或者金刚乙胺修饰的寡核苷酸，其结构通式选自下列五类结构。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征是经过不同化学修饰。
4.根据权利要求3所述的化学修饰，其化学修饰为硫代修饰。
5.根据权利要求1，2，3，4所述的脂肪链或金刚乙胺修饰的寡核苷酸，可以制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于流感病毒感染及其相关性疾病的治疗。
6.根据权利要求1，2，3，4，5所述的脂肪链或金刚乙胺修饰的寡核苷酸，其特征在于， 通过如下步骤合成1)盐酸金刚乙胺经碱性化合物处理后加入到含有琥珀酸酐的有机溶剂中，于O 60°C 条件下搅拌1 12小时，蒸除溶剂后重结晶得到白色结晶(化合物2)；2)将化合物2溶解于有机溶剂中，加入2-(4-氨基丁基)-1，3-丙二醇和缩水剂，于O 50°C条件搅拌1 6小时，反应结束后蒸除溶剂，重结晶得白色结晶(化合物3)；3)将化合物3溶解于有机溶剂中，然后将DMTCl加入到反应体系中，于-10 50°C下反应1 3小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的白色固体(化合物4)；4)化合物4溶解于有机溶剂中，然后将琥珀酸酐加入到反应体系中，于10 80°C下反应1 4小时，蒸除溶剂重结晶得白色固体(化合物5)；5)化合物4溶解于有机溶剂中，然后将磷酰化试剂加入到反应体系中，于-10 40°C 下惰性气体保护反应0.5 4小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的白色固体(化合物6)；6)将化合物5的溶液与CPG混合，O 50°C下反应5 40小时，过滤的白色载体7；7)将载体7(20. OOmg)装入DNA合成仪，合成P-JG，然后浓氨水切割，过OPC柱，HPLC分离纯化，离心抽干；8)将固体6溶解，装入DNA合成仪，合成JG-P，反应结束后经浓氨水切割，过OPC柱， HPLC分离纯化，离心抽干；或者a)将二十二酸1溶解于有机溶剂中，将氨基醇2的溶液加入到其中，加入缩水剂DCC， 于0 60°C条件下搅拌1 12小时，蒸除溶剂后重结晶得浅黄色结晶(化合物3)；b)将化合物3溶解于有机溶剂中，然后将DMTCl加入到反应体系中，于-10 50°C下反应1 3小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的浅黄色蜡状固体(化合物4)；c)化合物4溶解于有机溶剂中，然后将琥珀酸酐加入到反应体系中，于10 80°C下反应1 4小时，蒸除溶剂重结晶得浅黄色固体(化合物5)；d)化合物4溶解于有机溶剂中，然后将磷酰化试剂加入到反应体系中，于-10 40°C 下惰性气体保护反应0. 5 4小时，蒸除溶剂，然后萃取，浓缩的白色泡沫状固体(化合物 6)；e)将化合物5的溶液与CPG混合，0 50°C下反应5 40小时，过滤得白色载体7；f)将载体7装入DNA合成仪，合成P-ZF，然后浓氨水切割，过OPC柱，HPLC分离纯化， 离心抽干；g)将固体6溶解，装入DNA合成仪，合成ZF-P，反应结束后经浓氨水切割，过OPC柱， HPLC分离纯化，离心抽干；或者将f)中载体7装入DNA合成仪，合成P-ZF，5)中合成的化合物6溶解，装入DNA合成仪反应，合成JG-P-ZF，反应结束后经浓氨水切割，过OPC柱，HPLC分离纯化，离心抽干。
7.根据权利要求6所述的一类寡核苷酸的合成工艺，在上述过程1)中，反应所使用的碱性化合物可以是无机碱性化合物CaO、MgO、Na2C03、NaHCO3> KOH、NaOH、K2CO3, KHCO3, KF其中之一，在2)中反应所使用的缩水剂为羰基二咪唑(⑶I)，N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)酯， N-羟基苯并三唑酯(HOBt)，二环己基碳二亚胺(DCC)，二异丙基碳二亚胺(DIC)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)，4-N，N-二甲基吡啶(DMAP)，4-G，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉氯化物(DMT-MM)中的一种或几种；在a)中反应所使用的缩水剂为羰基二咪唑，N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-羟基苯并三唑酯，二环己基碳二亚胺，二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺，4-N，N-二甲基吡啶，4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉氯化物中的一种或几种。
8.根据权利要求6，在上述各步反应中，所用有机溶剂为乙腈、丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基亚酰胺、二甲基亚砜、1，2-二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、和二氧六环其中之一； 重结晶所用溶剂为水、乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、石油醚中的一种或几种。
9.根据权利要求6，在e)中所使用的载体可以是通过固相或液相合成。
全文摘要
本发明涉及一种抗流感病毒寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是发现金刚乙胺或者脂肪链修饰靶向抗病毒的宿主靶标程序死亡蛋白5(PDCD5)抗流感病毒病毒(IV)反义寡核苷酸的结构，制备方法和用途。本实验室用化学合成的方法把金刚乙胺或者脂肪链偶联在筛选到的抗流感反义序列上，RS-HPLC发现反义序列的电负性和极性被降低，用荧光素标记的方法在A549细胞上证明了修饰促进了细胞对反义序列的摄取，在A549和MDCK细胞上发现修饰能够提高反义序列的抗甲型流感病毒H1N1、H3N2及金刚乙胺耐药株H3N2所致细胞病变的活性，因此，本发明涉及到用化学修饰的方法降低核酸类药物极性，提高核酸类药物的生物利用度、降低用药量、提高抗病毒疗效的新型核酸药物改进的方法。
文档编号C07H1/00GK102351932SQ20111018864
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者丁晓然, 刘娟, 周喆, 张京玉, 杨静, 王升启, 赵海豹, 钟芝茵, 鲁丹丹 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所