专利名称：一种血清白蛋白及其表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种血清白蛋白及其表达载体和构建。
背景技术：
白蛋白是细胞中营养价值较高的一种物质。组成白蛋白的氨基酸包括了所有受遗传密码控制的二十种氨基酸，其中包含有比较多的必需氨基酸，因此是机体各种代谢活动极为重要的氨基酸来源，例如滋养细胞的蛋白质约有1/3来自于在肝脏中合成的白蛋白。 白蛋白被合成后，几乎全部都被各种组织细胞消耗，用来合成具有特殊功能的另一类蛋白质。白蛋白离开血管系统后进入细胞内，被蛋白酶水解为各种多肽或氨基酸，再合成各种机体所需的蛋白质。进入细胞内的白蛋白一方面分解产生大量能量，供另一种蛋白质合成所需；另一方面又能够在同一时间提供各种氨基酸，作为其它蛋白质合成的必需原料，因此细胞能非常高效地利用白蛋白。白蛋白具有非常广泛的结合能力，如它既能够和许多内源性和外源性物质(脂肪酸、胆红素、乙酰胆碱、药物、染料及金属离子等)结合，也能同机体内各种大小的化合物结合，还能同难溶于水和溶于水的许多物质相结合，具有重要的生理意义和临床意义。通过铁氧化还原反应，亚铁血红素有获得促氧化剂的特性，而白蛋白则是一种比较高效的亚铁血红素结合蛋白。一旦它结合，促氧化剂特性就会被削弱，从而显示出抗氧化剂的作用。在临床上研究学者观察到白蛋白能促进手术后伤口的愈合，因而有人认为输注蛋白质可以起到损伤修复的功效，但是蛋白质进入人体后也是要被蛋白水解酶分解成各种氨基酸的，再在各种酶的作用下才能合成修复组织所需要的各种蛋白质，这个过程明显曲折而漫长，而且成本较高，因此这种观点会是不可取的。如果对患者直接注射氨基酸效果将更加直接且高效。另外有研究发现白蛋白可能通过加快新陈代谢速度，从而达到修复组织的目的。在临床上白蛋白主要用于补充体液，输血，治疗外伤休克，白血病，发烧，白蛋白过少症及成红细胞增多症等。血浆中含有两百多种蛋白，因此，从血浆中纯化分离高纯度的血清白蛋白，极具挑战性。目前，已有大量的白蛋白基因被克隆并实现表达，特别是牛血清白蛋白、人血清白蛋白等均在毕赤酵母系统中得到高效表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种源自梅花鹿(Cervus axis)的血清白蛋白，在毕赤酵母系统中得到高效表达。本发明还提供了该血清白蛋白的表达载体。本发明提供的一种血清白蛋白，为如下(a)或(b)所示的蛋白质
(a)其氨基酸序列如SEQNO. 1所示；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质且与(a)的蛋白质具有相同的功能。本发明还提供了一种表达上述的血清白蛋白的重组载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。本发明还提供了一种血清白蛋白的基因的克隆方法，所述血清白蛋白的基因的克隆步骤包括从梅花鹿肝脏中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用3’ RACE PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目的基因；目的基因的亚克隆， 取阳性克隆进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到血清白蛋白的基因。本发明还提供了一种血清白蛋白的表达，培养所述的宿主细胞，通过发酵诱导其表达，收获表达产物，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。本发明提供的一种血清白蛋白(D0F)，其重组DOF易被酶解为多肽或氨基酸等小分子物质，经免疫家兔制备的多克隆抗体与纯化的重组血清白蛋白能够特异性地结合；本发明提供的重组血清白蛋白能促进大鼠成骨样UMR-106细胞增值。发明详述
本发明分离的的血清白蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化血清白蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。血清白蛋白的纯度能用氨基酸序列分析。实施例之一，从梅花鹿鹿茸中分离出促成骨细胞增值的单一组分，经N端测序，N端氨基酸同牛、羊等的血清白蛋白氨基酸序列的N端有极高的同源性。本发明涉及从梅花鹿肝脏细胞中克隆的血清白蛋白DOF的编码序列。实施例之一，本发明提取梅花鹿肝脏细胞的总RNA，通过3’ RACE PCR等的方法克隆到编码DOF的全长序列。实施例之一中，所述编码序列包含如SEQ NO. 1所示的核酸序列，称之为D0F。实施例之一中，本领域常用的TA克隆，将所述编码序列为SEQ NO. 2中的核苷酸序列克隆至 PMD18-T进行测序，l-1752bp所示的核苷酸序列为DOF基因。本发明还涉及包含所述DOF编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施例之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明DOF编码序列经万⑶RI和Λ^ I双酶切后与 Eco RI和Λ^ I双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k_D0F。本发明还制备包含本发明DOF编码序列的细胞。实施例之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施例之一中，选用毕氏酵母GSl 15构建表达血清白蛋白DOF的重组细胞。本发明还提供了表达血清白蛋白DOF的方法，包括培养前述包含DOF编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施例之一中，本发明通过包含本发明DOF编码序列的酵母(例如毕氏酵母GS115) 发酵来生产D0F，并通过硫酸铵沉降、脱盐、离子交换层析和反向色谱柱纯化得到了电泳纯的目的蛋白。本发明的血清白蛋白，在毕赤酵母系统中得到高效表达，实现了血清白蛋白的生产产业化。本发明通过蛋白质分析、酶学分析、免疫原性分析和细胞实验分析，证明本发明的重组血清白蛋白DOF极易被胃酶、胰酶等降解为易被机体吸收的小分子多肽和氨基酸， 能有效促进成骨细胞增值。
图1血清白蛋白基因(DOF)在毕赤酵母质粒pPIC9K上的重组子结构图。图2重组血清白蛋白毕氏酵母表达发酵过程样品的SDS-PAGE图。图3经纯化的本发明重组血清白蛋白的分子量。图4重组血清白蛋白的琼脂扩散实验分析图。图5重组血清白蛋白经胃酶(a)和胰酶(b)酶解后的SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施例方式以下根据具体的实施例充分说明本发明。I实验材料和试剂 1.菌株和载体
大肠杆菌DH5a购自于Novagen公司，T载体pMD18 T vector购自于TAKAEA公司。毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9K均购自hvitrogen公司。2.酶类及其他生化试剂
限制性内切酶购自！^ermentas，DNA Maker、蛋白质Make、3 ’ RACE试剂盒等均购自 TAKARA公司，其他常规试剂购自中国上海生物工程有限公司。3.使用的培养基
LB培养基，YPD，YPAD, BMDY, BNNY, MM, MD培养基均参照Invitrogen毕氏酵母操作手
ππ
WJo4.方法
技术领域：
本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》(美国纽约州冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989)；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)(科学出版社，2008)；朱检等，生物化学实验[M](上海科学技术出版社，1995)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，百分比和份数按重量计算。如没有特别说明，本专利中所提及的蛋白质电泳均是指SDS-PAGE，实验参数为 12. 5%分离胶，5%浓缩胶；120V恒压电泳30min，然后再150V恒压电泳60min ；电泳胶用考
马斯亮蓝染色。本专利中所提及的核酸电泳、DNA电泳等均是指琼脂糖凝胶电泳，实验参数为1% 琼脂糖，120V恒压电泳30min，采用胶内EB (Ethidium Bromide，溴化乙锭)染色。实施例1从梅花鹿鹿茸中获得血清白蛋白组分(DOF)及其抗体制备 (1)鹿茸促成骨细胞生长因子的纯化
准确称取150mg的冻干鹿茸分溶于2 ml PBS缓冲液(50 mM pH6. 8,200 mM NaCl)中， 充分溶解；经12,000 rpm，4 °C，离心30 min ；取上清液，即为鹿茸提取液。将上述鹿茸提取液 2ml 上 S印hacryl S-200HR 凝胶色谱柱(Φ 1. 6 X 180cm)。先用 PBS (pH6. 8，IOmM)缓冲液洗脱平衡柱子，然后上样，继续用PBS冲洗，分部收集样品，进行体外细胞活性检测和蛋白质电泳分析。
收集凝胶过滤分离的活性峰样品，用于POROS 20QE (Φ2. 5X20cm)强阴离子交换柱的分离。先用0. OlM PBS, pH6. 8平衡缓冲液充分平衡；上样后流加平衡缓冲液以去掉未吸附组分；用同样的缓冲液含0. 3MNaCl的洗脱缓冲液阶段洗脱，流速为lml/min，时间为 15 min;最后以0.01MPBS，0. 5MNaCl, pH6. 8洗脱液进行洗脱。收集个部分样品进行体外细胞活性检测和蛋白质电泳分析。收集活性样品，经浓缩、脱盐、冻干，上样于经PBS (pH7. 0，20mM，加IOOmM Na2SO4) 缓冲液平衡的TSK 63000SW色谱柱，流速0. 5ml/min,收集冲洗峰1 ，经蛋白质电泳检测该组分已达到电泳纯，分子量大小约为67kDa。(2)鹿茸DOF组分N端序列的测定和分析
利用EDMAN降解法测得鹿茸纯化组分的1 的N端起始氨基酸序列为DHKSEIAHRFKDLGEDNFQGLVLIAFSQY。在NBCI网站的蛋白库中进行分析比较后，找到与此起始序列相似性高于90%以上分别源于羊、牛、鼠、称猴、马和人的血清白蛋白序列，分别对它们进行相似性和同源性的比对，据此我们判定鹿茸中的纯化组分1 为血清白蛋白。(3)鹿茸DOF组分抗体的制备
6周龄家兔(购自福州吴氏实验动物中心)两只，在免疫前由耳动脉取血5ml，4°C静置过夜，6000rpm/min，离心5min，取血清，分装，-20°C保存。首次注射，取抗原(即上述纯化DOF 溶缩至2mg/ml)l. 5ml与等体积的弗氏完全佐剂混合彻底乳化，实验组兔子注射2ml抗原乳剂，在其背脊两侧分十处注射。其中对照组兔子以灭菌的生理盐水为抗原；首次免疫后每间隔3周分别进行第2次、第3次和第4次免疫，并在每次免疫前采集2ml血液，经处理，取血清，分装，_20°C保存；第4次免疫一周后，耳动脉大量采血，4°C静置过夜，6000rpm/min离心 5min，取血清，分装，-20°C保存。用包被缓冲液将已知抗原(纯化的DOF稀释至lOyg/ml，每孔加100 μ 1，最后一行加入ΙΟΟμ 1的包被缓冲液作为空白对照，4°C静置过夜；用洗涤液(PBS pH7. 4)洗涤3次，将板倒置于滤纸上吸去残余液体；每孔加入封闭液(0. 1% BSA) ΙΟΟμ 1，37°C Ih ； 用洗涤液洗涤3次，并将板扣干；将上述待测血清用样本稀释液(IOOmM pBNa pH6. 0)按 1:102，1:103，1:104，1:105，1:106，1:107 稀释后，每孔加 100μ 1，做复孔，37°C恒温 Ih ；用洗涤液洗涤4次，并将板扣干；二抗(辣根过氧化物酶标记二抗羊抗兔)用封闭液1:6000稀释，100μ 1/孔，37°C恒温Ih ；用洗涤液洗涤4次，并将板扣干；各孔中加入临时配置的TMB 底物溶液0. 1ml，室温避光显色15 20min;每孔加入终止液(浓硫酸)50 μ 1，于450nm 以空白对照孔调零后测各孔OD值。测定结果如表1，末次免疫后抗血清稀释100000倍时A45tlnm为0. 2095，故ELISA测得抗血清效价在1:100000以上，成功获得检测多克隆抗体。表1梅花鹿DOF的免疫血清测定吸光值
权利要求
1.一种血清白蛋白，为如下(a)或(b)所示的蛋白质(a)其氨基酸序列如SEQNO. 1所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质且与(a)的蛋白质具有相同的功能。
2.一种表达权利要求1所述的血清白蛋白的重组载体。
3.一种宿主细胞，其含有权利要求2所述的重组载体。
4.一种如权利要求1所述的血清白蛋白的基因的克隆方法，其特征在于所述血清白蛋白的基因的克隆步骤包括从梅花鹿肝脏中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用 3’ RACE PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目的基因；目的基因的亚克隆，取阳性克隆进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到血清白蛋白的基因。
5.一种如权利要求1所述的血清白蛋白的表达，其特征在于培养权利要求3或4所述的宿主细胞，通过发酵诱导其表达，收获表达产物，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种血清白蛋白及其表达载体，属于生物技术领域。本发明血清白蛋白，为如下(a)或(b)所示的蛋白质(a)其氨基酸序列如SEQNO.1所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质且与(a)的蛋白质具有相同的功能。本发明还提供了一种表达上述的血清白蛋白的重组载体。本发明提供一种血清白蛋白(DOF)易被酶解为多肽或氨基酸等小分子物质，经免疫家兔制备的多克隆抗体与纯化的重组血清白蛋白能够特异性地结合；本发明提供的重组血清白蛋白能促大鼠成骨样UMR-106细胞增值。
文档编号C07K14/765GK102399286SQ201110405289
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者叶秀云, 李仁宽, 林娟, 陈萍 申请人:福州大学