专利名称：Robo 1-Fc融合蛋白及其用于治疗肿瘤的用途的制作方法
Robo 1-Fc融合蛋白及其用于治疗肿瘤的用途本发明涉及重组蛋白质Robo I-Fc及其用于治疗其中Slit蛋白质是过表达的疾病，特别地癌症的用途。它还涉及包含此类重组蛋白质的组合物。本发明的另一个方面由Robo I-Fc分子作为用于检测患者中Slit家族分子的过表达的诊断工具的用途组成。Slit配体首先因其在排斥在神经元发育中的轴突生长中的作用而得到描述。自那以后，Robo/Slit调节途径也已在肿瘤血管生成中得到描述。事实上，Robo4/Slit2途径已得到描述用于抑制内皮细胞对VEGF的应答(Jones C.A.等人Nat. Med 14,448 -453(2008))。通过Robo/Slit途径的调节使得能够引导内皮非成熟新生血管或芽(非生产性血管生成)的过量增殖且使这些脉管成熟。在转录水平的Slit2表达已在几种人癌症系中得到证实，特别是衍生自结肠癌的HCT116、衍生自卵巢癌的Skov-3、衍生自宫颈癌的HeLa、衍生自黑素瘤的MDA-MB-435、衍生自子宫癌的Hec-IA、和最后衍生自肾癌的769-P (StellaMC 等人，Mol Biol Cell. 2009 Vol. 20，Issue 2，642-657)。Slit2 蛋白质的过表达也已在衍生自下述癌症的人组织上得到证实口腔癌(Wang等人2008，Cancer Sci. 2008年3月；99(3) :510-7)、前列腺癌(Latil 等人 2003 Int J Cancer. 2003 年 I 月 20 日；103(3 )306-15)、结肠癌(Wang 等人 2003，Cancer Cell, Volume 4, Issue 1，2003 年 7 月，第 19-29页)、和肝癌(Avci等人，2008，BMC cancer，8 :392)。最近以来，Slit2蛋白质的过表达也已在子宫内膜异位症的样品上显示(Shen等人，2009，Λ/P 175(2) :479)。Robo I蛋白质以两种同种型a和b存在。Robo I蛋白质同种型b (NP_598334)的细胞外结构域包含5个免疫球蛋白结构域Igl、Ig2、Ig3、Ig4和Ig5。Robo蛋白质在Igl和Ig2结构域的水平上与Slit配体相互作用。Liu等人(2004, Mol. Cell Neurosci, 26 232-240)已证实Ig2结构域在与Slit的相互作用和Robo活性(化学排斥)中的重要性。Robo I和Slit2蛋白质的特异性抗体的使用已在申请W02003/075860中得到描述。这些抗体使得能够抑制肿瘤血管生成。然而，提议用于治疗肿瘤的可替代方法，特别地能够抑制Slit-2发信号途径的分子将是有利的。本发明人已开发了能够结合Slit配体并因此抑制Robo/Slit途径的细胞内发信号的可溶性嵌合Robo I受体的策略。令人惊讶的是，根据本发明的Robo I-Fc分子通过阻止成熟脉管的形成而不是通过抑制内皮细胞的增殖具有抗血管生成效应。发明详述
本发明的主题是Robo-Fc重组蛋白质，其包含Robo I蛋白质同种型b的细胞外结构域或这个结构域的一部分，连接区(接头)和免疫球蛋白Fe结构域。在一个特定实施方案中，Robo I蛋白质同种型b的细胞外结构域由Igl和Ig2结构域组成。这些结构域对应于由核苷酸序列SEQ ID NO. I编码的SEQ ID NO. 2肽，或与序列SEQ ID NO. 2具有至少80%、85%、90%、95%或99%的同一性的序列。融合蛋白还包含连接区，也称为“接头”。在本发明的背景中，接头使得能够，特别地通过限制体内切割(clivage),为重组蛋白质提供稳定性。可以在Robo l_Fc分子中使用的接头是例如GluArgProSerPheVal和GlyGlyGlyGlySer。本领域技术人员具有的知识足以选择适合于这个用途的接头。根据本发明的Robo I-Fc重组分子的Fe结构域对应于免疫球蛋白的可结晶片段。这个Fe片段可以来自不同免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。它负责免疫反应的效应子功能(W02008/065543)。在根据本发明的一个实施方案中，Fe结构域来自IgG4免疫球蛋白。在一个特定实施方案中，至少一个点突变或缺失已被引入到IgG4的Fe结构域内，以便增加分子的稳定性(特别地通过稳定由两个Fe结构域构成的铰链区)(Angla等人，1993, Mol. Immunol.,30 =105-108)，以减少或消除IgG4-Fc的残留活性，特别是效应子活性(W0 97/09351)，并且增加在重组蛋白质的生产过程中的同质性。特别地，已将至少两个点突变，优选三个点突变引入到IgG4的Fe结构域内。在根据本发明的Robo I-Fc LKRobo I-Fc L2和Robo I-FcL3分子中，优选突变是下述
-S241P (Kabat编号)，以便稳定在Fe铰链区中的通过二硫桥的键合；
-L248E(Kabat编号)，以便消除IgG4_Fc结构域的残留效应子活性；
-C末端赖氨酸的不存在，以便减少蛋白质的异质性。如上所述包含Robo I同种型b的Igl和Ig2结构域、接头和突变型IgG4结构域的根据本发明的 Robo 1-Fc 分子是 Robo I-Fc Ll、Robo I-Fc L2 和 Robo I-Fc L3。Robo I-Fc LI对应于由核苷酸序列SEQ ID NO. 3编码的序列SEQ ID NO. 4的蛋白质。Robo I-Fc L2对应于由核苷酸序列SEQ ID NO. 5编码的序列SEQ ID NO. 6的蛋白质。
Robo I-Fc LI和Robo I-Fc L2由于接头的性质而不同。Robo I-Fc L3对应于由核苷酸序列SEQ ID NO. 23编码的序列SEQ ID NO. 24的蛋白质。在本发明的一个特定实施方案中，已引入一个或多个点突变或缺失，以便增加在生产过程中的同质性。特别地，一个氨基酸、优选两个氨基酸已在N末端位置中截短。根据本发明的此类Robo I-Fc分子是Robo I-Fc L3分子,其中两个氨基酸(Ser20和Arg21)已截短，并且其中氨基酸Leu 22已融合至白细胞介素2的信号肽。根据本发明的Robo I-Fc分子的同质性也通过如前所述缺失C末端Lys得到提闻。本发明的主题还是其蛋白质序列对应于序列SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ IDNO. 6 或 SEQ ID NO. 24 的蛋白质，或与序列 SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 6 或 SEQID NO. 24具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的蛋白质。这些蛋白质变体具有与蛋白质(其具有序列 SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 24)相同的生物学活性，特别是其与Slit家族蛋白质相互作用的能力。根据本发明的Robo I-Fc蛋白质可以通过下述进行产生将编码这些蛋白质的表达质粒转染到适合于表达真核重组蛋白质的任何细胞类型内HEK293、CHO等，随后根据常规方法在培养上清液(surnageant de culture)中回收且纯化。根据本发明的Robo I-Fc Ll> Robo I-Fc L2和Robo I-Fc L3蛋白质的表征已使得能够证实它们具有其作为生物治疗剂的给药所需的品质。
根据本发明的Robo I-Fc蛋白质具有与Slit家族的蛋白质相互作用的能力。根据本发明的Robo I-Fc蛋白质特别地通过与其D2结构域相互作用，特异性地识别人Slitl、Slit2和Slit3蛋白质，和鼠Slit2蛋白质。它们的亲和力就Slit家族的3个成员而目是相似的。根据本发明的另一个主题对应于编码根据本发明的蛋白质的核酸分子。因此，对应于序列SEQ ID NO. USEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 23，或与具有序列 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 23 的分子具有至少 80%、85%、90%、95%或99%同一性的核酸分子是本发明的一部分。根据本发明的另一个主题由根据本发明的Robo I-Fc蛋白质用于治疗其中Slit家族的蛋白质是过表达的疾病的用途组成。可以由根据本发明的Robo I-Fcs靶向的Slit家族的蛋白质是Slitl、Slit2或 Slit3。已显示Robo I可以与Slit家族的不同成员相互作用。因此，注意到根据本发明的Robo I-Fc蛋白质能够同时抑制由Slitl、Slit2和Slit3介导的发信号途径是有利的，这使得能够拓宽治疗谱(与对于仅仅这些途径中的一个是特异性的抗体相比较)。在另一个实施方案中，通过抑制血管生成而不是抑制内皮细胞增殖，Robo I-Fc蛋白质用于治疗其中Slit家族的蛋白质是过表达的疾病。与脉管成熟缺陷相关的这种抗血管生成活性被称为“非生产性血管生成”。事实上，实验研究已显示根据本发明的Robo I-Fc分子能够抑制小管形成，而不抑制内皮细胞增殖。它们使得能够非常显著地减少在肺癌的鼠模型中的肿瘤体积。在一个优选实施方案中，可以用于治疗其中Slit蛋白质是过表达的疾病的RoboI-Fc蛋白质是Robo I-Fc LU Robo I-Fc L2和Robo I-Fc L3，正如由其衍生的分子，其特别包括旨在提高在生产过程中的同质性的点突变或缺失而不显著改变这些分子的生物学性质。一般而言，可以用根据本发明的Robo I-Fc蛋白质治疗的疾病都是其中抑制Slit途径可以具有疗效的疾病，特别是其中Slit家族的蛋白质是过表达的疾病，且特别是其中Slit2是过表达的那些。因为根据本发明的Robo I-Fc分子特异性地结合Slit_2分子，所以注意到所述分子能够同时抑制在其中涉及Slit-2的两个途径，即Robo l/Slit-2和Robo4/Slit-2途径是有利的。根据本发明的Robo I-Fc蛋白质因此可以用于治疗癌症，特别是胰腺癌、结肠癌、含或不含淋巴转移的结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌和肺转移瘤(m6tastases pulmonaires)、卵巢癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌、口癌、前列腺癌、肝癌等。在一个特定实施方案中，Robo-Fc蛋白质用于治疗肺癌和肺转移瘤。根据本发明的Robo I-Fc分子还可以用作抗癌药物作为目前治疗的替代方案或作为目前治疗的补充。特别地，这些分子可以与抗癌化合物组合(同时或非同时)给药。本发明的另一个主题涉及包含如上定义的Robo I-Fc蛋白质和一种或多种药学可接受的赋形剂的组合物。
根据本发明的Robo I-Fc蛋白质可以在药物组合物中配制，目的在于局部、经口、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内等给药。优选地，药物组合物含有用于可注射制剂的药学可接受的赋形剂。它们可以特别是等渗无菌盐溶液(磷酸一钠或二钠，氯化钠、钾、钙或镁等，或此类盐的混合物)、或干燥的组合物、特别是冻干组合物，其通过在合适时加入无菌水或生理盐水，允许可注射溶液的构成。本发明的另一个方面由Robo I-Fc分子作为用于检测患者中Slit家族分子的过表达的诊断工具的用途组成。这是因为已显示Slit途径被牵涉在许多癌症中。用于评估Slit发信号途径的干扰的测试的提供对于选择能够响应基于给药Robo I-Fc分子的治疗的患者的目的是非常有用的。这种诊断工具可以以现成可用的试剂盒形式存在，包含以适合于使其与来自患者的生物学样品(血液、尿、肿瘤活组织检查)接触的形式的Robo I-FC分子，所述生物学样品易于显示出Slit分子的过表达。Robo-Fc分子可以任选是预标记的，并且检测Robo-Fc和Slit的组合，以便评估与对照样品相比较Slit蛋白质在生物学样品中的表达的增加。这 种试剂盒可以例如以ELISA试剂盒的形式存在。附图
描述
图I :关于Robo I-Fc Ll、Robo I-Fc L2和Robo I-Fc L3蛋白质的表达质粒。图2 :通过ELISA评估Robo I-Fc融合蛋白变体与Slit2蛋白质的相互作用。图3 :通过FACS测量的Robo I-Fc对于不表达Slit_2的HEK293细胞的亲和力。图4 :通过FACS测量的Robo I-Fc对于表达Slit2的HEK293细胞的亲和力。图5:在小鼠中的iv注射后Robo I-Fc蛋白质的药物代谢动力学曲线。A.给药Robo I-Fc LI, B.给药 Robo I-Fc L2。图6:Robo I-Fc LI分子在用内皮细胞和间充质细胞的共培养测试中的效应。A.Robo I-Fc LI抑制培养物中的小管形成。B. Robo I-Fc LI显著抑制由VEGF诱导的伪小管(pseudo-tubule)形成。图7 =Robo I-Fc LI对小鼠中的离体主动脉环模型的作用的评估。A :用于制备主动脉环和用于测量管的方案的描述。B:a.对照；b. Robo I-Fc Slit2_负的500 Pg/mL +VEGF 10 ng/mL ；c. Robo I-Fc LI 500 Pg/mL + VEGF 10 ng/mL。
实施例实施例I :Robo I-Fc蛋白质的产生
a.允许表达用作生物治疗剂的Robo I-Fc重组蛋白质的构建体(constructions)。Robo I-Fc重组蛋白质由在人Robo I蛋白质同种型b (NP_598334)的前两个免疫球蛋白结构域(Igl-Ig2)和人免疫球蛋白G4的Fe结构域(hIgG4_Fc, SwissProt IGHG4_HUMAN)之间的融合物组成。为了获得Robo I-Fc LI构建体，使用人胎儿心脏的cDNA库(banque)(参考HL5042T, Clontech)通过PCR扩增了 cDNA(SEQ ID NO. I)的片段，所述cDNA对应于这种蛋白质(SEQ ID NO. 2)的免疫球蛋白(Ig)结构域Igl和Ig2,随后为GluArgProSerPheVal接头。随后将这个扩增的片段克隆到真核生物表达载体PXL4904内(在图I中描述的)，从而使得Robo I的两个Ig结构域作为在C末端位置中具有人IgG4的Fe结构域的融合物表达。将三个点突变引入到IgG4-Fc结构域内，以便获得下述特征S241P (Kabat编号)，以便稳定Fe铰链区中的二硫桥键合；L248E，以便消除IgG4-Fc结构域的残留效应子活性；C末端赖氨酸的不存在，以便减少蛋白质的异质性。用于表达这种重组蛋白质的cDNA序列对应于序列SEQ ID NO. 3。将所获得的重组蛋白质称为Robo I-Fc LI，且对应于蛋白质序列SEQ ID NO. 4。为了获得Robo I-Fc L2构建体，将对应于Igl_Ig2结构域但不含所提及的接头的相同cDNA克隆到真核生物表达载体pXL4909内(在图I中所描述的)，其允许表达这些Ig结构域(其与含有在Robo I-Fc LI的构建中所描述的3个点突变的IgG4的相同Fe结构域的融合)，但这次通过在Fe结构域上游引入GlyGlyGlyGlySer接头。用于表达这种重组蛋白质的cDNA序列对应于序列SEQ ID NO. 5。将所获得的重组蛋白质称为Robo I-Fc L2，且对应于蛋白质序列SEQ ID NO. 6。b.用作对照的Robo I-Fc蛋白质的构建 为了获得Robo I-Fc S1U2-负的构建体，通过PCR修饰先前克隆到pXL4904质粒内的cDNA，以便引入允许在位置38上的亮氨酸取代为谷氨酰胺和在位置89上的苯丙氨酸取代为酪氨酸的点突变。用于表达这种重组蛋白质的cDNA序列对应于序列SEQ ID NO. 7。将所获得的重组蛋白质称为Robo I-Fc S1U2-负的，且对应于蛋白质序列SEQ ID NO. 8。为了获得Robo I-Fc肝素-负的构建体，通过PCR修饰了克隆到pXL4904质粒内的cDNA，以便引入允许在位置97上的精氨酸取代为丙氨酸和在位置98上的赖氨酸取代为丙氨酸的点突变。用于表达这种重组蛋白质的cDNA序列对应于序列SEQ ID NO. 9。将所获得的重组蛋白质称为Robo I-Fc肝素-负的，且对应于蛋白质序列SEQ ID NO. 10。c.不同Robo I-Fc蛋白质的产生
如已在申请W02008/065543中所述的那样，分别使用pXL4904和pXL4909质粒，以及允许表达两种N-聚糖的糖基化酶(即α _2，3-唾液酸转移酶和β -I, 4-半乳糖基转移酶)的辅助质粒 PXL4544 和 pXL4551，通过在 ΗΕΚ293 系(FreeStyle 293-F 细胞参考 51-0029，Invitrogen,根据供应商的建议)中的瞬时转染产生了两种蛋白质Robo I-Fc LI和RoboI-Fc L2。这些蛋白质还分别使用pXL4904和pXL4909质粒通过在CHO系(CH0-S细胞，参考11619-012, Invitrogen,根据供应商的建议)中的转染进行了产生。通过在蛋白A 亲和柱(MabSelect 参考 17-5199-02, Amersham Biosciences)上层析和在20 mM NaCl / 100 mM乙酸缓冲液中洗脱，纯化了在HEK293细胞培养上清液中表达的Robo I-Fc LI和Robo I-Fc L2蛋白质，并且随后在PBS缓冲液(参考14190-094，Invitrogen)中配制。以相同方式产生且纯化了 Robo I-Fc Slit2_负的和Robo l_Fc肝素-负的重组蛋白质。d. Robo I-Fc重组蛋白质的物理化学表征
SDS-PAGE和凝胶渗透分析使得能够显示所述蛋白质是二聚的和超过96%纯度。质谱法分析使得能够证实这些蛋白质的鉴定，测量的去糖基化蛋白质的重量与在计算机芯片Un■si7ico)上计算的重量完全一致。如由 Saddic 等人 2002. (Methods Mol. Biol. 194:23-36和Anumula等人1998. Glycobiology 8:685-694)描述的,单糖组合物的分析和N-聚糖的唾液酸的定量已使得能够证实所述蛋白质被非常大量地唾液酸化。结果在表I中给出。应当指出Robo I-Fc LI和Robo I-Fc L2分子的N末端分析显示这些纯化蛋白质含有可变比例(O - 40%)的具有前2个残基(Ser20和Arg21)截短的形式(forme tronquee) 表I :Robo I-Fc蛋白质的鉴定
权利要求
1.Robo-Fc重组蛋白质,其包含所述Robo I蛋白质的细胞外结构域或这个结构域的一部分、接头和免疫球蛋白Fe结构域,其中所述细胞外结构域来自所述Robo I蛋白质的同种型b。
2.根据权利要求I的蛋白质，其中所述RoboI的细胞外结构域包含Igl和Ig2免疫球蛋白结构域。
3.根据权利要求2的蛋白质，其中所述RoboI的细胞外结构域与所述序列SEQ IDNO. 2具有至少80%的同一性。
4.根据前述权利要求中任一项的蛋白质，其中所述Fe结构域来自人免疫球蛋白G4。
5.根据权利要求4的蛋白质，其中所述Fe结构域包含旨在增加所述蛋白质的稳定性和/或消除所述Fe结构域的残留效应子活性和/或增加在其生产过程中的同质性的至少一个点突变。
6.根据权利要求5的蛋白质，其中所述Fe结构域包含所述S241P和L248E突变，并且其中位于C末端位置中的赖氨酸不存在。
7.根据权利要求2- 4中任一项的蛋白质，其中所述氨基酸Ser20和Arg21已缺失，以便增加在其生产过程中的同质性。
8.根据权利要求I- 4中任一项的蛋白质，其中所述序列与序列SEQ ID NO. 4、SEQID NO. 6或SEQ ID NO. 24具有至少80%的同一性。
9.核酸分子，其编码如权利要求I- 8中定义的蛋白质中的一种。
10.核酸分子，其对应于所述序列SEQID NO. USEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5或SEQ IDNO. 23，或与具有序列 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 23 的分子具有至少80%的同一性。
11.根据权利要求I- 8中任一项的Robo I-Fc重组蛋白质，其用于作为药物的应用。
12.用于根据权利要求11的在疾病治疗中的应用的蛋白质，在该疾病中所述Slit家族的蛋白质是过表达的。
13.用于根据权利要求11的应用的蛋白质，其用于治疗癌症。
14.用于根据权利要求12或13中任一项的应用的蛋白质，其不抑制内皮细胞增殖。
15.用于根据权利要求13的应用的蛋白质，用于治疗肺癌或肺转移瘤。
16.用于根据权利要求11- 15中任一项的应用的蛋白质，这种蛋白质衍生自所述Robo I蛋白质的同种型b。
17.用于根据权利要求16的应用的蛋白质，这种蛋白质如在权利要求2- 8中所定义。
18.药物组合物，其包含如权利要求I- 8中定义的Robo I-Fc重组蛋白质和至少一种赋形剂。
19.根据本发明的RoboI-Fc分子作为用于检测患者中所述Slit家族分子的过表达的诊断工具的用途。
全文摘要
本发明涉及重组蛋白质Robo 1-Fc及其用于治疗其中Slit蛋白质是过表达的疾病，特别地癌症的用途。本发明还涉及包含此类重组蛋白质的组合物。本发明的另一个方面包括Robo 1-Fc分子作为用于检测患者中属于Slit家族的分子的过表达的诊断工具的用途。
文档编号C07K14/475GK102884076SQ201180023828
公开日2013年1月16日 申请日期2011年4月8日 优先权日2010年4月14日
发明者F.布朗什, B.卡梅龙, T.达布杜比, F.多尔-格莱兹, P.丰斯, J-P.赫罗, C.普拉德 申请人:赛诺菲