专利名称：戊型肝炎病毒抗原的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种戊型肝炎病毒(h印atitis E virus, HEV)抗原的制备方法，尤其涉及一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达重组戊型肝炎病毒空衣壳抗原的方法，本发明还涉及由该方法制备得到的抗原产品以及用该抗原制备预防或治疗戊型肝炎病毒的口服或注射用疫苗中的用途，属于戊型肝炎病毒抗原的制备领域。
背景技术：
戊型肝炎(h印atitis Ε,ΗΕ)是由戊型肝炎病毒引起的，经消化道传播的急性病毒性肝炎，临床主要表现为发热、厌食、恶心、呕吐、黄疸，，病程可持续1周。HE以在发展中国家的水源性暴发流行和发达国家的急性散发为特点，呈全球性分布，世界卫生组织认为HE 是发展中国家重要的公共卫生问题。戊型肝炎病以感染青壮年为主，在临床上多表现为暴发性肝炎，引起社会的恐慌，造成劳动力的损失，在孕妇中HE的死亡率可高达20% 30%。 目前，还没有针对HE的特效治疗方法，也没有特异性被动免疫和有效的免疫制剂可供预防，控制HE的关键依靠切断其传播途径为主的综合性预防措施。戊型肝炎病毒(h印atitis E virus, HEV)为无囊膜的单股正链RNA病毒，其呈球形，直径27 34nm，核衣壳呈二十面体立体对称，表面有锯齿状缺刻和突起。其基因组全长约为7. 51Λ，编码3个开放阅读框架(ORF) :0RF1、0RF2和0RF3。其中0RF2编码病毒的衣壳蛋白，是病毒抗原表位富集区域，诱导机体产生免疫反应；0RF3包含型特异性抗原表位，与特异性免疫反应有关。HEV可分为5个基因型(Gene type)，I型和II型仅发现于人，III 型和IV型为人兽共患，V型仅发现于禽类，能够感染人类的I IV型HEV彼此能很好地交叉保护，表明仅有1个血清型。在中国，HEV感染以基因I型和IV型为主，且部分地区以HEV IV型多见。迄今为止，戊型肝炎尚无特效的治疗方法，惟一可行的是预防。因此，戊型肝炎疫苗的研制受到国内外学者的广泛关注。由于HEV的组织细胞培养技术还没有成功，从而阻碍了 HEV灭活疫苗和减毒活疫苗的研制。目前主要是研制HEV基因重组蛋白疫苗、重组HEV 样颗粒疫苗和DNA疫苗等。随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达戊型肝炎病毒基因，可望达到大幅度提高戊型肝炎病毒抗原产量、降低生产成本的目的。动物疾病的免疫疫苗和治疗药物的研究和开发随着家蚕生物反应器的成熟也越来越受到重视。现有的采用基因工程的手段制备戊型肝炎病毒抗原的方法不同程度的存在着表达效率较低、生产成本高、所表达的抗原免疫活性低等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的同时表达多种戊型肝炎病毒抗原的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种制备戊型肝炎病毒抗原的方法，包括以下步骤将戊型肝炎病毒抗原基因或优化后的戊型肝炎病毒抗原基因分别克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到重组杆状病毒转移表达载体；将所构建的重组杆状病毒转移表达载体与杆状病毒DNA进行共转染，将戊型肝炎病毒抗原基因或优化的戊型肝炎病毒抗原基因分别转移到杆状病毒的基因组上获得重组杆状病毒；用重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞诱导重组戊型肝炎病毒抗原表达；收获并纯化所表达的重组戊型肝炎病毒抗原，即得。其中，所述的戊型肝炎病毒毒的抗原基因优选为戊型肝炎病毒空衣壳蛋白0RF2 基因(HEV-0RF2)，其核苷酸序列为SEQ ID NO 1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。为了进一步提高戊型肝炎病毒空衣壳抗原的表达效率并提高所表达的戊型肝炎病毒空衣壳抗原的免疫活性，本发明根据家蚕密码子偏好性对戊型肝炎病毒空衣壳蛋白基因HEV-0RF2原始序列(SEQ ID NO 1)进行优化，主要包括调整稀有密码子，采用家蚕偏好型密码子，调整GC含量及不宜峰以延长mRNA的半衰期，以及那些影响mRNA稳定性及其与核糖体结合的茎环结构；优化后的核苷酸序列(HEV-0RF2-N)为SEQ ID NO :3所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:4所示。所述的杆状病毒运载载体的表达盒优选由多角体蛋白启动子、plO启动子或ie-1 启动子与增强子所组合成的表达盒，例如，该杆状病毒运载载体可选自PBM034，pBM93, AcRP23-lacZ, AcRP6_SC，AcUffl-IacZ, BacPAK6, Bac to Pac, Bacmid, BlucBacII (pETL)， p2Bac, p2Blue, p89B310, pAc360, pAc373, pAcAB3, pAcAB4, PAcAS3, pAcC129, pAcC4, DZI, pAcGP67, pAcIEl, pAcJPl, pAcMLF2, pAcMLF7, pAcMLF8, pAcMPl, pAcMP2, pAcRP23, pAcRP25,pAcRW4,pAcsMAG,pAcUff1,pAcUW21,pAcUW2A,pAcUW2B,pAcUW3,pAcUW31,pAcUW41, pAcUW42，pAcUW43，pAcUW51，pAcVC2，pAcVC3，pAcYMl，pAcJcC5，pBac1，pBac2，pBlueBacIII， pBlueBacHis, pEV55, mXIV, pIEINeo, ρJVETL, pJVNhel, ρJVP10, pJVrsMAG, pMBac, pPIO, pPAKl, pPBac, pSHONEX 1. 1, pSYN XIV VI+, pSYNVI+wp, pSYNXIV VI-, pVL1391, pVL 1392， ρVL 1393，pVL941，pVL 945，pVL 985，pVTBac，pBM030，pUAC_5 或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，更优选为PVL1393状病毒运载载体。所述的杆状病毒优选自BmNPV，AcMNPV, ApNPV, HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV或SpltNPV，更优选为家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV_ZJ8。所述的重组杆状病毒优选为以下任意一种(1)用于表达戊型肝炎病毒0RF2全基因的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(HEV-0RF2) ； (2)用于表达优化后戊型肝炎病毒 0RF2-N的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV (HEV-0RF2-N)。所述的昆虫宿主选自包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕 (Philosamia cynthia ricim)(Dictyoploca japanica)(Philosamia cynthia pryeri)、昨香(Antheraea pernyi)、曰本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜娥(Trichoplusia ni)、tf军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、丰帛铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等；更优选为家蚕(Bombyx mori)。所述的感染是将重组杆状病毒感染昆虫细胞，或者将重组杆状病毒通过口食来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体，或者将重组杆状病毒透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选的，所述的感染是将重组家蚕杆状病毒穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹体，在感染 3-6天后收集含重组戊型肝炎病毒抗原蛋白的家蚕幼虫或蛹的体液或组织勻浆；其中，所述的蛹体优选为1-2天的早期嫩蛹。本发明采用基因重组技术，将来源于戊型肝炎病毒的不同基因构建到各种由启动子为多角体蛋白，Pl0，ie-l等及与增强子组合所驱动的杆状病毒表达所用表达盒的杆状病毒表达转移运载载体上，使戊型肝炎病毒抗原基因在多角体启动子、PlO启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外(in vivo/in vitro)重组，将戊型肝炎病毒主要抗原基因整合到杆状病毒的基因组上，得到重组杆状病毒；重组杆状病毒可通过经口食或透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为 1-2天的早期嫩蛹)，表达生产重组戊型肝炎病毒抗原。本发明的最优选的一个整体技术方案如下将戊型肝炎病毒空衣壳蛋白的原始序列HEV-0RF2(SEQ ID NO :1所示)或优化后的戊型肝炎病毒空衣壳蛋白0RF2基因HEV-0RF2-N(SEQ ID NO :3所示)分别克隆到杆状病毒运载载体pVL1393上，再通过体内重组将戊型肝炎病毒衣壳蛋白基因的原始序列(HEV-ORM)或密码子优化后的序列 (HEV-0RF2-N)分别转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJS的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，分别获得携带戊型肝炎病毒衣壳蛋白基因0RF2的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(HEV-0RF2)以及rBmNPV (HEV-0RF2-N)；再将所获的重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖 rBmNPV (HEV-0RF2)、rBmNPV (HEV-0RF2-N)；当 rBmNPV (HEV-0RF2)、rBmNPV (HEV-0RF2-N)在蚕体内复制时，HEV-0RF2及HEV-0RF2-N基因在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达， 并自我组装成为戊型肝炎病毒空衣壳抗原；在感染3-6天(最佳为5天，25°C饲养或保护温度)后收集含戊型肝炎病毒空衣壳抗原的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体勻浆)，经过辐射照射杀灭杆状病毒、将蛋白纯化后便得到安全、高效的戊型肝炎病毒空衣壳抗原，此抗原可直接用于制备预防戊型肝炎病毒病的注射用或口服疫苗。戊型肝炎病毒空衣壳抗原可以应用于特异诊断人体有否感染HEV病毒，还可很好用作诊断试剂。优化后的戊型肝炎病毒HEV-0RF2-N基因在家蚕中的基因表达产物的检测结果表明，HEV-0RF2-N基因在蚕血或蚕蛹中的表达量高比HEV-0RF2基因在家蚕中表达量高出2_3 倍，达到每克蛹体2-3毫克，在1观00倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。效价检测结果显示，由HEV-0RF2-N基因所表达的抗原制备的抗体在抗原蛋白浓度为10μ g/ml时抗体的效价可达1 3200。本发明还提供了一种用于预防或治疗戊型肝炎病毒病的疫苗，该疫苗由有效量的本发明方法所制备的戊型肝炎病毒空衣壳抗原与药学上可接受的载体或辅料组成；其中， 所述的载体或辅料可以是各种常用的佐剂、稀释剂或表面活性剂等；可以按照疫苗制剂中常用的方法将所述的疫苗制备成口服或注射用疫苗，这些制备方法均为本领域技术人员所
6习知。本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产戊型肝炎病毒抗原空衣壳颗粒，其生产成本显著低于传统的制备戊型肝炎病毒抗原方法(例如通过细胞繁殖病毒制备戊型肝炎病毒抗原)，无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于家蚕已经我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。本发明方法可以大幅度降低戊型肝炎病毒抗原空衣壳颗粒的生产成本，具有表达效率高、所表达的蛋白免疫活性高、生产成本低、可实现规模化生产等优点。
图1本发明方法所表达的重组戊型肝炎病毒空衣壳粒子的电镜观察结果。图2免疫电镜观察所表达的戊型肝炎病毒空衣壳粒子结果(样品40X稀释)。
具体实施例方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。试验材料1.大肠杆菌株E. coli DH5a购自Promega公司；克隆载体pEASY_T3购自全式金公司；克隆载体PMD18-T购自TaKaRa公司；原核表达载体pET48a+、受体菌E. coli TOPlO 和BL21(DE!3)均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；运载载体 PVL1393购自于hvitrogen公司；戊型肝炎病毒衣壳蛋白基因的原始序列HEV-0RF2是自发病动物病变组织中提取并克隆到载体上得到；密码子优化后的序列HEV-0RF2-N直接生物合成；家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJS由中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存(也可向中国科学院武汉病毒研究所或中国农业科学院蚕业研究所购买获得)；高表达家蚕品种JYl由中国农业科学院生物技术研究所保存(也可向中国科学院武汉病毒研究所或中国农业科学院蚕业研究所购买获得)。2.酶与试剂所用限制性内切酶和配套的缓冲液均购自Promega公司。 T4DNALigase及缓冲液为！Iomega公司产品。LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKafei公司。 foiaseA、dNIPs购自Sigma公司。各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech 公司产品。3. t it i式 M :bisacrylamide, acrylamide> IPTG、X-Gal _ 自 Promega 目； Tris, Ampicillin、Kanamycin, IPTG、SDS,尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N, N，N ‘， N ‘ -Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素 (Kanamycin)购自Sigma公司，细胞培养基TC-100购自GIBCO公司。琼脂糖为Sunbiotech 公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国0X0ID公司；0. 2um、0. 45um 滤器购自Gelmar^ciences公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司。琼脂粉为日本进口分装。Ni-NTA树脂、Proteinase K和胎牛血清购自hvitrogen公司。4.培养基大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl， pH7. 0)；家蚕细胞培养基为TC-100。
实施例1戊型肝炎病毒抗原的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验1.有关溶液和培养基的配制溶液I :50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)，10mmol/L EDTA。溶液II :0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS(现配现用)。溶液III IOOmL 体系，5mol/L 醋酸钾 80mL，冰乙酸 12mL，ddH208mL。TAE(50X) :242gTris 碱，57. ImL 冰乙酸，IOOmL 0. 5mol/L EDTA(ρΗ8· 0)，无菌水容至 1000mL。TER 溶液胰 RNAse(RNAse Α)溶解于 IOmM Tris-HCl U 5mMNaCl 中，配成 10mg/mL 的储存液_20°C冻存，用IXTE buffer稀释成20yg/mL的工作液4°C保存。PPt Buffer 异丙醇 22mL ；5mol/mL KAc ImL ；ddH202mLoIXTE buffer :10mmol/L Tris · Cl (ρΗ8· 0)，lmmol/L EDTA (ρΗ8· 0)，121 °C高温高压蒸汽灭菌20min后储存于4°C。溴化乙锭(EB)溶液母液将EB配成浓度为10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器储存
于室温即可。6mol/L NaI 将 0. 75g Na2SO3溶于 40mL ddH20 中，加入 45gNaI 并搅拌至完全溶解， 4°C储存。玻璃奶(Glassmilk)将IOg (100mg/mL，Sigma S-5631)的 Silica 溶于 IOOmL PBS 中，沉淀2h，弃上清，重复该步骤2 3次；2000g离心2min，将沉淀物溶于3mol/L的NaI 中，终浓度为100mg/mL，4°C下避光保存。New Wash 洗液Tris_HCl (pH 7. 4) 20mmol/L ；EDTA lmmol/L ；NaCl 1 OOmmo 1/L ；与等体积的无水乙醇配制而成。蛋白表达诱导物IPTG为lmol/L，超纯水配制后用0. 2mm滤器过滤除菌。蛋白上样缓冲液QX) :100mmol/L Tris-HCl (ρΗ6· 8)、200mmol/L 二硫苏糖醇 (DTT)、4% SDS,0. 2%溴酚蓝、10%甘油。30%丙烯酰胺溶液^g 丙烯酰胺，IgN, N'-亚甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL水，过
滤ο考马斯亮蓝染液0. 24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇水(1 l,v/v)和IOmL 冰乙酸中
脱色液90mL甲醇水(1 1，ν/ν)和IOmL冰乙酸。裂解缓冲液(ρΗ8.0) :50mmol/L Tris_Base、0. IM NaCl0包涵体洗涤液I (ρΗ8· 0) :20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaClU % TritonX-100。包涵体洗涤液II (pH8. 0) :20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaCl、2M 尿素包涵体蛋白溶解液(ρΗ8·0):20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaCl、8M 尿素II NTA-OBuffer :20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5MNaCl, 10% Glycerol, 8M Urea ；脲NTA-500Buffer:20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5MNaCl, 10% Glycerol, 8M UreaO. 5M Imidazole。Bradford 试剂为 Bio-Rad 公司 Protein Assay Dye-Reagent Concentrate。ELISA 所需试剂包被液(ρΗ9· 6) 1. 59g Na2CO3>2. 93g NaHCO3、ddH20 定容至 1L，保存于4°C;临用前配制封闭液，BSA溶于PBS中至终浓度为1%;洗涤液为含0. 05% Tween-20的PBS ；底物缓冲液为1. 84g Na2P04 ·12Η20、0· 51g柠檬酸、ddH20定容至IOOmL ；OPD显色液是4mg OPD溶于IOmL底物缓冲液，加15 μ L 30% H2O2，临用前配制；终止液为2mol/L H2SO40Western blotting试剂半干转电转膜缓冲液是14. 41g甘氨酸、12. Ilg Tris-Base,50ml 甲醇、ddH20 定容至 1L、4°C保存；IXPBS 加 Tween-20 至终浓度为 0. 1% 配成洗涤液；BSA溶于PBS中至终浓度为3%为封闭液；纯化的多克隆抗体用封闭液按 1 1000稀释；HRP标记的羊抗兔IgG抗体用封闭液按1 1000稀释；临用前配制DAB显色液，4mg DAB 溶于 IOmL IOOmmol/L ρΗ7· 5 的 Tris-Cl 中，力口 15 μ L 30% H2O20LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH值到7. 0 (固体培养基含1. 5%琼脂)。液体培养基中加入1. 5%琼脂粉，121°C高温高压蒸汽灭菌15min，在温度低于45°C且还未凝固时，加入相应抗生素溶液，混勻后倒入平板，为LB固体培养基4°C 保存备用。2戊型肝炎病毒空衣壳蛋白基因的原始序列HEV-0RF2的获得和载体构建2. 1病毒基因组的提取取感染戊型肝炎病毒小鼠，无菌解剖取肝组织中典型病灶部分，按常规方法研磨。 研磨后，用细胞培养液(MEM)制成1 5的悬液，并加适量的抗菌素，在室温下浸毒他或 4°C过夜，然后反复冻融几次，使细胞裂解。7500r/min离心5min，取上清液用于总RNA的提取。从戊型肝炎病毒病毒感染致死的小鼠肝脏组织中提取总RNA。将提取的总RNA用 PVL-HEV上游引物在AMV反转录酶的作用下，42°C反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板， 用特异性引物进行PCR扩增。2. 2设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出戊型肝炎病毒抗原蛋白0RF2全基因(SEQ ID NO :1)。
所设计的抗原蛋白基因的扩增引物为
ρVL-HEV 上游 5 ‘ A GGATCC AACATGAATAACATGTTCTTTTGCTCTG 3 ‘ BamH I酶切位点
ρVL-HEV 下游 5 ‘ A GATATCTCAATACTCCCGGGTTTTACCCACCTTCATTTTAAGAC 3 ‘
EcoRV酶切位点 PCR反应体系如下 表IPCR反应条件
权利要求
1.一种制备戊型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于，包括将戊型肝炎病毒抗原基因或优化后的戊型肝炎病毒抗原基因分别克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到重组杆状病毒转移表达载体；将所构建的重组杆状病毒转移表达载体与杆状病毒DNA进行共转染，将戊型肝炎病毒抗原基因或优化后的戊型肝炎病毒抗原基因分别转移到杆状病毒的基因组上获得重组杆状病毒；用重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞诱导重组戊型肝炎病毒抗原表达；收获并纯化所表达的重组戊型肝炎病毒抗原，即得。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的戊型肝炎病毒抗原基因为戊型肝炎病毒空衣壳蛋白0RF2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示；所述优化后的戊型肝炎病毒抗原基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:3所示。
3.按照权利要求1的方法，其特征在于所述的杆状病毒运载载体选自PBM034， pBM93, AcRP23-7acZ, AcRP6-SC, AcUffl-7acZ, BacPAK6, Bac to Pac, Bacmid, BlucBacII(pETL), p2Bac, p2Blue, p89B310, pAc360,pAc373, pAcAB3，pAcAB 4，PAcAS3, pAcC129，pAcC4，DZI, pAcGP67, pAcIEl, pAcJPl, pAcMLF2，pAcMLF 7，pAcMLF8, pAcMPl, pAcMP2, pAcRP23, pAcRP25, pAcRW4, pAcsMAG, pAcUffl, pAcUW21, pAcUW2A, pAcUW2B, pAcUW3, pAcUW31, pAcUW41, pAcUW42, pAcUW43, pAcUW51, pAcVC2, pAcVC3, pAcYMl, pAcJcC5, pBacl, pBac2, pBlueBacIII, pBlueBacHis, pEV55, mXIV, pIEINeo, pJVETL, pJVNhel, pJVPIO, pJVrsMAG, pMBac, pPIO, pPAKl, pPBac, pSHONEX 1. 1，pSYN XIV VI+, pSYNVI+wp, pSYNXIV VI-, pVL1391, ρVL 1392，ρVL 1393，pVL941, ρVL 945，ρVL 985， pVTBac, pBM030 或 pUAC-5。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的杆状病毒选自BmNPV， AcMNPV, ApNPV, HaNPV，HzNPV，LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV，SIMNPV, SeMNPV 或 SpltNPV ；优选的，所述杆状病毒为家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJS。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于将所构建的重组杆状病毒转移表达载体与家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJS DNA进行共转染，通过体内重组将戊型肝炎病毒空衣壳蛋白0RF2基因或优化后的戊型肝炎病毒空衣壳蛋白0RF2基因分别转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJS的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，获得重组杆状病毒 rBmNPV (HEV-0RF2)或rBmNPV (HEV-0RF2-N)。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的昆虫宿主选自家蚕 (Bombyx mori)，野香(Bombyx mandarina)，蓖麻香(Philosamia cynthia ricim)，樟 ^(Dictyoploca japanica), _ ^(Philosamia cynthia pryeri),丰乍 Antheraea pernyi)，日本昨香(Antheraea yamamai)，野天香(Antheraea polyphymus),苜猜尺蠖 (Atographa califorica)，荼尺蠖(Ectropis obliqua)，甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)， 斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis),秋粘虫(Spodoptera frugiperda)，粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni)，行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)，棉铃虫(Heliothis armigera)， 美国棉铃虫(Heliothis zea)，烟青虫(Heliothis assulta)，烟草夜蛾(Heliothis virescens)，东方粘虫(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)。
7.由权利要求1-6任何一项方法所制备得到的戊型肝炎病毒抗原。
8.一种预防或治疗戊型肝炎的疫苗，其特征在于由有效量的权利要求7所述的戊型CN 102392049 A_权禾丨J 要求书肝炎病毒抗原和药学上可接受的辅料组成。
9.优化后的戊型肝炎病毒空衣壳蛋白0RF2基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO:3 所示。
10.权利要求9所述的优化后的戊型肝炎病毒空衣壳蛋白0RF2基因在制备预防治疗或诊断戊型肝炎病毒疫苗或试剂中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种制备戊型肝炎病毒空衣壳抗原的方法，包括将戊型肝炎病毒抗原基因或优化后的戊型肝炎病毒抗原基因分别克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到重组杆状病毒转移表达载体；将其与杆状病毒DNA进行共转染，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；诱导重组戊型肝炎病毒抗原表达；收获并纯化所表达的重组抗原，即得。本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的表达戊型肝炎病毒抗原，所制备的抗原免疫活性高、安全性极高，可直接用于生产注射和口服疫苗用以免疫动物或人。本发明方法可大幅度降低戊型肝炎病毒抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。
文档编号C07K14/08GK102392049SQ201110326748
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者兰喜, 吴润, 张志芳, 易咏竹, 李志勇, 李轶女, 杨标, 柳纪省, 沈桂芳, 王国增, 王金辉, 舒惠国, 边大勇 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所, 中国农业科学院生物技术研究所