与百草枯抗性相关rna及其对应的蛋白、编码基因与应用的制作方法

专利名称：与百草枯抗性相关rna及其对应的蛋白、编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与百草枯抗性相关RNA及其对应的蛋白、编码基因与应用。
背景技术：
百草枯(paraquat,I, I ‘-dimethyl-4,4’-bipiridyl ;1,1 二甲基-4,4’-联批叮，分子量257.2)是一种非选择性的速效触杀型除草剂，它是继草甘磷之后的第二大除草齐U。百草枯被广泛应用于防除各种一年生杂草；对多年生杂草有强烈的杀伤作用，但其地下茎和根能萌出新枝；对已木质化的棕色茎和树干无影响。同时，百草枯还适用于防除果园、桑园、胶园及林带的杂草，也可用于防除非耕地、田埂、路边的杂草，对于玉米、甘蔗、大豆以及苗圃等宽行作物，可采取定向喷施百草枯来防除杂草。百草枯自上世纪六十年代由原英国卜内门化学工业有限公司(ICI)研究开发，迄今其在农业种植中的广泛应用已经有50多年的历史，目前在世界范围内有100多个国家使用百草枯。百草枯在1984年首次被引进中国市场，自上世纪90年代以来，随着农业生产技术的发展，我国很多农药企业先后开始大量生产百草枯原药，目前百草枯已经在我国的农业生产得到广泛应用。百草枯为速效触杀型灭生性季胺盐类除草剂，植物对其吸收极其迅速，叶片接触百草枯以后，有效成分对叶绿体层膜破坏力极强，使光合作用和叶绿素合成很快中止，叶片着药后2-3小时即开始受害变色，百草枯对单子叶和双子叶植物绿色组织均有很强的破坏作用。在光下生长的植物中，百草枯主要作用于其叶绿体，叶绿体含有绿色植物的光合系统，能吸收光能并制造糖分。百草枯作用于光系统I (photosystem I)的光合膜系统,该系统能产生自由电子以推动光合作用。光系统I产生的自由电子与百草枯离子发生反应，产生自由基结构。氧可以迅速将这些自由基还原，并在这一过程中产生过氧化物。产生的过氧化物具有极高的化学活性，它能攻击不饱和膜脂肪酸，迅速打开并分解细胞膜及组织。百草枯离子与自由基的反应过程中会反复产生更多的过氧化物，直至停止产生自由电子，植物将迅速枯萎死亡。因此，百草枯是光合作用的一种电子传递抑制剂。在光系统I中它还能竞争性地抑制NADP的还原，还原后的百草枯迅速再氧化产生一系列的超氧化物阴离子，活性氧自由基的毒害能引起脂质的过氧化反应和细胞膜的损伤。百草枯作为一个应用广泛的除草剂，人们在科学研究和农业生产过程中进行了很多抗除草剂植物的筛选并着手对抗除草剂基因进行克隆。1987年，人们首次在匈牙利抗莠去津的群体中发现了百草枯抗性植物小飞蓬(Conyza canadensis)，后来，有研究者在加拿大莴苣中也发现了只对百草枯有抗性的植株。Jinki Jo等人从人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)中分离克隆了一个抗百草枯的新基因(pqrA, GenBank:AAF86626.1),他们发现PqrA基因编码的蛋白对百草枯具有一定抗性。JinkiJo等人将pqrA基因转入烟草后，发现转基因烟草与野生型相比具有一定的百草枯抗性。PqrA蛋白是一种膜蛋白，PqrA多肽的亲水模式表明它与12个转 膜片段(TMS)家族输出蛋白具有很高的同源性，是典型的Na+/drug反转运体家族成员，负责多种毒物的转运，确保耐性细胞对有毒化合物的抑制作用。2003年,Nefedova等在蓝细菌(Synechocystis sp.)PCC 6803野生型菌株和对百草枯抗性突变体Prq20菌株中进行了 prqA和mvrA基因的插入失活实验,首次阐明转运体在光合微生物中参与了对百草枯的抗性。通过细菌和动物中的研究，目前认为百草枯能通过腐胺、氨基酸阳离子转运体转运。Soar等人 通过研究认为百草枯在金盖花(Arctotheca calendula)体内的转运与百草枯导致伤害紧密相关，并能诱导百草枯抗性的产生。他们通过在施用百草枯时添加一些多胺，能减少百草枯的毒性；应用多胺，腐胺，尸胺和亚精胺检测，在敏感植物中，百草枯的转运由于多胺的存在竞争性地抑制了百草枯的吸收。多胺、亚精胺和尸胺有效地减少了百草枯在金盏花敏感植株中的转运，抗性植株比敏感植株含有较高的亚精胺水平，因此推测多胺或者多胺转运体参与百草枯的抗性形成。但到目前为止，还没有在植物中发现可以转运百草枯的植物蛋白。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种与百草枯抗性相关RNA。本发明提供的RNA，包括正向RNA和反向RNA ；所述反向RNA是所述正向RNA的反向互补；所述正向RNA为蛋白A的编码基因中的200-500bp的DNA转录得到的RNA ；所述蛋白A的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述RNA中，所述蛋白A的编码基因中的200_500bp的DNA为所述蛋白A的编码基因中包括5’ UTR区或3’ UTR区中任意200-500bp的DNA ；上述蛋白A的编码基因的核昔酸序列为序列表中的序列I ;所述5’ UTR区为序列表中的序列I自5’末端第1-215位核苷酸；所述3’ UTR区为序列表中的序列I自5’末端第1704-1953位核苷酸；所述蛋白A的编码基因的开放阅读框为序列表中的序列I自5’末端第216-1703位核苷酸。上述正向RNA具体为序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸。其中，序列I自5’末端第1661-1922位核苷酸翻译出序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸。上述RNA由所述正向RNA、linker和所述反向RNA组成；上述RNA具体为如下I) -4)中任--种RNA:I)序列表中的序列3所示的RNA ；2)序列表中的序列3自5’末端第11-637位所示的RNA ；3)在严格条件下与I)或2)限定的RNA序列杂交且具有相同功能的RNA分子；4)与I)或2)限定的RNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的RNA分子。其中，所述正向RNA的核苷酸序列为序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸；所述linker的核苷酸序列为序列表中序列3的自5’末端第274-374位核苷酸；所述反向RNA的核苷酸序列为序列表中序列3的自5’末端第375-637位核苷酸。
本发明的另一个目的是提供编码上述RNA的DNA分子。本发明提供的DNA分子，包括正向DNA和反向DNA ；所述反向DNA是所述正向DNA的反向互补；所述正向DNA为所述蛋白A的编码基因中的200_500bp的DNA。上述DNA分子中，所述正向DNA为所述蛋白A的编码基因的5’ UTR区或3’ UTR区中 200-500bp 的 DNA ；上述正向DNA为序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸。其中，序列I自5’末端第1661-1922位核苷酸为序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸。上述DNA分子由所述正向DNA、linker和所述反向DNA组成；上述DNA分子具体是如下I) -4)中任--种的DNA分子:I)序列表中序列4所示的DNA分子；2)序列表中的序列4自5’末端第11-637位所示的DNA ；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至 少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述严格条件为:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，
0.1 % SDS 和 I X SSC, v0.1 % SDS 各洗膜一次。其中，其中所述正向RNA的编码DNA的核苷酸序列为序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸；所述linker的编码DNA的核苷酸序列为序列表中序列4的自5’末端第274-374位核苷酸；所述反向RNA的编码DNA的核苷酸序列为序列表中序列4的自5’末端第375-637位核苷酸。含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。上述重组载体具体为将上述DNA分子插入pX7的XhoI和SpeI位点中得到的载体。本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明提供的方法，是将上述的DNA分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物对百草枯的抗性高于所述目的植物。在上述方法中，上述的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物中；在上述方法中，所述对百草枯的抗性体现在子叶变绿频率或植物生长状况；在上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，在本发明的实施例中具体的双子叶植物为拟南芥。蛋白A或其编码基因在作为RNA干扰靶点在培育对百草枯的抗性提高的转基因植物中的应用也是本发明保护的范围；或蛋白A或其编码基因在植物对百草枯的抗性中的应用也是本发明保护的范围，其中该应用为是将所述基因导入目的植物中，得到植物对百草枯的抗性低于所述目的植物的转基因植物；所述对百草枯的抗性低于所述目的植物的转基因植物的效果通过增加子叶白化死亡率和/或降低植物存活率体现；所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物为拟南芥。本发明的第四个目的是提供一种蛋白A。本发明提供的蛋白A，是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对百草枯的抗性相关的由(a)衍生的蛋白质。上述蛋白A中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由495个氨基酸残基组成。编码上述蛋白A的基因也是本发明保护的范围；所述基因具体是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与⑴限定的DNA序列杂交且编码与植物对百草枯的抗性相关蛋白的DNA分子；(3)与⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物对百草枯的抗性相关蛋白的DNA分子。所述严格条件为:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由1953个核苷酸组成。本发明的实验证明，本发明发现了一个能够转运百草枯的转运体蛋白PARl (Paraquat Resistantl)，当在植物中缺失PARl基因时，突变体植物表现出对高浓度百草枯的抗性，同时在植物中过量表达PARl基因时，转基因植物表现出对百草枯的敏感性，因此，本发明提供了一段RNA，将其导入野生型拟南芥，可以得到对百草枯高抗性的转基因拟南芥，本发明的研究为在农业生产中培育抗百草枯的作物新品种提供了一个理想的靶点基因，具有很广阔的应用前景。


图1为pari突变体的遗传筛选图2为pari突变体对百草枯抗性分析图3为PARl基因的图位克隆图4为PARl基因的验证图5为PARl基因的过量表达分析图6为土中生长的植物对百草枯的敏感性分析图7为RNA干扰转基因植物的表型分析
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、PARl基因的获得及其功能鉴定一、PARl基因的发现1、pari突变体的遗传筛选百草枯是一种非选择性除草剂，百草枯能够作用于叶绿体的光合系统I，并且能够导致超氧自由基的广生。为了便于大规模的遗传筛选，采用了种子在含百草枯的培养基上光下萌发的方法。通过实验发现，百草枯对野生型拟南芥种子的萌发呈现出剂量依赖的抑制效应。在低浓度下，例如在0.5 μ M百草枯培养基上，野生型拟南芥种子仍能萌发并且子叶变绿，但其生长明显滞后；随着百草枯浓度的升高，种子甚至不能萌发(在大于2μΜ的条件下)，即使萌发但子叶关闭或白化，另外根的生长也受到很大影响。百草枯能以剂量依赖的方式很强地抑制种子的生长和发育，百草枯这种特性为筛选百草枯抗性突变体提供了便利。对Col-O生态型的拟南芥甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate, EMS)诱变的M2群体进行筛选。为了减少假阳性同时又不漏筛抗性稍弱的突变体，用了 2.5μ M百草枯作为筛选浓度。从1，5000个Col-O生态型的M2株系中，第一轮筛选获得了 14个候选突变体，第二轮确证了2个突变体pari和par4。这些突变体对百草枯的抗性强度存在差异。但它们在正常生长条件下与野生型相比在形态上没有显而易见地变化。将其中抗性最强的一个突变体命名为pari突变体(图1，其中，上排左边植物为pari突变体，下排为其相应亲本，在2μ M百草枯培养基上生长10天的情况，Col-O为野生型拟南芥)。2、pari突变体对百草枯抗性分析pari突变体在正常生长条件下与野生型拟南芥相比没有明显的差异(图2，A为在MS培养基上生长7天的幼苗(左Col-Ο，右pari)，但在百草枯培养基上表现出了极强的萌发抗性(图2，B为在含3μ M百草枯的MS培养基上生长7天的幼苗(左Col-Ο，右pari))和生长优势(图2，C为在含1.5μ M百草枯的MS培养基上生长21天的植株(左Col_0，右pari))，当转移MS培养基上生长的pari和对照Col-O到含有百草枯的培养基上，对照Col-O新叶和靠近培养基的老叶黄化死亡，但pari仍具有旺盛的生长势(图2，D为在MS培养基上生长10天的幼苗转移到含3 μ M百草枯的MS培养基上再生长2周的情况(仍为绿色的是Parl，已黄化的是Col-Ο))，另外百草枯严重抑制了对照Col-O主根的伸长和侧根的生成，但对pari的抑制是削弱的，仍有大量侧根生成。以上结果表明无论在种子萌发还是在种苗生长时期，pari均具有较强的百草枯抗性，并且pari突变没有影响到植物的正常生长发育。3、PAR1基因的图位克隆pari突变体与拟南芥Ler生态型进行杂交得到Fl代种子，自交之后用F2群体进行定位分析。把F2群体播种于含有百草枯的培养基上挑选抗性植株首先用BSA的方法进行初步定位，结果把PARl位点初步定位于第I号染色体的上臂两个SSLP分子标记CIW12和CIffl之间，距离CIW12 16.67cM, CIffl 17.9cM，这与CIW12和CIffl之间的遗传距离33cM相似(图3A)。为了精细定位，又设计了新的InDel和CAP标记，通过对2365个F2群体的抗性植株进行分析，发现在InDel标记T8E3处有19重组事件，在CAP标记T12021处有11个重组事件，两个标记之间的物理距离大约为215Kb，预测有52个开放阅读框。经过测序发现，基因Atlg31830的第1081位核苷酸由鸟苷酸(G)突变成了腺苷酸(A)，结果导致其编码蛋白的第361位氨基酸由苷氨酸(G)突变成了精氨酸(R)(图3，B)。通过上述研究，认为Atlg31830是pari突变体的相关候选基因，命名为PARl。通过氨基酸的序列比对，发现PARl蛋白中的第361位的苷氨酸在其同源蛋白中都具有很高的保守性(图3，B)。4、PARl基因的验证为了验证侯选基因的真实性，从美国拟南芥生物资源中心(The ArabidopsisBiological Resource Center, ABRC)买来 Atlg31830 基因的两个 T-DNA 插入突变体Salkll9707和Salkl29045。为了研究方便，分别将之前的pari突变体命名为parl_l，将Salkl 19707 和 Salkl29045 分别命名为 parl-2 和 parl-3，在 parl-2 和 parl-3 突变体中，由于T-DNA插入到了该基因的内部，造成了目的基因不能正常转录，是目的基因的功能缺失突变体。分别提取parl-l、parl_2和par 1-3的RNA,反转录得到cDNA,通过RT-PCR,分别以引物 Fl (5 ‘-ACCATACACTTCCAAAGGCTTTGT-3，)和 B2 (5 ‘-CCATCATCATCATCGTAAAGATTA-3，(parl-Ι突变体中，因为是点突变，所以转录本是存在的，有扩增产物。而由于T-DNA插入造成的parl-2和parl-3突变体，转录本是被破坏的，所以没有扩增产物)检测了 Atlg31830分别在parl-1, parl-2和parl-3中的转录水平的表达,结果发现Atlg31830在两个T-DNA插入突变体中的转录本均被破坏(图4,A)。分别将parl-1, parl-2和parl-3播种在含有I μ M百草枯的MS培养基上,结果发现parl-2和parl_3与parl-Ι —样具有明显的抗百草枯的表型(体现在没有白化子叶，且根长没有变短，图4，B)。又分别将parl-Ι和parl-2，parl-1和parl-3做了杂交，结果Fl代植物在含有I μ M百草枯的培养基上表现出与parl-1一样的抗性(图4，C和D)，因此可以肯定Atlg31830就是PARl基因。二、PARl基因的获得及其功能鉴定1、PAR1基因的克隆野生型拟南芥(Arabidopsis`thaliana, Columbia, Col-Ο)生态型，购自美国拟南芥生物资源中心(The Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC),产品编号为CS28166。提取野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia, Col-Ο)生态型的基因组DNA作为模板，利用分别引入XhoI和SmaI酶切位点的引物F3(5 ‘-AACTCGAGctggatgacgttATGCAGAAGCGG-3，)和 B3(5 ‘-tgcccgggACGTATTAGAGTTTCTTCGTATTC-3’)进行 PCR 扩增，于 58 °C 退火，扩增得到的1522bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列I所示的核苷酸，该PCR的基因命名为PAR1，该基因编码的蛋白命名为PAR1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述蛋白的编码基因的5’ UTR区为序列表中的序列I自5’末端第1-215位核苷酸；所述蛋白的编码基因的3’ UTR区为序列表中的序列I自5’末端第1704-1953位核苷酸；所述蛋白的编码基因的开放阅读框为序列表中的序列I自5’末端第216-1703位核苷酸。2、PARl基因的功能研究I)构建PARl基因过量表达的重组表达载体将上述I得到的PCR产物经过XhoI和SmaI酶切得到酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切得到的pBluescript SK载体片段(可购自默克公司，产品目录号为ST212205)连接，得到连接产物，连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列I插入载体pBluescript SK的XhoI和SmaI酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为SK-PARl。将SK-PARl载体用的XhoI和SpeI酶切位点进行酶切，回收酶切片段作为连接片段，同时以XhoI和SpeI双酶切植物诱导表达载体pBA002 (记载在A GFP-mouse talinfusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actincytoskeleton in growing pollen tubes, Benedikt Kost, Pius Spielhofer, Nam-HaiChua, The Plant Journal，16 (3)，393-401，1998，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，得到载体骨架，用T4DNA连接酶连接片段和载体骨架，连接产物转化大肠杆菌，得到克隆，在含有50毫克/升壮观酶素的LB平板上37度培养16小时，最后筛选得到具有抗壮观酶素抗性的克隆，提取该克隆的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列I插入PBA002的XhoI和SpeI酶切位点间得到的质粒，该质粒命名为pBA-PARl。2)、转pBA-PARl拟南芥的获得将上述获得的pBA-PARl转化农杆菌GV3101(购自Biovector C0.，LTD，产品货号:Biovector-375)，然后用花侵染转化方法转化野生型拟南芥Col-O (购自美国拟南芥生物资源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC,产品编号为 CS28166,以下简称野生型拟南芥)的花序，通过除草剂Basta (50mg/L)筛选出30株Tl代转pBA-PARl拟南芥，经过自交，得到600株T2代转pBA-PARl拟南芥。3)、转pBA-PARl拟南芥的鉴定分别将编号为#3和#6的T2代转pBA-PARl拟南芥的种子播种后在MS培养基(1/2MS，1%蔗糖，0.8%琼脂)(其中，MS盐、琼脂和蔗糖购自北京西美杰科技有限公司，产品货号M531、A7848和S391，)上22度24小时光照培养10天，提取全苗的RNA，反转录获得。0嫩，用引物卩1(5 ‘-ACCATACACTTCCAAAGGCTTTGT-3’)和 B2 (5 ‘-CCATCATCATCATCGTAAAGATTA-3’)进行RT-PCR，检测了 PARl基因在T2代转基因植物中的表达水平，以野生型拟南芥和 parl-2 突变体(The Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC, Salkl 19707)为对照，以 Actin7 为内参，内参的引物为 ACTIN7F:5 ‘-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3’ 和ACTIN7B:5‘-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3’。结果如图 5A 所示，为 RT-PCR 技术检测 PARl基因的表达水平，从图中看出，与野生型拟南芥相比，编号为#3 (0E#3)和#6(0E#6)的T2代转pBA-PARl拟南芥中PARl基因的表达水平均具有不同程度地升高，而parl-2突变体没有表达，说明编号为#3和#6的T2代转pBA-PARl拟南芥为阳性的过表达拟南芥。4)、转pBA-PARl拟南芥在培养基中对百草枯的敏感性分析分别将野生型拟南芥、编号为#3和#6的T2代转pBA-PARl拟南芥种子播种在含有0.5μ M百草枯的1/2MS培养基(1/2MS配方同上)上生长(22度，24小时光照)一周。每个株系50株，实验重复三次，用子叶白化死亡率(子叶白化率是最直观也最明显的表型，可以代表植物对百草枯的敏感性)来定量体现对百草枯的敏感性。结果如图5Β所示，发现与野生型相比，编号为#3和#6的Τ2代转PARl拟南芥对百草枯的敏感性增强，表现为植物的子叶白化死亡。在0.5μ M百草 枯的培养基上生长一周后，野生型拟南芥的子叶白化死亡率为4% ；编号为#3和#6的T2代转PARl拟南芥的子叶白化死亡率分别为90%和86.5%。5)、转pBA-PARl拟南芥在土中对百草枯的敏感性分析通过前面的系列研究，可以确定PARl是一个与植物抗百草枯密切相关的蛋白，为了以后通过生物技术来利用PARl作为靶点基因产生抗除草剂的植物新品种，首先在模式植物拟南芥中进行了实验。分别将野生型拟南芥(Col-0)、pari突变体parl_l (该突变体是在上述一中筛选得到的)，parl-2、parl-3和编号为#3、#6的T2代转pBA-PARl拟南芥种子播种在含有蛭石的营养钵中，待植物生长到6周左右时，对植物喷施10毫升的2μΜ(低浓度)百草枯和20 μ M(高浓度)百草枯(相当于5mg/L，溶剂为水，百草枯购自美国Sigma公司，货号为36541)，在喷施后7天分别观察结果。以喷施等量的水为对照。每个株系10株。以植物的存活率来代表植物对百草枯的反应。结果如图6所示,对照中野生型(Col-O)、parl突变体(parl-l,parl_2和parl_3)和编号为#3、#6的T2代转pBA-PARl拟南芥生长无显著差异。在低浓度(2μΜ)百草枯条件下，编号为#3、#6的Τ2代转pBA-PARl拟南芥基本萎蔫死亡，野生型植物少部分死亡，而突变体植物大多生长良好。

在高浓度(20 μ Μ)百草枯条件下，野生型和编号为#3、#6的Τ2代转pBA_PARl拟南芥全部死亡，而仅有突变体parl-Ι和parl-2还有存活。以植物的存活率来代表植物对百草枯的反应。统计在喷施20μ M百草枯4天后的存活率，结果如下:野生型(Col-ο)在百草枯处理4天后的存活率为30% ；pari突变体(parl_l, parl_2和parl_3)在百草枯处理4天后的存活率都是100%。编号为#3、#6的T2代转PARl拟南芥在百草枯处理4天后的存活率分别为10%和 15%。实施例2、抑制PARl基因表达的RNA及其表达载体的获得高效的RNAi需要形成一个含有内含子的自我互补“发夹”RNA分子。RNAi载体的构建应该包含一个转录单位组成的一个靶基因的由内含子隔开的两个反向的拷贝，内含子为发卡提供了必需的茎环结构。因此，构建RNAi表达载体需要两个步骤完成，具体如下:其中，pX7是一个有雌二醇诱导的植物表达载体，记载在Applicationsof Chemical-1nducible Expression Systems in Functional Genomics andBiotechnology,Nam-Hai ChuaiMethods in Molecular Biology，323 (III)，329-342，2006，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)。以野生型拟南芥为模板，用引物PARlRNAiFlaaggatccgtcgacTCAACAGCAGACTCGGGAATA(包含 BamHI 和 SalI 酶切位点)和PARlRNAiBl aactgcagaagcttTTCAAATCGACAATGGCAAC(包含 PstI 和 HindIII 酶切位点)进行PCR扩增，得到PCR产物即为PARl基因的DNA片段。将上述得到的PCR产物经Sail、HindIII酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的 pSK-1nt 载体(Applications of Chemical-1nducible Expression Systemsin Functional Genomics and Biotechnology, Nam-Hai Chua, Methods in MolecularBiology，323 (III)，329-342，2006，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)连接，得到中间载体；再将上述得到的PCR产物经BamH1、PstI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的中间载体连接，得到pSK-1nt-PARl。将上述的pSK-1nt-PARl用XhoI和SpeI酶切，得到的649bp的酶切片段与经过同样酶切得到的PX7连接，得到重组质粒，转入大肠杆菌，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列4插入pX7的XhoI和SpeI位点间得到的载体。其中序列3自5’末端第11-273位核苷酸为正向的RNA，序列3自5’末端第375-637位核苷酸为反向的RNA;序列表中序列3的自5’末端第274-374位核苷酸为linker(RNA)；序列4自5’末端第11-273位核苷酸为正向的RNA的编码基因，序列4自5’末端第375-637位核苷酸为反向的RNA的编码基因；序列表中序列4的自5’末端第274-374位核苷酸为Iinker(DNA)；其中，序列I自5’末端第1661-1922位核苷酸翻译出序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸。其中，序列I自5’末端第1661-1922位核苷酸为序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸。实施例3、抑制PARl基因的表达使转基因植物获得对百草枯的抗性1、转pX7 -PARl拟南芥的获得将上述由实施例2获得的PX7-PAR1转化农杆菌GV3101，然后用常规转化方法转化野生型拟南芥Col-O的花序，通过潮霉素(50mg/L)筛选出20株Tl代转pBA-PARl拟南芥，经过自交，得到400株T2代转pBA-PARl拟南芥。2、转pX7-PARl拟南芥的鉴定分别将编号为#1、#2和#3的T2代转pX7_PARl拟南芥的种子播种后在MS培养基(1/2MS，1%蔗糖，0.8%琼脂)(其中，MS盐、琼脂和蔗糖购自北京西美杰科技有限公司，产品货号M531、A7848和S391，)上22度24小时光照培养7天，然后用20 μ M的雌激素(17-β-Estradiol, Sigma，产品货号E8875)诱导24小时，提取全苗的RNA，反转录获得第一链cDNA，然后用引物PARlqFl:TCTGTGCTGTTGTAGCACTCTCGT 和 PARlqBI:ATTCCCGAGTCTGCTGTTGAAGGT 进行荧光实时定量 RT-PCR (qRT-PCR)，检测了 PARl基因在T2代转基因植物中的表达水平，以野生型拟南芥为对照，以Actin7为内参，内参的引物为 ACTIN7F:5 ‘-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3’ 和 ACTIN7B:5 ‘-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3’。每个株系约10株，实验重复三次结果取平均值土标准差。结果如图7A所示，为qRT-PCR技术检测PARl基因的表达水平，从图中看出，野生型拟南芥(Col-O)的PARl基因的相对表达量为13.77 ± 1.21 ；编号为#1、#2和#3的T2代转pX7_PARl拟南芥的PARl基因的相对表达量分别为
5.63土 L 82，10.75±0.58 和 2.09土 L 03 ；
从上述可以看出，与野生型拟南芥(Col-O)相比，编号为#1、#2和#3的T2代转PX7-PAR1拟南芥中PARl基因的表达水平均具有不同程度地降低，其中，编号为#1,#2和#3转基因植物体内的PARl基因的转录水平分别降低到了野生植物体内的41 %，78%和15%，说明转PX7-PAR1拟南芥中的PARl的表达抑制，且编号为#1、#2和#3的T2代转pX7_PARl拟南芥为干扰了 PARl表达的阳性转基因植物。3、转pX7-PARl拟南芥的对百草枯抗性分析分别将野生型拟南芥Col-Ο、编号为#1、#2、#3和#4的T2代转pX7_PARl拟南芥种子播种在含有20 μ M的雌激素(17-β-Estradiol，Sigma，产品货号Ε8875)和Ι.ΟμΜ百草枯的1/2MS培养基(1/2MS配方同上)上生长(22度,24小时光照)一周。每个株系约30株，实验重复三次，用子叶变绿表示植物对百草枯的抗性(在1.0 μ M百草枯的培养基上，野生型植物的子叶萌发以后不能变绿，植物的生长明显被抑制；而对百草枯有抗性的植物的子叶则能正常变绿，植物可以很好地生长。子叶变绿是最直观也最明显的表型，可以代表植物对百草枯的抗性)来定量体现对百草枯的抗性。观察结果如图7Β所示，发现与野生型(Col-Ο)相比，编号为#1至#4的Τ2代转PX7-PAR1拟南芥对百草枯的抗性增强，表现为植物的子叶能正常变绿，植物可以正常生长。在1.0 μ M百草枯的培养基上生长一周后，野生型拟南芥的子叶变绿频率(叶变绿频率=子叶变绿的植物数目/植物总数)为5 %;编号为#1、#2、#3和#4的Τ2代转pX7-PARl拟南芥的子叶变绿频率分别为78%，65%，95%和85%。通过上述实验，通过生 物技术在植物体内抑制PARl基因的表达，可以使植物获得很好的百草枯抗性，而通过生物技术提高PARl基因在植物体内的表达，则可以增强植物对百草枯的敏感性。
权利要求
1.一种RNA，包括正向RNA和反向RNA ； 所述反向RNA是所述正向RNA的反向互补； 所述正向RNA为蛋白A的编码基因中的200-500bp的DNA转录得到的RNA ； 所述蛋白A的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于: 所述蛋白A的编码基因中的200-500bp的DNA为所述蛋白A的编码基因中包括5’UTR区或3’ UTR区的部分或者全部片段的200-500bp的DNA ； 所述蛋白A的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 所述5’ UTR区为序列表中的序列I自5’末端第1-215位核苷酸；所述3’ UTR区为序列表中的序列I自5’末端第1704-1953位核苷酸； 所述正向RNA具体为序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的RNA，其特征在于: 所述RNA由所述正向RNA、linker和所述反向RNA组成； 所述RNA具体为如下I)-4)中任--种RNA: 1)序列表中的序列3所示的RNA； 2)序列表中的序列3自5’末端第11 -637位所示的RNA； 3)在严格条件下与I)或2)限定的RNA序列杂交且具有相同功能的RNA分子； 4)与I)或2)限定的RNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的RNA分子。
4.一种编码权利要求1-3中任一所述RNA的DNA分子，包括正向DNA和反向DNA ； 所述反向DNA是所述正向DNA的反向互补； 所述正向DNA为所述蛋白A的编码基因中的200-500bp的DNA。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于:所述蛋白A的编码基因中的200-500bp的DNA为中包括5’ UTR区或3’ UTR区中任意200_500bp的DNA ； 所述正向DNA具体为序列表中序列4的自5’末端第11-273位核苷酸。
6.根据权利要求4或5所述的DNA分子，其特征在于: 所述DNA分子由所述正向DNA、linker和所述反向DNA组成； 所述DNA分子具体是如下I)-4)中任--种的DNA分子: 1)序列表中序列4所示的DNA分子； 2)序列表中的序列4自5’末端第11-637位所示的DNA； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
7.含有权利要求4-6中任一所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体具体为将权利要求4-6中任一所述DNA分子插入pX7中得到的载体。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求4-6中任一所述DNA分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物对百草枯的抗性高于所述目的植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:权利要求4-6中任一所述DNA分子通过权利要求7所述的重组载体导入目的植物中； 所述对百草枯的抗性体现在子叶变绿频率； 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物为拟南芥。
10.蛋白A或其编码基因在作为RNA干扰靶点在培育对百草枯的抗性提高的转基因植物中的应用； 或蛋白A或其编码基因在植物对百草枯的抗性中的应用； 或一种蛋白A，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对百草枯的抗性相关的由(a)衍生的蛋白质； 或编码上述蛋白A的基因，是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列I 所不的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物对百草枯的抗性相关蛋白的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物对百草枯的抗性相关蛋白的DNA分子。
全文摘要
本发明公开了一种与百草枯抗性相关RNA及其对应的蛋白、编码基因与应用。本发明提供的提供的RNA，包括正向RNA和与其反向互补的反向RNA；所述正向RNA的核苷酸序列为序列表中序列3的自5’末端第11-273位核苷酸；所述反向RNA的核苷酸序列为序列表中序列3的自5’末端第375-637位核苷酸。本发明的实验证明，本发明发现了一个能够转运百草枯的转运体蛋白PAR1(Paraquat Resistant1)，在农业生产中培育抗百草枯的作物新品种提供了一个理想的靶点基因，具有很广阔的应用前景。
文档编号C07K14/415GK103173439SQ20111043622
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者左建儒, 牟金叶, 安丰英, 付福友 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所