专利名称：一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种肽的制备，尤其是一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法。
背景技术：
降血压肽，又称为血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme, EC3.4. 15. 1，简称ACE)抑制肽，是从食物蛋白中分离出的一类具有显著降低血压功效的肽，通常为小分子肽。在众多降压物质中，降血压肽因其无毒副作用的降压功能成为活性肽研究的热点。从天然食物蛋白中分离的降血压肽，虽然降压效果不如合成药物那么强烈，但其具有安全性高，只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，不会有降压过度现象发生。现在已经从乳酪蛋白中的干酪素、乳清蛋白等；动植物蛋白中的鸡肉、明胶、猪肉、鸡蛋、荞麦、玉米、椰菜、大蒜等；鱼贝藻类蛋白中的沙丁鱼、金枪鱼、鳝鱼头、牡蛎、裙带菜等许多食品中分离出ACE抑制剂；国内的研究者还从中国传统的食品即墨老酒，豆腐乳中发现ACE抑制肽。现代医学研究证明，海参富含多糖、海参素、海参皂甙、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、 硒、锌、铁、碘、钙、超氧化物歧化酶(SOD)、硫酸软骨素等50多种对人体有益的营养成分。经实验测定，海参水解肽也具有一定的ACE抑制活性，是潜在的降血压物质。另外，海蜇种类多，数量大，在我国分布广，是海洋浮游动物群落的重要组成部分。海蛰体内含有较高的蛋白质及钙、磷、碘、铁等无机盐，素有“水产瑰宝”之美称，中医学认为，海蜇具有扩张血管，降血压之功效。另外，中国毛虾为我国特有种类，我国沿海均有分布，尤以渤海沿岸产量最多。 而毛虾中的氨基酸中含有与降血压肽结构有关的支链氨基酸和芳香族氨基酸，中国毛虾是降压物质提取的良好原料。另外，海带含有藻胶酸、昆布素，半乳聚糖等多糖类，海带氨酸、 谷氨酸、天门冬氨酸，脯氨酸等氨基酸，维生素B1、B2、C、P及胡萝卜素，碘、钾、钙等无机盐。 中医认为，海带具有软坚散结、消痰平喘、通行利水、祛脂降压等功效。现代医学研究表明， 从海带里提取出的褐藻氨酸和甘露醇具有降压作用。目前，国内关于降血压肽的研究主要集中在肽的分离纯化、结构鉴定和活性评价方面。如何确定最佳、优化的酶解条件及对降血压肽提高分离提取效率是一个亟待解决的技术问题。同时，目前，还未见有利用多种海洋生物制取复合降血压肽的研究报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法。该方法的原料选取科学、工艺合理、操作简便、可操作性强、分离提取效率高，易实现工业化生产。依照该方法制取所得的复合降血压肽，具有良好的降压功效。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法，其是选取海参、海蛰、海带和中国毛虾为原料，按重量百分比称取海参5 10%、 海蛰50 65%、海带10 25%和中国毛虾10 20%分别进行脱盐、软化处理；再分别经打浆后加入10 30倍的纯净水过胶体磨制成浆状物；浆状物加热灭除微生物；冷却后进行酶解处理，加热灭酶；冷却后离心去除不溶物，取上清液通过管式膜过滤脱除大分子；滤过液通过截留分子质量为3000DaltOn的有机膜分级，收集3000DaltOn以下的截留液；截留液纳滤浓缩脱盐，干燥，复配，得复合降血压肽。本发明选取海参、海蛰、海带和中国毛虾为原料，将每一原料分别经脱盐、软化处理，再分别经加水磨浆，加热灭除微生物；冷却后酶解，灭酶；离心，取上清液再分别经管滤、超滤、纳滤，干燥，复配，得复合降血压肽。本发明是科学合理的选取具有降压功能的海参、海蛰、海带和中国毛虾为原料，经过酶解、管滤、超滤、纳滤将具有ACE抑制活性的小分子肽分离出来，并保存了其完好的结构和有效的生物活性。实验表明，采用该工艺分离出的降血压肽成分复配后，经原发性高血压大鼠实验，能显著地降低大鼠舒张压。该方法中确定了最佳优化的酶解技术方案，所采用的管滤、超滤、纳滤分离提取技术，使其提取的效率高。 本发明的利用海洋生物制取复合降血压肽的方法工艺合理、操作简便、可操作性强，易实现工业化生产。
具体实施例方式一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法，其具体工艺步骤如下
a、原料的选取与处理选取海参、海蛰、海带和中国毛虾为原料，按重量百分比称取 海参5 10%、海蛰50 65%、海带10 25%和中国毛虾10 20%分别放入冷水中浸泡 Mh以上，去除盐分，洗净，捞出浙干水分，分别使用打浆机进行打浆处理，之后加入10 30 倍的纯净水采用胶体磨将物料细化处理，得海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物；
b、酶解将步骤(a)所得到的海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物加热至溶液中心温度为95 100°C，保持lOmin，灭除微生物；然后进行酶解处理，其中各浆状物酶解的条件为
将海参浆状物温度调节至50 55°C加入复合蛋白酶，其用量为海参重量的3 10%。， 酶解1 池后，加入风味蛋白酶，其用量为海参重量的2 10%。，酶解2 池，得海参酶解液；
将海蛰浆状物温度调节至35 40°C，调节pH值3 3. 5，加入胃蛋白酶，其用量为海蜇重量的2 5%。，酶解2 证后，调节温度为45 50°C，pH值为5 5. 5，加入木瓜蛋白酶，其用量为海蜇重量的4 8%。，酶解1 池，得海蜇酶解液；
将海带浆状物温度调节至45 55°C，加入纤维素酶、果胶酶和复合蛋白酶，酶解3 4h，得海带酶解液；其中，所述的纤维素酶的用量为海带重量的4 8%。、果胶酶的用量为海带重量的2 6%。、复合蛋白酶的用量为海带重量的3 10%。；
将中国毛虾浆状物温度调节至45 55°C，调节pH值为9. 5 10，加入碱性蛋白酶，其用量为中国毛虾重量的的3 7%。，酶解1 池后，调节pH值为6. 5 7，加入风味蛋白酶， 其用量为中国毛虾重量的2 10%。，酶解1 池，得中国毛虾酶解液；
c、灭酶将步骤(b)所得到的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、中国毛虾酶解液分别加热至溶液中心温度为95 100°C，保持lOmin，进行灭酶处理，然后冷却至4°C，静置过夜；
d、离心将步骤(c)得到的灭酶、冷却、静置的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、中国毛虾酶解液分别采用离心机离心去除不溶物，并收集上清液；
e、膜过滤将步骤(d)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾上清液分别通过管式膜过滤脱除大分子，其管膜滤过液再分别通过孔径大小为3000DaltOn的有机膜截留分级，收集 3000Dalton以下截留液；其3000DaltOn以下的截留液通过纳滤浓缩脱盐，得纳滤截留液；
f、干燥将步骤(e)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾纳滤截留液干燥，复配，制粉，得复合降血压肽。下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1
一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法，其具体工艺步骤如下
a、原料的选取与处理称取海参10kg、海蛰50kg、海带25kg和中国毛虾15kg为原料， 分别放入冷水中浸泡36h，去除盐分，洗净，捞出浙干水分，分别使用打浆机进行打浆处理， 之后加入20倍的纯净水采用胶体磨将物料细化处理，得海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物；
b、酶解将步骤(a)所得到的海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物加热至溶液中心温度为100°C，保持lOmin，灭除微生物；然后进行酶解处理，其中各浆状物酶解的条件为
将海参浆状物温度调节至加入复合蛋白酶90g，酶解Ih后，加入风味蛋白酶20g， 酶解池，得海参酶解液；其中复合蛋白水解酶可为市购的商品酶，如ftOtamex复合蛋白酶， 也可以自行配制，配制的复合蛋白水解酶中含有木瓜蛋白酶和淀粉酶。本实施例采用的是自行配制复合蛋白水解酶；
将海蛰浆状物温度调节至37°C，调节pH值3，加入胃蛋白酶250g，酶解池后，调节温度为50°C，pH值为5，加入木瓜蛋白酶200g，酶解池，得海蜇酶解液；
将海带浆状物温度调节至50°C，加入纤维素酶200g、果胶酶IOOg和复合蛋白酶250g， 酶解池，得海带酶解液；其中复合蛋白水解酶采用的是自行配制复合蛋白水解酶；
将中国毛虾浆状物温度调节至50°C，调节pH值为10，加入碱性蛋白酶75g，酶解1. 后，调节PH值为6. 5，加入风味蛋白酶150g，酶解1.证，得中国毛虾酶解液；
c、灭酶将步骤(b)所得到的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、中国毛虾酶解液分别加热至溶液中心温度为100°C，保持lOmin，进行灭酶处理，然后冷却至4°C，静置过夜；
d、离心将步骤(c)得到的灭酶、冷却、静置的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、 中国毛虾酶解液分别采用三足式离心机，控制转速2000 rpm，离心去除不溶物，并收集上清液；
e、膜过滤将步骤(d)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾上清液分别通过管式膜过滤脱除大分子，其管膜滤过液再分别通过孔径大小为3000DaltOn的有机膜截留分级，收集 3000Dalton以下截留液；其3000DaltOn以下的截留液通过纳滤浓缩脱盐，得纳滤截留液；
f、干燥将步骤(e)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾纳滤截留液喷雾干燥，复配，粉碎成粉，得复合降血压肽。实施例2
一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法，其具体工艺步骤如下
a、原料的选取与处理称取海参^g、海蛰65kg、海带IOkg和中国毛虾20kg为原料，分别放入冷水中浸泡48h，去除盐分，洗净，捞出浙干水分，分别使用打浆机进行打浆处理， 之后加入10倍的纯净水采用胶体磨将物料细化处理，得海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物；
b、酶解将步骤(a)所得到的海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物加热至溶液中心温度为95°C，保持lOmin，灭除微生物；然后进行酶解处理，其中各浆状物酶解的条件为
将海参浆状物温度调节至50°C加入复合蛋白酶25g，酶解池后，加入风味蛋白酶25g， 酶解2.证，得海参酶解液；其中复合蛋白水解酶可为市购的ftOtamex复合蛋白酶；
将海蛰浆状物温度调节至35°C，调节pH值3. 3，加入胃蛋白酶195g，酶解池后，调节温度为45°C，pH值为5. 5，加入木瓜蛋白酶325g，酶解池，得海蜇酶解液；
将海带浆状物温度调节至阳°C，加入纤维素酶40g、果胶酶60g和复合蛋白酶30g，酶解 4h，得海带酶解液；其中复合蛋白水解酶可为市购的ftOtamex复合蛋白酶；
将中国毛虾浆状物温度调节至45°C，调节pH值为9. 5，加入碱性蛋白酶140g，酶解池后，调节PH值为7，加入风味蛋白酶200g，酶解池，得中国毛虾酶解液；
c、灭酶将步骤(b)所得到的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、中国毛虾酶解液分别加热至溶液中心温度为98°C，保持lOmin，进行灭酶处理，然后冷却至4°C，静置过夜；
d、离心将步骤(c)得到的灭酶、冷却、静置的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、 中国毛虾酶解液分别采用管式离心机，控制转速2500 rpm，离心去除不溶物，并收集上清液；
e、膜过滤将步骤(d)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾上清液分别通过管式膜过滤脱除大分子，其管膜滤过液再分别通过孔径大小为3000DaltOn的有机膜截留分级，收集 3000Dalton以下截留液；其3000DaltOn以下的截留液通过纳滤浓缩脱盐，得纳滤截留液；
f、干燥将步骤(e)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾纳滤截留液喷雾干燥，复配，粉碎成粉，得复合降血压肽。 实施例3
一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法，其具体工艺步骤如下
a、原料的选取与处理称取海参^ig、海蛰60kg、海带22kg和中国毛虾IOkg为原料， 分别放入冷水中浸泡Mh，去除盐分，洗净，捞出浙干水分，分别使用打浆机进行打浆处理， 之后加入30倍的纯净水采用胶体磨将物料细化处理，得海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物；
b、酶解将步骤(a)所得到的海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物加热至溶液中心温度为100°C，保持lOmin，灭除微生物；然后进行酶解处理，其中各浆状物酶解的条件为
将海参浆状物温度调节至52°C加入复合蛋白酶Mg，酶解1. 后，加入风味蛋白酶 70g，酶解池，得海参酶解液；其中复合蛋白水解酶可为市购的ftOtamex复合蛋白酶；
将海蛰浆状物温度调节至40°C，调节pH值3. 5，加入胃蛋白酶120g，酶解3.证后，调节温度为48°C，pH值为5. 2，加入木瓜蛋白酶480g，酶解lh，得海蜇酶解液；
将海带浆状物温度调节至450C，加入纤维素酶132g、果胶酶44g和复合蛋白酶110g，酶解3.证，得海带酶解液；其中复合蛋白水解酶可为市购的ftOtamex复合蛋白酶；将中国毛虾浆状物温度调节至55°C，调节pH值为9. 5，加入碱性蛋白酶30g，酶解Ih 后，调节PH值为7，加入风味蛋白酶20g，酶解lh，得中国毛虾酶解液；
c、灭酶将步骤(b)所得到的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、中国毛虾酶解液分别加热至溶液中心温度为100°C，保持lOmin，进行灭酶处理，然后冷却至4°C，静置过夜；
d、离心将步骤(c)得到的灭酶、冷却、静置的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、 中国毛虾酶解液分别采用三足式离心机，控制转速3000 rpm，离心去除不溶物，并收集上清液；
e、膜过滤将步骤(d)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾上清液分别通过管式膜过滤脱除大分子，其管膜滤过液再分别通过孔径大小为3000DaltOn的有机膜截留分级，收集 3000Dalton以下截留液；其3000DaltOn以下的截留液通过纳滤浓缩脱盐，得纳滤截留液；
f、干燥将步骤(e)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾纳滤截留液喷雾干燥，复配，粉碎成粉，得复合降血压肽。下面以动物实验进一步说明本发明的降压效果。本动物实验是将55只SHR随机分为5组，空白对照组，样品低剂量组，中剂量组和高剂量组和阳性对照组，每组11只。空白对照组给予0.9%的生理盐水灌胃。低剂量组 给予样品水溶液以200 mg/kg · d剂量灌胃；中剂量组给予样品以400 mg/kg · d剂量灌胃；样品高剂量组给予样品水溶液以800 mg/kg ·(!剂量灌胃；阳性对照组给予卡托普利 0. 54 mg/kg ·(!剂量灌胃。连续给药5周。每周测定尾动脉收缩压一次，数据见附表。 附表SHR尾动脉收缩压的变化(Mean 士 SD，η = 11)
权利要求
1.一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法，其特征在于其是选取海参、海蛰、海带和中国毛虾为原料，按重量百分比称取海参5 10%、海蛰50 65%、海带10 25%和中国毛虾10 20%分别进行脱盐、软化处理；再分别经打浆后加入10 30倍的纯净水过胶体磨制成浆状物；浆状物加热灭除微生物；冷却后进行酶解处理，加热灭酶；冷却后离心去除不溶物，取上清液通过管式膜过滤脱除大分子；滤过液通过截留分子质量为3000DaltOn 的有机膜分级，收集3000DaltOn以下的截留液；截留液纳滤浓缩脱盐，干燥，复配，得复合降血压肽。
2.一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法，其特征在于其具体工艺步骤如下a、原料的选取与处理选取海参、海蛰、海带和中国毛虾为原料，按重量百分比称取 海参5 10%、海蛰50 65%、海带10 25%和中国毛虾10 20%分别放入冷水中浸泡 24h以上，去除盐分，洗净，捞出浙干水分，分别使用打浆机进行打浆处理，之后加入10 30 倍的纯净水采用胶体磨将物料细化处理，得海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物；b、酶解将步骤(a)所得到的海参浆状物、海蛰浆状物、海带浆状物和中国毛虾浆状物加热至溶液中心温度为95 100°C，保持lOmin，灭除微生物；然后进行酶解处理，其中各浆状物酶解的条件为将海参浆状物温度调节至50 55°C加入复合蛋白酶，其用量为海参重量的3 10%。， 酶解1 池后，加入风味蛋白酶，其用量为海参重量的2 10%。，酶解2 池，得海参酶解液；将海蛰浆状物温度调节至35 40°C，调节pH值3 3. 5，加入胃蛋白酶，其用量为海蜇重量的2 5%0，酶解2 釙后，调节温度为45 50°C，pH值为5 5. 5，加入木瓜蛋白酶，其用量为海蜇重量的4 8%。，酶解1 池，得海蜇酶解液；将海带浆状物温度调节至45 55°C，加入纤维素酶、果胶酶和复合蛋白酶，酶解3 4h，得海带酶解液；其中，所述的纤维素酶的用量为海带重量的4 8%。、果胶酶的用量为海带重量的2 6%。、复合蛋白酶的用量为海带重量的3 10%。；将中国毛虾浆状物温度调节至45 55°C，调节pH值为9. 5 10，加入碱性蛋白酶，其用量为中国毛虾重量的的3 7%。，酶解1 池后，调节pH值为6. 5 7，加入风味蛋白酶， 其用量为中国毛虾重量的2 10%。，酶解1 池，得中国毛虾酶解液；c、灭酶将步骤(b)所得到的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、中国毛虾酶解液分别加热至溶液中心温度为95 100°C，保持lOmin，进行灭酶处理，然后冷却至4°C，静置过夜；d、离心将步骤(c)得到的灭酶、冷却、静置的海参酶解液、海蜇酶解液、海带酶解液、 中国毛虾酶解液分别采用离心机离心去除不溶物，并收集上清液；e、膜过滤将步骤(d)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾上清液分别通过管式膜过滤脱除大分子，其管膜滤过液再分别通过孔径大小为3000DaltOn的有机膜截留分级，收集 3000Dalton以下截留液；其3000DaltOn以下的截留液通过纳滤浓缩脱盐，得纳滤截留液；f、干燥将步骤(e)得到的海参、海蜇、海带、中国毛虾纳滤截留液干燥，复配，制粉，得复合降血压肽。
全文摘要
本发明涉及一种利用海洋生物制取复合降血压肽的方法，其是按重量比称取海参5～10%、海蛰50～65%、海带10～25%和中国毛虾10～20%为原料，分别进行脱盐、软化处理；再分别经打浆后加水磨制成浆状物；加热灭除微生物；冷却后进行酶解处理，灭酶；冷却后离心，取上清液通过管式膜过滤脱除大分子；滤过液通过截留分子质量为3000Dalton的有机膜分级，收集3000Dalton以下的截留液纳滤浓缩脱盐，干燥，复配，得复合降血压肽。本发明的方法中确定了最佳优化的酶解技术方案，采用的管滤、超滤、纳滤分离提取技术，其提取效率高，所得的复合降血压肽降压效果显著。本发明的方法选料科学、工艺合理、操作简便、易实现工业化生产。
文档编号C07K1/34GK102409072SQ20111038472
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者刘新, 刘昌衡, 唐聚德, 孙永军, 张绵松, 王志伟, 胡炜, 袁文鹏 申请人:山东好当家海洋发展股份有限公司, 山东省科学院生物研究所