专利名称：负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域中的多肽技术及医学免疫学领域的疫苗技术，更具体的说，涉及一种新的重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗的制备。
背景技术：
肿瘤治疗仍是世界性的难题，传统的治疗方法难以解决肿瘤术后复发和转移， 1985年美国国家癌症中心把肿瘤生物治疗列入肿瘤治疗的第四大模式。近年来肿瘤疫苗发展迅速，尤其是树突状细胞(DC)疫苗被认为是最具发展前景的治疗技术。制备理想的肿瘤疫苗首先要选择合适的肿瘤抗原。Ki-67是在增殖细胞中表达的一种核抗原，与细胞的有丝分裂有关。Ki-67在多种肿瘤组织中高表达，使其已成为检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标。近年发现Ki-67表达与肿瘤的恶性程度及预后有关，在恶性肿瘤侵袭、转移过程中起重要作用，是肿瘤治疗新的靶点。鉴于Ki-67是一理想的肿瘤抗原，前期研究中我们运用BIMAS和SYFPEITHI抗原表位预测软件，对人Ki_67抗原片段的CTL表位综合评分，得出分值较高的7个Ki-67候选肽，通过T2结合实验证实，位于 Ki-67的280-288位置的LQGETQLLV多肽与HLA_A*0201分子具有高亲和力。用候选肽刺激HLA-A*0201阳性人外周血单个核细胞，通过检测IFN-Y分泌，证实该肽可以诱导特异性 CTL活化，免疫原性良好。在DC疫苗的设计过程中，佐剂的应用、抗原的免疫原性及抗原负载体系是影响疫苗疗效的重要参数。研究表明单纯抗原多肽的自身稳定性差，以及其与MHC I类分子的亲和力低是影响DC疫苗的重要因素，直接导致其不能有效激发特异性免疫应答。近年来gp96作为一种天然的免疫佐剂在肿瘤疫苗的研究中备受关注。 gp96 (glycoprotein 96，gp96)是热休克蛋白(heat shock protein, HSP)家族中研究和应用最广泛的一员，广泛存在于细胞内质网中。研究发现其在免疫反应中参与交叉激活，并起到佐剂作用。通过生化技术在体外观察到，与gp96结合的抗原肽可由抗原递呈细胞表面的通用受体CD91递呈给MHC I分子，并引起抗原肽特异性CTL活化；诱导DC细胞成熟；促进 T细胞、巨噬细胞和DC向肿瘤细胞浸润，刺激Thl细胞因子(IFN- y、TNF- α和IL-12)表达，以增加肿瘤细胞的免疫原性。2005 年 6 月，欧洲药品监管机构批准了 HSPPC-96 (Oncophage, Antigenics 公司) 应用于肾细胞癌治疗。HSPPC-96是自体肿瘤来源的gp96-抗原肽复合物合成制剂，它是用切除的癌组织制备而得。该制剂皮下注射可以使DC刺激NK细胞和T细胞，并引起记忆性免疫应答。目前正进行肾细胞癌和转移性黑色素瘤III期临床试验。虽然自体肿瘤组织来源的gp96-抗原肽复合物疫苗取得了明显的临床疗效，但在具体制备和应用过程中存在以下问题。首先gp96-肽复合物的纯化工序复杂、产量低，难以满足临床免疫治疗的需求，而且纯度和制剂保存方面存在许多难题；其次，肿瘤组织的获取、分离、纯化在一定程度上限制了疫苗的来源。
Blachere研究证实，在体内和体外组装形成的gp96多肽复合物均能被抗原递呈细胞摄取、加工，并通过MHC I类途径提呈给肿瘤特异性的CTL。
发明内容
本发明提供一种负载重组人gp96_Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗的制备方法。本发明的技术方案是一种负载重组人gp96_Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗的制备方法，以肿瘤普遍表达的Ki-67作为抗原，将人工合成的Ki-67抗原的CTL表位肽与重组人gp96肽体外结合，制备gp96抗原肽复合物；将此复合物与体外诱导的树突状细胞共孵育，从而获得负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗。该树突状细胞疫苗具有肿瘤治疗和预防复发作用。该树突状细胞疫苗的制备包括如下步骤(1)重组人 gp96 蛋白(rhGrp94)合成；(2)采用固相合成法制备Ki-67抗肿瘤CTL表位肽；(3)重组人gp96_Ki67抗原肽复合物的制备；(4)体外诱导树突状细胞；(5)重组人gp96_Ki67抗原肽复合物与树突状细胞共同孵育培养，获得树突状细胞疫苗；(6)树突状细胞疫苗功能验证。本发明技术方案的理论基础如下1、gp96介导Ki67抗原肽高效进入DC细胞DC表达HSP通用受体CD91，gp96通过受体介导的内吞机制高效提呈Ki67抗原肽进入DC。受体介导的抗原提呈效率比吞噬介导的提呈高IO4倍。2、gp96作为佐剂能活化DC :gp96本身具有诱导DC活化作用，gp96与DC的相互作用可以使炎症因子含量增加，同时协同刺激因子如CD80和CD86的表达大幅升高。3、gp96_肽结合模型gp96肽结合口袋由200个氨基酸残基组成，在反向β片层构成的表面上，有一个由α螺旋组成的沟，肽配体即位于这个沟内。肽结合口袋与gp96 二聚化结构域毗连，与gp96_肽复合物的高度稳定性，及其被传递给MHC-I类分子进行抗原提呈有关。本发明将人工合成的肿瘤特异性Ki-67抗原的CTL表位肽与重组人gp96体外结合，制备gp96-抗原肽复合物。将此gp96-Ki67抗原肽复合物与体外诱导的DC细胞共孵育， 从而获得负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的DC疫苗。这种疫苗将有效避免采用肿瘤组织来源抗原带来的将传染性或其它毒性分子带给病人的潜在危险，以及避免因多种未知多肽混合物注入体内而引发自身免疫疾病的可能。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步阐述1、重组人gp96蛋白及Ki67抗原CTL表位肽的制备重组人gp96蛋白(rhGrp94)购于ENZO公司，目录号SPP-766，纯度> 90%，用PBS 溶解，浓度为lpmol/ μ 1，所述的Ki67抗原CTL表位肽的制备方法，采用固相合成法，上海生
4工提供。首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体王氏树脂上， 然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接到固相载体上；然后将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的肽。其序列为 Leu-Gln-Gly-Glu-Thr-Gln-Leu-Leu-Val。经 HPLC 纯化后，其纯度> 90%， 质谱分析证实。用DMSO溶解，浓度为lOpmol/μ 1，分装冻存。2、重组人gp96_Ki67抗原肽复合物的制备分别取IOpmol (10 μ 1)重组人gp96和IOOpmol (10 μ 1) Κ 67抗原CTL表位肽加入 1.5ml EP 管中，加 500 μ 1 肽结合缓冲液(含 20mM H印es、20mM NaCl、2mM MgCl2)于 50°C 共孵育lOmin，然后置于室温30min。最后将结合液转入microcon 50 (Amicon)中通过超滤除去未结合的游离肽，最后得到重组人gp96-Ki67抗原肽复合物3、体外诱导树突状细胞采集新鲜肝素抗凝的健康成人(HLA_A*0201)外周血，经Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞(PBMC)，生理盐水清洗两次，低速离心后得到细胞沉淀，用RPMI1640 重悬，调整细胞浓度为1 X 106/ml，按每孔3ml接种细胞于6孔板中，置于37°C，5% CO2培养箱中孵育使单核细胞贴壁，2小时后小心吸去未贴壁细胞，用生理盐水轻轻冲洗，最后每孔力口 3ml DC培养基(为含 10% 自身灭活血浆，1000U/ml GM-CSF及 500U/ml IL-4 的 RPMI1640 培养基)。第7天收获细胞，生理盐水清洗3次后，重悬于PBS溶液中，调整细胞浓度为 5X106/ml。4、重组人gp96_Ki67抗原肽复合物负载DC取200 μ 1上述制备的重组人gp96_Ki67抗原肽复合物加入至上述诱导培养的DC 悬液中，混勻后加入6孔板中37°C共同孵育4小时。收集DC，生理盐水清洗两次，最后重悬于含(V/V)自身血浆的生理盐水中，获得负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗。5、负载重组人gp96_Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗的质量检测及方法细菌、真菌检测阴性，培养法支原体检测阴性，PCR法内毒素< lEU/ml，鲎试剂凝胶基质显色法(厦门鲎试剂厂)细胞活力及计数> 95%，Auto T4自动计数仪(Cellometer)细胞纯度LIN-> 80%，流式细胞仪细胞表面标记鉴定及成熟度⑶la、⑶11c、⑶80、⑶86、HLA-DR结果重组人gp96_Ki67抗原肽复合物能够促进DC的成熟，这种DC能有效地刺激自体T细胞的增殖，为诱导Ki67特异性CTL的产生奠定了基本的物质基础。6、重组人gp96_Ki67抗原肽复合物对人DC分泌IL-12的刺激作用按照人IL-12ELISA检测试剂盒说明，用ELISA方法检测重组人gp96_Ki67抗原肽复合物刺激DC的培养上清中IL-12的含量。对照组包括gp96组、Κ 67抗原肽组、PBS组。 根据细胞因子标准曲线和酶标仪450nm测得的OD值，计算出培养上清中IL-12的含量。结果显示，gp96-Ki67抗原肽复合物能显著刺激DC分泌IL-12。IL-12能有效刺激ThO细胞向Thl细胞发育，调节机体Thl/Th2平衡，并进一步刺激T细胞的增殖反应及特异性CTL的诱导。 7,3H-TdR掺入法检测人体外Ki67特异性CTL的杀伤活性效应细胞利用全自动免疫磁珠分选仪(Miltenyi,Germany)从人(HLA_A*0201阳性)PBMC中分选⑶8+T淋巴细胞，然后用荷载gp96-Ki67抗原肽复合物的DC与⑶8+T细胞共培养3个循环，每个循环7天，从而将所获得的细胞作为CTL杀伤实验的效应细胞。靶细胞用同位素3H-TdR标记的荷载Ki67表位肽的T2细胞作为靶细胞，进行CTL 杀伤实验。我们的CTL杀伤实验分别设立了两种不同的对照。其中一组是同一效应细胞(gp96_Ki67抗原肽复合物DC刺激的⑶8+T细胞)对不同的靶细胞的杀伤情况，靶细胞分别为荷载Ki67表位肽的T2靶细胞、荷载无关表位肽 (HIV-Ipol 476_484)的T2细胞、未荷载表位肽的T2细胞。第二组是不同组效应细胞，包括DCgp96_Ki67刺激的T细胞、DCgp96刺激的T细胞、 DCKi67刺激的T细胞、DCpbs刺激的T细胞，对同一组靶细胞(荷载Ki67表位肽的T2细胞) 的杀伤情况。结果二组实验均说明gp96_Ki67抗原肽复合物DC刺激的⑶8+T细胞能特异性地杀伤荷载Ki67表位肽的T2细胞。结果表明gp96-Ki67抗原肽复合物进入DC后能够被有效切割，并将表位肽分子运送给MHC I类分子，形成MHCI-Ki67表位肽复合物被递呈到细胞表面，从而刺激初始T细胞分化成为Ki67表位肽特异性CTL。8、CFSE/PI荧光染料标记法检测Ki67特异性CTL的杀伤活性利用全自动免疫磁珠分选仪从人PBMC中分选CD8+T淋巴细胞，然后将荷载 gp96-Ki67抗原肽复合物的DC与CD8+T细胞共培养，所获得的细胞作为特异性CTL杀伤的效应细胞。取对数生长期的肾癌细胞786-0作为靶细胞。用CFSE标记靶细胞，当效应细胞杀伤靶细胞后，标记有CFSE荧光染料的靶细胞膜受损，通透性发生改变，PI渗透到细胞内使其着色，据此可用流式检测CFSE/PI双阳性细胞占靶细胞的比例，从而反映细胞毒活性。结果显示荷载gp96_Ki67抗原肽复合物的DC与⑶8+T细胞共培养获得的效应细胞对786-0细胞的杀伤率明显高于对照组9、ELISP0T法原位检测分泌IFN- γ的细胞CTL活化后可产生大量IFN- γ，IFN- γ又可刺激更多CTL的活化。将IFN- γ的捕获抗体包被在贴有PVDF膜的微孔板上，加入细胞；若细胞分泌了 IFN-γ，IFNy则分布在细胞的周围被捕获抗体结合；洗去未结合的细胞，先后加入生物素标记的IFN-Y检测抗体、辣根过氧化物酶(HRP)连接的亲和素、显色液。若曾存在IFN-Y产生细胞，就会在相应的位置出现着色的斑点，因此，IFN- y ELISP0T方法可以检测IFN- γ产生细胞的频率。我们采用ELISP0T方法检测了荷载各组蛋白的DC刺激纯化的⑶8+Τ细胞分泌IFN- γ的情况。结果显示荷载gp96_Ki67抗原肽复合物的DC刺激⑶8+T细胞分泌IFN- γ的频率明显高于对照组。
权利要求
1.一种负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于将Ki67抗原肽与热休克蛋白gp96形成复合物，然后负载于树突状细胞制备。
2.根据权利要求1所述的负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗，其特征在于所述的Ki67抗原肽是HLA-A*0201限制性的Ki67抗原CTL表位< >肽。
3.根据权利要求2所述的负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗，其特征在于Ki67抗原CTL表位肽，其长度为9个氨基酸，其序列为Leu-Gln-Gly-Glu-Thr-Gl n-Leu-Leu-Val。
4.根据权利要求3所述的负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗，其特征在于所述Ki67抗原CTL表位肽，是采用固相合成法合成制备的，其纯度大于90%。
5.根据权利要求1所述的负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗， 其特征在于所述的gp96-Ki67抗原肽复合物是Ki67抗原CTL表位肽与重组人热休克蛋白 gp96结合的复合物。
6.如权利要求1所述的gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗的用途，gp96-Ki67 抗原肽复合物的树突状细胞疫苗能用于治疗Ki67阳性肿瘤疾病。
全文摘要
本发明公开了一种负载重组人gp96-Ki67抗原肽复合物的树突状细胞疫苗。包括1.筛选、鉴定、合成Ki67抗原CTL表位肽；2.将合成的表位肽与重组人热休克蛋白gp96形成复合物；3.制备树突状细胞，并将该复合物负载于树突状细胞，最终得到该疫苗。Ki67抗原肽在gp96的协助下能通过受体介导的内吞被提呈给树突状细胞，并引起CTL活化，从而杀伤表达Ki67抗原的肿瘤细胞。由于Ki67抗原在肿瘤细胞广泛表达，因此该疫苗具有适用范围广、制备简单高效等优势。
文档编号C07K19/00GK102552902SQ20111045944
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者刘俊杰, 张宝福, 张青, 李慧忠, 李连涛, 杨洁, 章龙珍, 裴冬生, 郑骏年 申请人:郑骏年