专利名称：拟南芥热激因子HSFA1d特异cDNA 片段的原核表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效表达拟南芥热激因子HSFAld 特异cDNA片段(Δ C j tHsfAld)的原核表达载体pET32a_ Δ C~A tHsfAld及其在制备 Δ C-AtHsfAld重组蛋白中的应用。
背景技术：
HsfAld是拟南芥热激转录因子(Hsf)家族成员之一。基于植物不同发育阶段、不同组织和不同胁迫条件诱导下mRNA水平Hsf表达谱的分析数据，植物Hsfs被认为能广泛的参与热、光照、臭氧、H2O2、盐、干旱、冷、损伤和病原菌侵害等多种胁迫应答，且不同的Hsf 成员可能受不同的胁迫条件所诱导、从而特异性地在不同的胁迫应答中发挥作用(Miller and Mittler, 2006; Pascal et al.，2006)。因此，通过对不同Hsf成员在不同诱导条件下，不同Hsf家族成员mRNA和蛋白质水平表达量的检测，有助于探知各Hsf的功能。拟南芥有包括HsfAld在内的21个热激转录因子家族成员，生物信息学的分析表明，它们具有相同的结构域组成，包括DNA结合域、寡聚域、核定位信号和C末端的激活域。 对HsfAld序列相似性的分析表明，HsfAld与拟南芥中其它Hsf成员在DNA和蛋白质结构上有较高的同源性。目前，有关逆境胁迫下HsfAld表达水平检测的研究，主要集中在mRNA 水平，未涉及HsfAld特异抗体的制备和蛋白质水平的表达特性分析。Yamada等为了验证 HsfAld在体外与热激转录元件HSE3的相互作用，将全长HsfAld与pET3h融合，成功的表达了全长HsfAld活性蛋白并检测到其在体外与HSE3的相互作用(Yamada et al. , 2007)。 但此蛋白并未用于HsfAld抗体制备，且它针对的是HsfAld的全长序列，未考虑特异性的因素，也不适合用于HsfAld特异抗体的制备和蛋白水平HsfAld的定量分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥热激因子HSFAld特异cDNA片段Δ C-AtHsfAld 的原核表达载体pET32a- Δ C-AtHsfAld,该载体含有Τ7启动子和终止子、一个由6个氨基酸组成的组氨酸标签His-Tag和HsfAld的cDNA特异性片段序列Δ Cli^i^i/； 其中Δ CM tHsfAld基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠Δ/片段的起始密码子上游是一个
由6个氨基酸组成的组氨酸标签序列His-Tag ；载体中的Δ CMiifei^i/基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaiiana,生态型 Col) HsfAld 的 cDNA，在 GenBank 中的登录号为 AT1G32330。利用该载体转化大肠杆菌BL21，可实现Δ C-A tHsfAld蛋白的高水平表达，且在BL21系统中表达可溶性的Δ C-AtHsfAld蛋白，通过HisTrap亲和柱和割胶纯化的 Δ C-AtHsfAld重组蛋白质，可用于HSFAld特异性抗体的制备。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案1、Δ C-AtHsfAld cDNA 片段的扩增
从GenBank中查找拟南芥21个HSF家族成员的蛋白质序列，通过Cluster XI. 0分析， 选取AtHsfAld蛋白质序列中特异性区段，即氨基酸332-氨基酸485。并将该特异区段命名为Δ C-AtHsfAld0从NCBI数据库获得Δ Cjiifei^i/蛋白区段对应的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物
Sense primer 5' CGGAATTCTCTGAGATACAGTCATCATCACC3'； Antisense primer 5' CCGCTCGAGTAGGATTTTGCCTTGAGAGAT 3'； 上游引物(Sense primer) 5，端添加EcoRI酶切位点，下游引物(Antisense primer) 5'端添加BioI酶切位点。以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，通过PCR扩增得到 Δ C-AtHsfAld 的 cDNA 片段。原核表达载体pET32a_ Δ C~A tHsfAld的构建
(1)回收并纯化ΔC-AtHsfAld的cDNA片段，并将其连接到TA克隆载体pMD18_T上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD18-T- Δ C-AtHsfAld ；
(2)EcoRI 和 XhoI 完全酶切 pMD18_T_ Δ C-AtHsfAld 和 pET32a，并分别回收 Δ 和载体片段pET3h，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和酶切检测，获得原核表达载体pET32a- Δ C-AtHsfAld0重组Δ C-AtHsfAld蛋白原核表达条件的优化
用pET32a- Δ C质粒转化大肠杆菌BL21的感受态细胞，获得转化子菌落，用
IPTG进行诱导表达Δ C-AtHsfAld重组蛋白，并对表达时间、IPTG浓度和温度条件进行优化，确定重组蛋白的最优表达条件。实验结果显示所表达的Δ C-AtHsfAld重组蛋白分子量为50 kDa左右，该蛋白的最优表达条件为为0. 5mM IPTG于诱导他。SDS-PAGE分析确定Δ C-AtHsfAld重组蛋白以可溶性的形式存在于细菌细胞中。重组Δ C-AtHsfAld蛋白的纯化
用HisTrap亲和层析柱分离纯化可溶性Δ C-AtHSFAld重组蛋白，利用不同浓度咪唑洗脱(5mM，10 mM,20 mM,30 mM,40 mM,50 mM,70 mM，100 mM，150 mM,200 mM，300 mM，350 mM, 400 mM,500 mM)亲和层析柱，收集洗脱液。通过SDS-PAGE跑胶分析不同浓度咪唑洗脱液中的蛋白质，结果发现有一条杂带和Δ C-AtHSFAld重组蛋白带相距很近，无法通过亲和层析去除，因而通过HisTrap亲和之后的含有Δ C-AtHsfAld重组蛋白的洗脱溶液在SDS-PAGE 胶中分离后，通过割胶回收获得相对较纯的Δ C-AtHsfAld重组蛋白，可用于HsfAld特异抗体的制备。
图1是拟南芥热激因子他以似特异cDNA片段(Δ C-AtHsfAld)的扩增产物电泳图。A是Δ C-AtHsfAld的特异cDNA片段的电泳检测，以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，经 PCR 扩增得到Δ C-A tHsfAld 的 cDNA 片段，M =Maker ； 1-10 Δ C~A tHsfAld 的特异 cDNA 片段扩增带；11 用水做模板做负对照；
B 是割胶回收获得Δ C-AtHsfAlcI 的 cDNA 片段，M =Maker ；1 :Δ C-AtHsfAlcI 的 cDNA 片段。图2是Δ C-AtHsfAld的cDNA片段TA克隆策略图。
图 3 是 PMD18-T- Δ C~A tHsfAld 质粒电泳检测图。A 是 pMD18_T_ Δ C~A tHsfAld 质粒的菌落PCR检测，1-9 :pMD18-T- Δ C重组质粒；10 负对照；M =Maker ；
B是重组质粒pMD18-T- Δ C-AtHsfAid检EcoRI和XhoI (单)双酶切检测，1 =XhoI酶切；2 =EcoRI 酶切；3 =EcoRI 和 XhoI 双酶切；M =Maker0图4是Δ C-AtHsfAld原核表达载体构建策略图。图5是Δ C-AtHsfAld基因原核表达载体的电泳检测图。A是重组质粒 pET32a- Δ C-AtHsfAld的菌落PCR检测，M =Maker ； 1-9 挑取的单菌落；10 用水做模板做负对照；
B是重组质粒pET32a- Δ C-AtHsfAlcI的双酶切检测，M =Maker ；1 =EcoRI和XhoI双酶切 pET32a- Δ C-AtHsfAlcI0图6是Δ C-AtHsfAld重组蛋白原核表达条件的优化及表达形式的鉴定。A是Δ C-AtHsfAld重组蛋白表达条件的时间优化。M =Maker ； 1 :pET32a未用 IPTG 诱导；2 :pET32a 使用 IPTG 诱导；3 :pET32a- Δ C-AtHsfAld 未用 IPTG 诱导；4 ρΕΤ3^ι-Δ用 IPTG 诱导 2h;5: ρΕΤ3^ι-Δ C用 IPTG 诱导 4h;6: pET32a- Δ C-Ji他/At/用 IPTG 诱导 8h ；
B是Δ C-AtHsfAld重组蛋白表达条件的IPTG浓度和温度优化； C是Δ C-AtHsfAld重组蛋白表达形式的鉴定。图7是Δ C-AtHsfAld重组蛋白的亲和层析纯化SDS-PAGE检测图，采用利用不同咪唑浓度通过HisTrap亲和柱洗脱蛋白。图8是通过SDS-PAGE割胶回收纯化的Δ C-AtHsfAld重组蛋白，取150 mmol/L咪唑洗脱蛋白样品进行割胶回收。M =Maker ；1: Δ C-AtHsfAld重组蛋白。
具体实施例方式本实施例中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯，仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所用引物序列均在上海生工合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 拟南芥热激因子HsfAld特异性cDNA片段(Δ C-AtHsfAld)的制备与检测
从植物转录因子数据库(http://planttfdb. cbi.pku. edu. cn/xiehe/datf/ browsefamily. phpfamiIyname=HSF)下载拟南芥 21 个 Hsf 蛋白质的序列，运用 Cluster X 1. O进行序列相似性分析，结果表明HsfAla、HsfAlb和HsfAle等3个序列与HsfAld相似性最高。为进一步比较以上3个相似性高序列，对HsfAla、HsfAlb, HsfAle和HsfAld等4 个蛋白质的序列进行了比对，选择Ji他以A/ (AT1G32330)蛋白质序列中氨基酸332-氨基酸485的特异性肽段，即Δ C-AtHsfAld。从NCBI数据库获得Δ C-AtHsfAld肽段对应的 cDNA序列(Δ C-AtHsfAld)。Δ C-AtHsfAld的扩增策略见图2。依据从NCBI数据库获得 Δ C片段对应的cDNA序列，并针对该序列设计如下引物对
5Sense primer 5' CGGAATTCTCTGAGATACAGTCATCATCACC 3'；
Anti-sense primer 5' CCGCTCGAGTAGGATTTTGCCTTGAGAGAT 3'
上(Sense primer)、下(Anti-sense primer)游引物 5，端分别添加了 EcoRI 和 XhoI 酶切位点。以拟南芥第一链cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应混合液组成为Taq反应 10XBuffer, 2. 5μ , 50ng 的Δ C-AtHsfAld 特异性上下游引物(Sense primer 和 Anti-sense primer), 1. 6μ dNTP (2.5 mM),0. 1 μ 的 EX Taq DNA 聚合酶(5U/mL)，1· 5μ 拟南芥第一链cDNA，加ddH20使反应终体积为25 μ 。PCR反应条件为94°C加热3分钟，然后按照94°C、30秒，62°C、30秒，72°C、30s的程序进行31个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，得到Δ C-AtHsfAld片段的cDNA (图 1A)，割胶回收Δ C-AtHsfAlcim异 cDNA 片段(图 1B)。实施例2 Δ C j tHsfAld特异cDNA片段的TA克隆
回收得到的Δ C-AtHsfAld特异cDNA片段，用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒亚克隆到pMDlS-T (大连宝生物公司)载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态DH5 α (购自天根生化科技公司)，挑取单菌落进行菌落PCR检测，在PCR反应混合液中加入单菌落，50ng的特异性上下游引物(knse primer 和 Anti- sense primer), 1. 6μ dNTP (2.5 mM),0. 1 μ 的 Taq DNA 聚合酶(5U/mL)， IOXBuffer (2. 5μ )，加双蒸水使反应终体积为25ml。在PCR仪上于94°C加热3分钟，然后按照94°C、30秒，62°C、30秒，72°C、30秒的程序进行四个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳检测菌落是否是阳性转化子(图3A)。将检测正确的菌落，接种到5ml的带有氨苄抗性的LB中，37°C培养10 个小时左右。采用碱裂解法提取质粒DNA(pMD18-T- Δ C-AtHsfAid),重组质粒经EcoRI和 XhoI (单)双酶切后检测，检测正确的重组质粒带有约500bp大小的条带(图;3B)。测序分析证明重组质粒载体中插入的Δ Cj tHsfAld序列正确。实施例3 原核表达载体pET32a_ Δ C-AtHsfAld的构建
pET32a- Δ C构建策略如图4所示，用EcoRI和XhoI (均来自Fermentas)切
开纯化的原核表达质粒载体pET3h(购自Novagen公司)和pMD18_ Δ C j^s/Wi/，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收PET3M被切割后产生的载体片断(5. 9kb)及 pMD18- Δ Cj 他/Wi/被切割产生的Δ C-AtHsfAld 的 cDNA 片段(0. 5kb), 然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pET3h载体片断和Δ C产生原核
表达载体pET32a- Δ C-AtHsfAld0用连接反应混合物转化高效率(IO8)的大肠杆菌感受态细胞(DH5 α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄抗性(Amp，100 μ g/ml)的平板上，于37°C过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，挑取单菌落进行菌落PCR初步检测(图 5A)，将检测正确的菌落，接种到5ml的带有氨苄抗性的LB中，37°C培养10个小时左右。采用碱裂解法提取质粒DNA，重组质粒经EcoRI和BioI双酶切后检测，检测正确的重组质粒带有约500bp大小的条带(图5B)。实施例4 重组Δ C-AtHsfAld蛋白的表达与表达条件的优化
将pET32a- Δ C质粒转化大肠杆菌BL21的感受态细胞。首先进行时间的
优化挑取单菌落加入2mL LB (含有Amp 100mg/L)中，37°C过夜培养，转接过夜培养物到新的试管，每管2ml，37°C活化菌体浓度达OD6qq=O. 6-0. 8，分别加入1. OmM的IPTG于28°C诱导0，2h, 4h, 8h，12000 rpm离心30min收集每种处理的菌体，以washing buffer (10 mM Tris-HCl, pH7. 5)洗涤菌体，加入ΙΟΟμ 细菌蛋白裂解液并重悬菌体获得总蛋白，加入 25μ 5 X loading buffer,煮沸5min进行SDS-PAGE (图6A)。再次进行IPTG浓度和温度的优化对于IPTG浓度优化，采用温度是观！，诱导时间是8h，IPTG浓度分别为0. 5 mM IPTG 和ImM IPTG ；对于温度优化，采用ImM IPTG诱导，诱导时间是8h。温度分别为和37°C (图6B)。最终确定表达条件为0. 5mM IPTG，和诱导时间是他。在进行重组蛋白的大量表达时，挑取单菌落入1 L LB (含有Amp浓度为100 mg/ L)中，37°C培养至OD6tltl值约为0.6;加0.5 mM IPTG诱导后8 h，离心收集菌体，用10 mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)洗涤菌体2次，加入30mL蛋白抽提缓冲液(磷酸钠缓冲液(ρΗ 7. 4) 20 mM),悬浮菌体；在冰浴中超声波破碎(工作4秒，停10秒，功率30 W，全程30 min)大肠杆菌菌体细胞。于4°C离心(18000 rpm)离心半小时，得到上清和沉淀，取上清液与沉淀，加入 5XSDS-PAGE上样缓冲液，通过SDS-PAGE检测目标蛋白表达的形式。SDS-PAGE电泳结果明重组Δ C-AtHSFAld蛋白以可溶性的形式存在于上清液中。实施例5 重组Δ C-AtHsfAld蛋白的纯化
上清液过0. 23um滤膜，用亲和层析柱分离纯化可溶性Δ C-AtHsfAld重组蛋白。参看His-Trap HP说明书，首先用5柱体积纯水洗柱，用5柱平衡缓冲液(磷酸钠缓冲液 (ρΗ7. 4)20 mmol/L,5 mM咪唑)平衡柱子，然后上蛋白样品，用5柱体积浓度为5mM，10 mM, 20 mM,30 mM,40 mM,50 mM,70 mM,100 mM,150 mM,200 mM,300 mM,350 mM,400 mM,500 mM 的咪唑缓冲液(20 mM磷酸钠盐缓冲液，pH7. 4,0. 5mM NaCl，咪唑)进行梯度洗脱，收集洗脱液，每管4mL。最后用分别用5柱体积纯水和5柱体积20%乙醇洗柱。测定及各洗脱液中蛋白的浓度，用50ug跑SDS-PAGE检测蛋白的纯度(图7)。图7的数据说明Δ C-AtHsfAld 重组蛋白在100mM、150mM的咪唑缓冲液中被洗脱下来，但是含有一条杂带。采用割胶回收纯的Δ C-AtHsfAld重组蛋白，其中采用100mM、150mM的咪唑缓冲液上样，SDS-PAGE分离Δ C-AtHsfAld重组蛋白条带。方法如下(1)透析袋的预处理剪取适当长度(10-20cm)的透析袋(截留范围为8000-12000Da)；置于大体积的^)(W/V)碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA (pH8. 0)中，煮沸10分钟；蒸馏水彻底清洗透析袋；置于lmmol/L EDTA(pH8. 0)溶液中再次煮沸10分钟；冷却后4°C保存；(2)制胶将分离胶灌好后，直接灌上浓缩胶，不需要插梳子，在浓缩胶上留几厘米空间的加样；(3)将样品直接加到浓缩胶上，形成一个蓝色的样品带；(4)电泳时间一般池左右，浓缩胶时采用60V电压，分离胶时采用90V电压，电泳至溴酚蓝全部跑出胶外；(5)将分离胶取出，采用氯化钾(0. 25mol/L)进行染色15min; (6)染色结束之后，将Δ C-AtHsfAld重组蛋白带切下，再将胶切成小片状，装入透析袋；(7)将透析袋加入电泳缓冲液，放入电泳槽中。100V电压电泳4-5h，目的蛋白即电洗脱到透析袋的缓冲液中；(8)洗脱完毕，吸出透析袋内溶液，SDS-PAGE检测电泳结果， 鉴定正确的蛋白溶液装入干净的透析袋中，用预冷的IXPBS溶液于4°C下透析过夜，其间换透析液2-3次，最终获得纯的Δ C-AtHsfAld重组蛋白，可用于AtHsfAld抗体的制备。
权利要求
1.拟南芥热激因子HSFAld特异CDNA片段的原核表达载体，其特征在于该载体含有T7 启动子和终止子、细菌核糖体结合位点、一个由6个氨基酸组成的组氨酸标签和HsfAld特异 cDNA 片段序列Δ C-AtHsfAlcI0
2.根据权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于基因的上游有Τ7 启动子和细菌核糖体结合位点RBS，Τ7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠Δ C/基因片段的起始密码子上游是一个由6个氨基酸组成的组氨酸标签序列 His-Tag0
3.如权利要求1所述的原核表达载体，载体中的热激因子HSFAld特异cDNA片段来源于拟南芥，在GenBank中的登录号为AT1G32330。
4.权利要求1所述的原核表达载体在制备拟南芥热激因子HSFAld特异肽段重组蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达拟南芥热激因子HSFA1d特异cDNA片段(△C-AtHsfA1d)的原核表达载体pET32a--△C-AtHsfA1d及其应用。该载体是含有拟南芥热激因子HSFA1d特异cDNA片段的原核表达载体，本发明从拟南芥中扩增出HSFA1d特异cDNA片段△C-AtHsfA1d，用用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，表达的重组蛋白质以可溶性形式存在于上清中，通过HisTrap亲和柱和割胶纯化△C-AtHsfA1d重组蛋白质，用于HSFA1d特异抗体的制备。
文档编号C07K14/415GK102363789SQ20111030649
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者严金平, 张道君, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学