专利名称：重组多聚流感蛋白的制作方法
重组多聚流感蛋白
本发明涉及病毒学领域，具体地，本发明涉及流感病毒疫苗领域。
流感是由属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的三种类型的流感病毒甲型、乙型和丙型流感病毒引起的感染性疾病。流感病毒为由编码9种蛋白质的7个负单链RNA区段(丙型流感)或编码11种蛋白质的8个负单链RNA区段(甲型和乙型流感)组成的RNA 病毒(Chen和Deng，2009)。鸟类被认为是所有甲型流感病毒的天然宿主，但许多亚型也可感染哺乳动物包括人。流感症状包括发热、头痛、恶寒、肌内疼痛和咽喉疼痛，与普通感冒相当的症状。然而，流感可导致威胁生命的并发症例如肺炎，和在高危人群例如幼儿、老年人以及免疫力下降的或患慢性疾病的个体中导致死亡。在过去，流感大流行例如1918/1919 西班牙流感大流行(H1N1亚型)和1968/1969香港流感大流行(H 3N2亚型)已造成数百万人死亡(Khanna等人，2008)。
流感病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)为血清学上不同的流感亚型的基础。目前已鉴定了 16种HA(H1-H16)和9种NA(N1_N9)血清型，其用于分类流感病毒(例如H3N2)。抗原漂移(由引起氨基酸置换的一个或多个突变导致)，可引起HA和NA的小的抗原改变，从而导致逃脱宿主的免疫。此外，称为抗原转变的过程通过来自不同流感病毒亚型的HA和NA的组合导致形成新的病毒亚型(重排列)。HA和/或NA的这些改变部分可以为选择压力的结果(Chen和Deng, 2009)。
HA存在于病毒膜中。其必须被宿主蛋白酶切割，产生两条多肽HAl和HA2，才能具有感染性。在切割后，HA2多肽的新暴露的N末端随后用于介导病毒与宿主细胞膜的融合， 这使得病毒能够起始对宿主细胞的感染(Skehel和Wiley，2000)。HA为由3个结构上不同的区域(由包含受体结合位点和和HA1/HA2切割位点的反向平行β-折叠组成的球状头部、三链卷曲螺旋(coiled-coil) α螺旋茎、和由反向平行β -折叠组成的球状脚)组成的同三聚体。图I中展示了流感病毒的示意图。每一个单体由具有通过二硫键连接的HAl和 ΗΑ2 区域的 HA 多肽组成(Skehel 和 Wiley, 2000; Stevens 等人，2006)。
NA催化宿主细胞的糖蛋白的末端唾液酸残基的水解，从而阻止HA与此类蛋白质的结合。因此NA促进病毒从细胞释放,从而促进病毒的扩散。NA为通过N端锚定至病毒膜的同四聚体。在图I中，显示了流感病毒的示意图。每一个单体包含以螺旋浆形式排列的6个拓扑学上一致的β_折叠，这形成了连接至茎区域的四聚体蛋白的头部。酶活性位于每一个单体中(Colman 1994)。
流感病毒感染在冬天最盛行，每年都开发季节性流感疫苗。此类疫苗包含两种甲型流感病毒(Η1Ν1和Η3Ν2)和一种乙型流感病毒(Khanna等人，2008)。每年都需要开发新型组合物来保护免受预测的循环株(circulating strain)的侵害。尽管它们可具有高同源性，特定疫苗可能不能保护免受相同甲型流感亚型的不同株的侵害。除了季节性人流感疫苗外，存在几种用于治疗动物的流感疫苗，例如抗家禽的禽H5N1和H9N2流感感染的疫苗和抗猪的HlNl和H3N2流感感染的疫苗。目前可获得的流感疫苗为活减毒流感病毒或灭活的流感病毒，其通常通过在含胚鸡卵(embryonized chicken egg)中生长病毒来产生。该生产方法存在几个不利方面，包括操作流感病毒所需的高水平生物安全防范设施，不能在含胚鸡卵中获得高产率的流感病毒，对于非常有限数目的甲型流感亚型的高度特异性以及不能在蛋类过敏的个体(主要是儿童)中使用疫苗(Lipatov等人，2004)。
已作出许多努力来开发基于来源于HA或NA的重组蛋白质的疫苗。然而，所有此类疫苗在治疗效率和功效方面具有局限性。Wei等人(JVirol. 2008)描述了利用重组H5N1 HA蛋白接种小鼠。用于表达重组H5N1 HA蛋白的质粒包含编码三聚结构域和His-标签的核酸序列，所述三聚结构域和His-标签在蛋白质纯化后都被去除。为了有效，必须用相对高的量(20 μ g)的蛋白质免疫小鼠超过I次(第O和3周)。在Song等人(PLoS One. 2008) 和TO 2007/103322中，描述了利用2个剂量的包含融合至TLR5配体鞭毛蛋白的HA球状头部的组合物进行的小鼠免疫。此外，在Song等人(PLoS One. 2008)中，利用2个剂量的5 或15 μ g融合至鞭毛蛋白的HA免疫兔子。在Saelens等人(Eur JBiochem. 1999)中，使用 3个剂量的包含毕赤酵母(P.pastoris)中表达的重组HA和Ribi佐剂(水包油乳剂)的组合物来免疫小鼠，W095/18861描述了使用3个剂量的包含神经氨酸酶的组合物免疫小鼠。 Kong等人(Proc Natl Acad Sci USA. 2006)需要利用3个剂量的表达流感病毒血凝素的质粒 DNA 来免疫小鼠，这也描述于 WO 2007/100584、WO 2008/112017 和 WO 2009/092038 中。
本发明的目的是，提供用于引发抗流感病毒的保护性免疫应答的改进的免疫原性组合物。因此本发明提供了免疫原性组合物，其包含至少一种融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白的重组多聚胞外结构域或其部分，以及药学上可接受的稀释剂。
“免疫原性组合物”在本文中被定义为，当给个体施用时能够引发免疫应答的组合物。引发的免疫应答可以是体液免疫应答、细胞免疫应答或其组合，包括但不限于抗体、B细胞和T细胞的产生。本文中使用的免疫应答优选特异性针对根据本发明的组合物中的一种或多种免疫原。
可通过本领域已知的任何技术给个体施用本发明的免疫原性组合物，所述技术包括但不限于肌内(IM)、真皮内(ID)、皮下(SC)、颅内(1C)、腹膜内(IP)或静脉内(IV)注射、 经皮肤、口服、鼻内或直肠施用，及其组合。此外，可以例如通过注射或口服或经鼻施用单个地,或例如通过补充入饮用水或通过对动物喷雾或喷雾至动物例如农场动物上方的空气中集体地进行根据本发明的免疫原性组合物的施用。在优选实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物用于引发免疫应答。优选将免疫原性组合物用作疫苗。
“个体”在本文中定义为人或动物，优选可被流感病毒感染的动物，例如鸟类，包括但不限于家禽。个体包括但不限于鸡、鸭、鹅、火鸡、天鹅、鸸鹋、珠鸡(guinea fowl)和雉、 人、猪、白鼬、海豹、兔、猫、狗和马。在本发明的优选实施方案中，个体为哺乳动物例如人、猪或马，或鸟类。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物为人。
“多聚胞外结构域”在本文中定义为，表面蛋白质的细胞外部分，所述表面蛋白包含至少两个(非共价键合的)亚基。所述表面蛋白可以为流感病毒的任何表面蛋白。通过使用流感病毒表面蛋白的多聚胞外结构域或其部分，获得和/保持所述流感病毒表面蛋白的正确二级、三级和四级结构。“流感蛋白质”在本文中定义为由流感病毒基因组编码的任何蛋白质。
本文中使用的“药学上可接受的稀释剂”定义为，不具有生物学或另外的不想要的活性的任何溶液、物质或其组合，意味着可将其与免疫组合物的其它组分一起给个体施用而不引起明显的不利反应。
在整个本申请中，融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感蛋白质的重组多聚胞外结构域或其部分还进一步称为根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分。
如本文中所用，“流感病毒”包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒以及所有流感病毒亚型。如本文中所用，“流感类型”是指甲型、乙型或丙型流感。如本文中所用，“流感株”是指不同的甲型流感病毒例如H1N1、H1N2、H1N7、H2N2、H3N2、H3N8、H4N8、 H5N1、H5N2、H5N9、H6N2、H6N5、H7N2、H7N3、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6。 如本文中所用，“血凝素”或“HA”是指流感病毒的血凝素蛋白，并且可以是任何流感类型， 甲型、乙型或丙型，以及任何血清型例H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、 H14、H15或H16，包括属于相同血清型但因例如抗原漂移而具有小差异的亚型。如本文中所用，“神经氨酸酶”或“NA”是指流感病毒的神经氨酸酶蛋白，并且可以为任何流感类型，甲型、乙型或丙型，和任何血清型例如NI、N2、N 3、财、阳、邮、町、_或_，包括属于相同血清型但因例如抗原漂移而具有小的差异的亚型。如本文中所用，“其部分”被定义为比流感病毒蛋白质的完整多聚胞外结构域小但具有相似免疫原性的流感病毒蛋白质的重组多聚胞外结构域的任何部分。
例如，根据本发明的重组多聚HA的一部分包括HA2，或包含紧邻HA的HAl亚基的高度保守的表位的HA2的一部分(Ekiert等人，2009)或缺乏球状头部结构域的HA胞外结构域。优选所述HA2的表位、HA2的部分或缺乏球状头部结构域的HA胞外结构域包含融合至HA的氨基酸293-524 (根据流感株X31的HA的编号的氨基酸编号，EMBL-EBI登录号 P03438)的HA的氨基酸1-68。因为所述HA的表位在不同流感病毒类型、亚型和株中高度保守，因此如果所述部分用于根据本发明的免疫原性组合物，则可提供抗不同流感病毒类型、 亚型或株的广泛保护作用。
在优选实施方案中，提供了根据本发明的免疫原性组合物用于制备引发抗流感病毒的免疫应答的预防剂的用途。还提供了用作疫苗的根据本发明的免疫原性组合物。
“链霉抗生物素蛋白未和标签”或“ strep-标签”在本文中被定乂为，结合链霉抗生物素蛋白或其衍生物例如Strep-Tactin的标签，其包含至少一个由9个氨基酸组成的肽:Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly,或至少一个由8个氨基酸组成的肽(也称为 Strep-标签 II) :Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys,其中 Trp 为色氨酸，Ser 为丝氨酸， His为组氨酸，Pro为脯氨酸，Gln为谷氨酰胺，Phe为苯丙氨酸，Glu为谷氨酰胺，Lys为赖氨酸，Ala为丙氨酸，Arg为精氨酸以及Gly为甘氨酸。在优选实施方案中，链霉抗生物素蛋白亲和标签包括两个或更多个所述多肽(每一个由8或9个氨基酸组成)，更优选3个所述肽。在一个实施方案中，链霉抗生物素蛋白亲和标签包含超过3个的所述肽。strep-标签例如用于分离和/或纯化目的。该标签结合链霉抗生物素蛋白或其衍生物(例如固定在柱子上的)。可使用生物素或其衍生物或类似物例如脱硫生物素从柱子洗脱融合至strep-标签的蛋白质。可将链霉抗生物素蛋白亲和标签置于目标蛋白质的C或N端。如本文中所用， ‘衍生物’被定义为具有被链霉抗生物素蛋白亲和标签结合的能力，从而可用于分离或纯化包含链霉抗生物素蛋白亲和标签的蛋白质的链霉抗生物素蛋白的任何变体。链霉抗生物素蛋白的优选衍生物为Strep-Tactin。
可通过与生物素或适当的衍生物竞争，在温和条件下洗脱结合的重组蛋白质。温和条件意指，可在生理条件例如水溶液、室温、中性或微碱性pH和常压下进行纯化。
在本发明的优选实施方案中，流感蛋白质的重组多聚胞外结构域或其部分选自重组三聚流感血凝素胞外结构域或其部分和重组四聚流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分。
在一些实施方案中，根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的氨基酸序列例如通过氨基酸置换、缺失和/或添加来改变，所述改变提供了功能上与根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分等同的蛋白质。功能上等同的蛋白质可通过本领域已知的任何方法，例如通过它们诱导个体的抗流感病毒的免疫应答的能力，或在其中测定对抗体的结合的体外测定中来进行鉴定。在根据本发明的免疫原性组合物中提供改变的重组多聚胞外结构域，例如因为其可以以与未改变的亲代多聚胞外结构域相比较更高的水平产生。
根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分优于流感病毒蛋白质的单体胞外结构域或其部分，因为此类多聚胞外结构域将导致免疫应答的更有效的引发。因此，根据本发明的包含这样的重组多聚胞外结构域的免疫原性组合物，与包含流感病毒蛋白质的单体胞外结构域的免疫原性组合物相比较，需要更低的施用剂量和减少的施用次数来引发充足的免疫应答。
根据本发明的免疫原性组合物可包含一种重组三聚流感血凝素胞外结构域或其部分或一种重组四聚流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分。此类免疫原性组合物特别适合于引发个体的抗流感病毒亚型或株或超过一种相关流感病毒亚型或株的免疫应答。然而， 在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物包含一种或多种三聚血凝素胞外结构域或其部分，和/或一种或多种四聚神经氨酸酶胞外结构域或其部分的组合。
因此，例如，可组合2、3、4、5、6、7、8、9或10种三聚血凝素胞外结构域或其部分，例如 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 / 或 H16，或可组合 2、3、4、5、6、7、8或9种四聚神经氨酸酶胞外结构域或其部分，例如NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、 NS和/或_。此外，根据本发明的免疫原性组合物可包含不同流感病毒亚型的一种或多种三聚血凝素胞外结构域或其部分和一种或多种四聚神经氨酸酶胞外结构域或其部分的组合。例如，可组合1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种三聚血凝素胞外结构域或其部分和1、2、3、4、5、6、7、8或9种四聚神经氨酸酶胞外结构域或其部分，例如HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 和 / 或 N9。本领域技术人员将清楚，术语“一个或多个胞外结构域”包括来自一种或多种流感病毒亚型例如甲型流感病毒和乙型流感病毒的一个或多个胞外结构域。因此，根据本发明的免疫原性组合物可以是多价组合物，其与包含一种重组三聚流感血凝素胞外结构域或其部分或一种重组四聚流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分的免疫原性组合物相比较，可用于获得增强的抗流感病毒感染的保护作用。此外，或可选择地，通过利用多价组合物，可获得抗超过一种流感病毒类型或流感病毒亚型或株的更广泛的保护作用。此外，与常规灭活的流感病毒疫苗或活的减毒的流感病毒疫苗相比，根据本发明的免疫原性组合物对抗原的改变较不敏感。
根据本发明的免疫原性组合物的其它有利方面为，例如以相对低的成本在细胞培养物中大量产生重组多聚胞外结构域或其部分的可能性，因为高水平生物安全防范设施不是产生根据本发明的免疫原性组合物所必需的。
与先前产生基于重组流感病毒蛋白质的疫苗的努力不同，引发个体的免疫应答仅需极低量的根据本发明的融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白质或其部分的重组多聚胞外结构域或其部分。如在实施例中更详细地显示的，在白鼬中低至3. 75yg的重组蛋白质的量，在猪中低至5μ g的重组蛋白质的量和在鸡中低至O. 4μ g的重组蛋白质的量足以在用流感病毒攻击后在各自这些动物中弓I发保护性免疫应答。
可以以单个剂量或以多个剂量施用根据本发明的免疫原性组合物。然而，与基于重组流感蛋白质的其它疫苗不同，在施用根据本发明的免疫原性组合物一次后，获得抗流感病毒感染的保护作用。因此，根据本发明的免疫原性组合物比本领域已知的基于重组流感蛋白质的其它免疫原性组合物更有效。
Str印-标签不可能影响蛋白质融合、结构、折叠、分泌并且具有低免疫原性。此外， 在温和条件下可实现含strep-标签的蛋白质的洗脱。不受理论束缚，据信可能由于可在蛋白质纯化过程中使用的温和条件和从而蛋白质的抗原性的良好保存和免疫应答的更有效的引发，至少一个根据本发明的重组多聚胞外结构域与链霉抗生物素蛋白亲和标签的使用的组合导致本发明优于本领域已知的包含流感蛋白质的免疫原性组合物的有利方面。
在本发明的一些实施方案中，三聚化结构域(trimerizationdomain)用于提供三聚重组流感血凝素胞外结构域或其部分。如本文中所用，术语“三聚化结构域”被定义为，介导从3个单体蛋白质或其部分形成三聚体的结构域。适当的三聚化结构域包括但不限于， 来自卩遼菌体T4次要纤维蛋白(fibritin)的三聚化序列和基于酵母GCN4卷曲螺旋蛋白质的人造三聚化结构域(GCM-pII)。在优选实施方案中，由基于GNC4的三聚化结构域提供了重组流感血凝素胞外结构域或其部分的三聚化。所述基于GCN4的三聚化结构域优选包含氨基酸序列MKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK。
在本发明的一些实施方案中，将四聚化结构域(tetramerizationdomain)用于提供四聚重组流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分。如本文中所用，术语“四聚化结构域”被定义为，介导从4个单体蛋白质或其部分形成四聚体的结构域。适当的四聚化结构域包括但不限于，仙台病毒磷蛋白四聚化结构域和通过突变从酵母GCN4 二聚化结构域衍生的四聚化结构域(GCM-pLI)。在优选实施方案中，由基于GCN4的四聚化结构域提供重组流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分的四聚化。基于GCN4的四聚化结构域优选包含氨基酸序列 MKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE。
在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物包含佐剂和/或载体或本领域已知的其它赋形剂。“佐剂”在本文中定义为被添加至免疫组合物以增强个体在细胞或体液水平上对特定抗原的免疫应答的物质。适当的佐剂包括但不限于，铝和钙盐例如磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾(明矾)和磷酸钙、有机佐剂例如角鲨烯、油基佐剂例如完全和不完全弗氏佐剂、RIBI 佐剂系统@(11人3 )、Stimune (Specol) 、Ti terMax 、 Montanides、MF-59、AS 03、QS21、佐剂 65、皂苷、MDP 和 Syntex 佐剂制剂(SAF) 、单磷酰脂质A、Gerbu 佐剂、免疫刺激复合物(ISCOMs)、细胞因子例如干扰素-、、免疫刺激性核酸序列例如CpG寡核苷酸、脂质体、病毒样颗粒、表面活性剂例如十六烷基胺、多聚阴离子例如批喃和硫酸葡聚糖。优选佐剂为Stimune(Specol)。用于人的其它优选佐剂为磷酸招或氢氧化铝、磷酸钙、ISCOMs、AS03或MF59。
优选佐剂为ISCOMs。ISCOM技术具有优于其它佐剂的几个有利方面。ISCOMs刺激体液和细胞介导的免疫应答。ISCOMs为高效佐剂，其使得根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的量能够进一步减少。优选的ISCOMs为ISCOM Matrix-M0不受理论束缚，在根据本发明的方法或免疫原性组合物中使用ISCOMs，甚至能够增强本发明的优于本领域已知的包含流感蛋白质的免疫原性组合物的有利方面，例如根据本发明的免疫原性组合物的更低的施用剂量和减少的施用次数。
如本文中所用，“载体”或“支架”被定义为，能够与本文中定义的免疫原性组合物的任何组分缔合(用于所述组分的运输、至免疫系统的呈递和/或增强所述免疫原性组合物的免疫原性)的分子例如肽、多肽、蛋白质、蛋白质复合物或化合物。适当的载体或支架包括但不限于，生物学支架例如病毒、细菌、病毒样颗粒和细菌残留部分例如细菌壁骨架、 化学支架例如化学连接的链霉抗生物素蛋白单位或其衍生物的阵列、生物化学多价接头、 白喉或破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白(例如BSA)、血蓝蛋白、白蛋白、无毒突变型白喉毒素CRM197、来自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白质复合物(OMPC)、不耐热的大肠杆菌(Escherichia coli)的B亚基、从曬菌体Qb的重组衣壳蛋白质装配的病毒样颗粒和纤维素珠粒。
本发明还提供了包含含有编码信号序列的核酸序列、编码流感病毒蛋白质的重组胞外结构域或其部分的核酸序列、编码三聚化或四聚化序列的核酸序列以及编码链霉抗生物素蛋白亲和标签的核酸序列的表达盒的载体。
根据本发明的载体特别适用于根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的表达和产生。因此，在优选实施方案中，提供了根据本发明的载体用于制备根据本发明的免疫原性组合物的用途，所述免疫原性组合物用于引发抗流感病毒的免疫应答。还提供了用作疫苗的根据本发明的载体。
如本文中所用，术语“载体”被定义为，能够将异源核酸序列引入宿主细胞的核酸分子，例如质粒、噬菌体或动物病毒。根据本发明的载体允许由异源核酸序列编码的蛋白质或其部分在宿主细胞中表达或产生。适合于根据本发明的方法的载体包括但不限于 pCD5 (Pouyani和Seed, 1995)和pCAGGS (Niwa等人，1991)。“宿主细胞”为已被或能够被核酸分子例如载体转化的细胞。术语“转化”在本文中被定义为，外来核酸至受体细胞的引入。受体细胞的转化可导致所述细胞瞬时表达重组蛋白质，意味着重组蛋白质仅表达一段确定的时期。或者，受体细胞的转化可导致稳定的表达，意味着核酸被引入细胞的基因组， 从而被传递至细胞的下一代。此外，可获得重组蛋白质的诱导型表达。诱导型表达系统需要允许目标核酸序列的表达的分子的存在或不存在。诱导型表达系统的实例包括但不限于Tet-On和Tet-Off表达系统、激素诱导型基因表达系统例如蜕皮激素诱导型基因表达系统、阿拉伯糖诱导型基因表达系统以及使用包含诱导型金属硫蛋白启动子的pMT/BiP载体 (Invitrogen)的果蝇诱导型表达系统。
“信号序列”在本文中被定义为，指导蛋白质或其部分运输至真核细胞的内质网 (分泌途径的进入位点)的信号肽。信号序列可位于蛋白质或其部分的N末端或C末端。 信号肽可在蛋白质插入内质网后被切掉。例如，在一个实施方案中，用于在果蚬细胞中表达重组蛋白质的pMT/BiP载体包含BiP信号序列。在另一个实施方案中，用于在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的PCD5载体包含信号序列MPMGSLQPLATLYLLGMLVA。
表达盒优选包含允许起始包含在表达盒内的核酸序列的转录的启动子/增强子。 启动子的实例包括但不限于，用于在植物细胞中表达的RAmy3D和CaMV启动子、用于在昆虫细胞中表达的多角体蛋白、plO、IE-0, PCNA, 0plE2、OplEl和肌动蛋白5c启动子和用于在哺乳动物细胞中表达的肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、5S RNA启动子或病毒来源的启动子例如巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和猿猴病毒40 (SV40)启动子。优选的载体由用于在哺乳动物细胞中表达重组蛋白质的包含CMV启动子的pCD5表达载体提供。更优选的载体由用于在哺乳动物细胞中表达重组蛋白质的包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子的pCAGGS表达载体提供。
意欲用于表达三聚流感血凝素胞外结构域或其部分的根据本发明的表达盒优选从5’至3’包含编码信号序列的核酸序列；编码流感血凝素的重组胞外结构域或其部分的核酸序列；编码三聚化序列，优选基于GCN4的三聚化序列的核酸序列和编码链霉抗生物素蛋白亲和标签的核酸序列。意欲用于表达四聚流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分的根据本发明的载体优选从5’至3’包含编码信号序列的核酸序列；编码链霉抗生物素蛋白亲和标签的核酸序列；编码四聚化序列，优选基于GCN4的四聚化序列的核酸序列和编码流感血凝素的重组胞外结构域或其部分的核酸序列。
根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分例如在原核细胞或在真核细胞例如植物细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达。此外，根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分可在植物中表达。原核和真核细胞在本领域是公知的。原核细胞为例如大肠杆菌。植物和/或植物细胞的实例包括但不限于，玉米(细胞)、水稻(细胞)、浮萍(细胞)、烟草(细胞，例如BY-2或NT-I细胞)和马铃薯(细胞)。酵母细胞的实例为酵母菌属(Saccharomyces)酵母和毕赤酵母属(Pichia)酵母。昆虫细胞的实例包括但不限于，草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞例如Tn5、SF-9和SF-21细胞，以及果蝇细胞例如果蝇Schne ider 2(S2)细胞。适用于表达根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的哺乳动物细胞的实例包括但不限于，非洲绿猴肾(Vero)细胞、幼仓鼠肾(例如BHK-21)细胞、人视网膜细胞(例如PerC6细胞)、人胚胎肾细胞(例如HEK293细胞)、Madin Darby Canine肾(MDCK)细胞、鸡胚胎成纤维细胞(CEF)、鸡胚胎肾细胞(CEK细胞)、胚盘来源的胚胎干细胞(例如EB14)、小鼠胚胎成纤维细胞(例如3T3细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、 小鼠骨髓瘤(例如NSO和SP2/0)、鹌鹑肌细胞(QM5)以及此类细胞类型的衍生物。在优选实施方案中，哺乳动物HEK293T细胞或S2昆虫细胞用于产生根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分。
本发明还提供了用于制备根据本发明的免疫原性组合物的方法，包括提供根据本发明的载体，用所述载体转化宿主细胞，在培养基中培养所述宿主细胞，从而允许表达融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白质的重组多聚胞外结构域或其部分，以及分离所述融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白的重组多聚胞外结构域或其部分。
当使用用于在宿主细胞中表达根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的根据本发明的方法时，优选将所述多聚胞外结构域或其部分分泌入培养基，以及可从所述培养基分离所述多聚胞外结构域或其部分。所述多聚胞外结构域或其部分的分离例如通过离心或过滤培养基以除去细胞和细胞残留部分来进行，并且纯化可使用本领域已知的任何方法例如凝胶电泳或色谱法，例如亲和色谱法或高效液相色谱法来进行。在优选实施方案中， 使用融合的链霉抗生物素蛋白亲和标签，例如使用具有链霉抗生物素蛋白或Strep-Tactin Sepharose (IBAGermany)的纯化柱和用于从柱子置换Strep-标签蛋白的包含生物素或其衍生物或类似物的洗脱缓冲液来纯化根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分。
在一些实施方案中，根据本发明的载体来源于动物病毒例如但不限于痘苗病毒 (包括减毒衍生物，例如改良痘苗病毒Ankara，MVA)、新城疫病毒(NDV)、腺病毒或逆转录病毒。优选，用作根据本发明的载体的动物病毒是减毒的。此类载体的任一种特别适用于在其中意欲引发免疫原性应答的宿主中表达根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分。动物病毒例如NDV的使用的有利方面为，其可以以低成本和足够高的量在含胚鸡卵中有效生长。在优选实施方案中，在含胚鸡卵中繁殖动物病毒后，随后将分离的病毒用于感染真核细胞。随后将感染的细胞用于产生根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分。适用于表达根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的细胞的实例为上述哺乳动物细胞。在另一个优选实施方案中，在例如在含胚鸡卵中繁殖动物病毒后，将分离的病毒用于直接感染其中待引发免疫原性应答的宿主的细胞。利用根据本发明的载体感染其中待引发免疫原性应答的宿主的一个有利方面是，施用可以例如通过喷雾至动物上或喷雾至动物上方的空气中来非常高效地进行。因此本发明还包括包含根据本发明的载体和药学上可接受的稀释剂的免疫原性组合物。
用于根据本发明的免疫原性组合物的根据本发明的载体包含表达盒,所述表达盒含有适用于在期望的宿主细胞中起始转录的启动子。用于在禽类宿主中表达至少一个根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的适当的启动子的实例包括但不限于，禽类β_肌动蛋白启动子或鸡RNA pol I启动子。用于在哺乳动物宿主中表达至少一个根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的适当的启动子的实例包括但不限于，用于哺乳动物宿主的 β -肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、5S RNA启动子或病毒来源的启动子例如巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和猿猴病毒40 (SV40)启动子。
在一些实施方案中，编码根据本发明的重组胞外结构域或其部分的核酸序列可以例如通过核酸置换、缺失和/或添加来改变，所述改变使得能够表达功能上等同于根据本发明的重组多聚胞外结构域或其部分的蛋白质。功能上等同的蛋白质可通过本领域已知的任何方法，例如通过它们诱导个体的抗流感病毒的免疫应答的能力，或在其中测定对抗体的结合的体外测定中来进行鉴定。
在一些实施方案中，将编码三聚流感血凝素胞外结构域或其部分的核酸序列和/ 或编码四聚流感神经氨酸酶或其部分的核酸序列插入载体。在另一个实施方案中，将编码超过一个的三聚流感血凝素胞外结构域或其部分和/或四聚流感神经氨酸酶或其部分或其组合的核酸序列插入载体。在另一个实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物包含分离的载体，在每一个所述载体中插入了编码三聚流感血凝素胞外结构域或其部分，和/或四聚流感神经氨酸酶或其部分的核酸序列。
因此，可将例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种编码三聚血凝素胞外结构域或其部分的核酸序列组合入一个载体，例如编码 Η1、Η2、Η3、Η4、Η5、Η6、Η7、Η8、Η9、Η10、Hll、Η12、Η13、 Η14、Η15和/或Η16的核酸序列。或者，可将2、3、4、5、6、7、8或9种编码四聚神经氨酸酶胞外结构域或其部分的核酸序列组合入一个载体，例如编码NI、Ν2、Ν3、Ν4、Ν5、Ν6、Ν7、Ν8和 /或Ν9的核酸序列。此外，根据本发明的免疫原性组合物可包含一种或多种编码不同流感亚型的三聚血凝素胞外结构域或其部分的核酸序列和一种或多种编码不同流感亚型的四聚神经氨酸酶胞外结构域或其部分的核酸序列的组合。例如，可组合1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10种编码三聚血凝素胞外结构域或其部分的核酸序列和1、2、3、4、5、6、7、8或9种编码四聚神经氨酸酶胞外结构域或其部分的核酸序列，例如Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、 H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 和 / 或 N9。本领域技术人员清楚，术语“一个或多个胞外结构域”包括来自一种或多种流感病毒亚型例如甲型流感病毒和乙型流感病毒的一个或多个胞外结构域。这样，根据本发明的免疫原性组合物可包括多价组合物，利用其可获得抗超过一个流感病毒类型或流感病毒亚型或株的更广泛的保护作用。此外，与常规灭活的流感病毒疫苗或活的减毒的流感病毒疫苗相比，此类免疫原性组合物对抗原改变较不敏感。
本发明还提供了用于引发个体的抗流感病毒的免疫应答的方法，包括给所述个体施用根据本发明的免疫原性组合物。
在下列实施例中进一步解释本发明。这些实施例不限制本发明的范围，而仅用于阐明本发明。
图I.流感病毒的示意图。
图2.重组可溶性三聚H5蛋白的表达、纯化和生物学活性。(A)使用的H5表达盒的图示。符合读框地克隆在CMV启动子的控制下的H5胞外结构域编码序列(H5)与编码信号肽(SP)、GCN4异亮氨酸拉链三聚化基序(GCN4)和Str印-标签II (ST)的DNA序列。(B)通过SDS-PAGE和蛋白质印迹来分析H5的表达和至培养基中的分泌。使用小鼠抗-Strep-标签抗体检测重组蛋白。(C)利用凝胶过滤的纯化的重组H5蛋白的分析。显示了使用Superdex200GL 10-300柱产生的H5蛋白的洗脱图。232kDa过氧化氢酶对照的洗脱由虚线显示。(D)在其用于胎球蛋白结合测定之前，用缀合有HRP的针对strep-标签的小鼠抗体复合重组可溶性H5三聚体。还在用霍乱弧菌(Vibrio Cholera)来源的神经氨酸酶处理胎球蛋白(胎球蛋白+VCNA)之后评估HA结合。
图3.鸡的可溶性血凝素(sHA)接种。利用IOug sHA免疫一组10只SPF鸡2次 (在第O天和第21天)。作为攻击对照，对一组鸡进行模拟处理(PBS)。第2次接种后3周， 利用IO5 TCID5tl的H5NlA/Vietnam/1203/04攻击所有鸡，每天监测其临床体征直至p. i.第 14天。A)Kaplan-Meier存活曲线,显示每一个组的每一天的百分比死亡率。B)在第一次免疫后3周(第21天)，第二次接种后3周(第42天)和攻击后2周(第56天)收集血液样品。对每一只鸡的血清中的HI抗体滴度作图。条块表示每一组的几何平均值。虚线显示与该实验中的保护作用相关的最低抗体水平。
图4.鸡的s HA接种。以3周的间隔利用10、2或O. 4 μ g sHAi. m.免疫7组WHL 鸡(每组10只)1或2次。作为攻击对照，对一组进行模拟处理(PBS)。接种后4周，利用IO5TCID5tl的A/Vietnam/1203/04攻击所有鸡，在14天的过程中每天监测其临床体征。 Kaplan-Meier存活曲线显示被接种一次(A)或二次(B)的每一个组的每一天的百分比死亡率。
图5. 2009A(HlNl)流感病毒的纯化的可溶性多聚HA(sHA)和NA(sNA)蛋白的表达和分析。A)重组表达的sHA和sNA亚基的图示。sHA:HA胞外结构域(a. a. 17-522)与 N末端⑶5信号序列和C末端三聚(GCN4-pII)GCN4结构域和strep-标签(ST) —起表达。 sNA:NA头部结构域(a. a. 75-469)与N末端CD5信号序列、OneSTrEP(OS)和四聚(GCN4-pLI)GCN4结构域一起表达。⑶亲和纯化的sHA和sNA蛋白的考马斯蓝染色的还原性SDS-PAGE。 (C)纯化的 sHA 和 sNA 蛋白分别在 Superdex 200 16/600 和 Superdex 200 10/300 柱上的凝胶过滤层析。虚线显示校准标准(calibration standard)(铁蛋白，440kDa;过氧化氢酶，232kDa)的偏移。主峰的表观分子量为288kDa (对于sHA)和291kDa (对于sNA)，分别与sHA和sNA的三聚和四聚寡聚状态相关。
图6.接种后白鼬的针对2009A(H1N1)流感病毒的抗体的诱导。在第O天和第 21 天接受使用 3.75yg HA+3. 75 μ g NA,3. 75 μ g HA 和佐剂(Iscoms Matrix M;[IMM])、3.75 μ g NA+IMM、3. 75 μ g HA+3. 75 μ g NA+IMM、PBS 或 IMM 的免疫的白鼬的血清的(A)血细胞凝集抑制滴度(HI)、(B)神经氨酸酶抑制滴度(NI)和(C)病毒中和滴度(VN)，如所指示的。显示了几何平均滴度；误差棒表示SD。显示了统计上显著的差异*，P〈0.05。
图7.用2009A (HlNl)流感病毒接种的白鼬的动物体重和肺病理学。利用3. 75 μ g HA+3. 75 μ g NA,3. 75 μ g HA 和佐剂(Iscoms MatrixM; [IMM])、3· 75 μ g ΝΑ+ΙΜΜ、3· 75 μ g ΗΑ+3. 75 μ g NA+IMM、PBS或I丽(如所指示的)免疫6组白鼬(每组6只)两次。在第56 天用IO6TCID5tl的病毒鼻内接种动物。(A)接种的动物的体重减轻显示为感染前体重(100%) 的百分比。(B)肺重量显示为体重的百分比，作为肺实变的指标。(C)肉眼观察肺，给显示坏死性损伤的肺面积百分比评分。显示了几何平均滴度；误差棒表示SD。显示了统计上显著的差异*，Ρ〈0· 05;**，Ρ〈0· 01。
图8.接种的白鼬的肺、鼻和咽喉中2009Α(Η1Ν1)流感病毒的脱落。⑷在用 2009Α(HlNl)流感病毒感染后4天，在用3.75 μ g HA+3. 75 μ g NA,3. 75 μ g HA和佐剂 (Iscoms Matrix M; [IMM]) ,3. 75 μ g ΝΑ+ΙΜΜ、3· 75 μ g HA+3. 75 μ g NA+IMM、PBS 或 IMM(如所指示的)免疫的白鼬中的肺病毒滴度。(B和C)病毒从接种的动物的鼻和咽喉脱落。在接种后第4天收集拭子。通过MDCK细胞的终点滴定测定病毒滴度。给出了几何平均滴度； 误差棒显示标准差。显示了统计上显著的差异***，P〈0. 001。
图9.在用2009A (HlNl)流感病毒的sHA和sNA接种后白鼬的交叉中和抗体的诱导。㈧在血凝素抑制(HI)测定中测试接受sHA或sHA+sNA和佐剂(Iscorns Matrix Μ; [IMM])的双免疫的白鼬的血清的针对不同流感病毒分离株(包括A/ Swi ne/shope/1/56、A/Italy/1443/76、A/NL/386/86、A/Iowa/15/30、A/NL/25/80、A/ NewYersey/8/76、A/PR/8/34和IVR/148流感HlNl病毒)的HI抗体。显示了几何平均滴度；误差棒表示SD。(B)汇集接受sNA或sHA+sNA和佐剂的单或双免疫的白鼬的血清，在神经氨酸酶抑制(NI)测定中测试所述血清的针对A/Kentucky/UR06-0258/2007 (HlNl)和A/ turkey/Turkey/1/2005 (H5N1)流感病毒的 NA 的 NI 抗体。将 A/California/04/2009 (HlNl) 的 NA 用作阳性对照。特异于 A/NL/602/09 (HlNl)或 A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1)流感病毒的阳性对照血清获自用此类病毒感染的白鼬。显示了两次重复的平均滴度；误差棒表示SD0
图10. A.流感病毒A/California/04/2009 (HlNl)的血凝素(HA)胞外结构域 (a. a. 17-522)。B.流感病毒A/California/04/2009 (HlNl)的神经氨酸酶(NA)头部结构域 (a. a. 75-469)。
图ll.rNDV-HA载体病毒的产生和HA和sH53的表达。A)编码流感HA蛋白的 PFL-HertsAPBC构建体的图示。通过定点诱变引入XbaI和PmeI限制性位点以使得能够插入含有NDV末端-起始转录信号的接头。将编码未修饰的H5 HA基因或可溶性sH53蛋白(后者由融合至三聚化序列GCN4的H5HA胞外结构域组成)的基因各自插入接头序列的下游。B) HA在QM5细胞单层中的表达。模拟感染或用wt NDV Herts (显示为wt NDV)、 rNDV-H5HA或rNDV_sH53 (分别显示为NDV-H5和NDV_sH53)感染细胞，并使用特异性抗体针对HA和F蛋白对细胞进行染色。C)由rNDV-sH53-感染的细胞产生和分泌sH53。在胰蛋白酶不存在的情况下以3的MOI用rNDV-sH53感染QM5细胞，在接种后2天收获上清液。使用 Strep-tactin琼脂糖珠粒从上清液纯化sH53蛋白。将纯化产物经历SDS-PAGE电泳，利用 Blue染色剂对蛋白质进行染色。平行地运行在HEK 293S细胞中表达的sH53蛋白和一系列 BSA稀释物。D)从rNDV-sH53-感染的QM5细胞回收的sH53表达产物的Blue非变性PAGE 分析。显示了在电泳之前加热样品之后观察到的HA蛋白的三聚体和单体形式在凝胶中的位置。
图12.用NDV-H53接种鸡后的保护。A. Kaplan-Meier存活曲线显示肌内(i. m.) 接种的鸡的存活率(%)。B.攻击后观察到的基于临床体征计算的临床指数(如材料和方法中描述的)。
图13.用NDV-H53接种鸡后的血清学应答。在通过i. m.途径接种后第21天收集的血清样品中测量的抗流感(A)和NDV Herts (B)的血细胞凝集抑制(HI)抗体滴度。滴度表示为，显示HI的最高血清稀释度的倒数。虚线表示检测的下限。低于检测限的滴度被赋予2或4的值。每一个圆圈代表，每一只鸡的一次HI测量(对于抗禽流感(Al)的HI抗体的检测)和每一只鸡的2次测量(在NDV HI抗体检测的情况下)。水平线表示每组的几何平均滴度。实施例
实施例I
材料和方法
基因和表达载体
基于H3编号，由GenScript USA Inc.使用人优选密码子合成编码相应于来自A/ Viet Nam/1203/2004 (H5N1)的 HA (Genbank 登录号 ABW90137. I)的残基 18 至 523 的氨基酸残基的cDNA克隆。将编码HA胞外结构域的cDNA克隆入pCD5表达载体以在哺乳动物细胞中高效表达(Zeng等人，2008)。已修饰了 p⑶5载体，以便符合读框地克隆编码HA的cDNA 与编码信号序列、GCN4异亮氨酸拉链三聚化基序(ELIKRMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKIK LVPRGSLE ； (Pancera 等人，2005)和 Str印-标签 II (WSHPQFEK; IBA, Germany)的 DNA 序列。
蛋白质表达和纯化。以1:5的比率(μ g PEI: μ g DNA)使用聚乙烯亚胺(PEI)将包含编码HA胞外结构域的序列的P⑶5表达载体转染入HEK293S GnTI (-)细胞(Reeve s等人，1999)。在转染后6小时,用补充有碳酸氢钠(3. 7g/升)、葡萄糖(2. Og/升)>Primatone RL-UF (3. Og/ 升,Kerry Bio-Science, Zwi jndrecht, The Netherlands)、青霉素(100 单位 /ml)、链霉素(100 μ g/ml)、glutaMAX(Gibco)和 I, 5%DMS0 的 293SFM II 表达培养基 (Invitrogen)替代转染混合物。在转染后5_6天收获组织培养上清液。通过十二烧基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),然后使用小鼠抗-Strep-标签抗体(IBA, Germany) 的蛋白质印迹来确认HA蛋白质的表达和分泌。按照制造商的说明书(IBA, Germany)使用Strep-tactin琼脂糖珠粒纯化分泌的HA蛋白质。按照制造商的说明书，使用Nanodrop 1000分光光度计(IsogenLife Sciences)测定纯化的蛋白质的浓度。
重组HA的生物学表征。使用 Superdex200GL 10-300 柱(U-ProteinExpress),通过分析洗脱图测定HA蛋白的寡聚状态。使用胎球蛋白固相测定(Lambre等人，1991)评估可溶性HA三聚体(sHA3)的功能性。将I μ g/ml胎球蛋白/孔用于包被96孔nunc maxisorp 板。如图例中显示的，用霍乱弧菌来源的神经氨酸酶(VCNA)处理胎球蛋白，然后进行充分的洗涤步骤。在于胎球蛋白包被的板上温育有限稀释物(60分钟，室温[RT])之前，sHA3用辣根过氧化物酶(HRP)连接的抗-Str印-标签抗体(2:1的摩尔比)在0°C下预复合30分钟。随后使用四甲基联苯胺底物(BioFX)在ELISA读数器(EL-808 [BioTEK])中检测HA-结合，读取450nm处的0D。
在鸡中讲行的梓种_攻击实齡
使用6周龄的SPF白色来亨鸡(Lohmann)。将鸡在Bsl_3条件下关养在空调室中。在第一个实验中，通过肌内注射(O. 5mL)以Stimune (ID-Lelystad, Lelystad, The Netherlands)为佐剂的10 μ g sHA3来免疫一组10只鸡2次(在第O天和第21天)。作为攻击对照，一组10只鸡接受等体积的在Stimune中的PBS(模拟接种)。接种后3周，通过用 IO5 TCID50 的 A/Vietnam/1194/04 病毒(O. Iml，鼻内(i. η.)和 O. Iml，气管内(i. t.), UniProt Taxonomy ID:284217)感染来攻击鸡，并在14天的时期中监测鸡的疾病征兆。在每一次免疫后3周(第21天和第42天)和在感染后(p. i.) 14天收集血液样品。在感染后第2、4和7天从每一只鸡获取气管和泄殖腔拭子。
在下一个实验中，使用购自当地育种者的总共70只一天龄蛋鸡(白色来亨鸡)。 按照农场惯例在I天龄时针对NDV (新城疫病毒)和IBV (感染性支气管炎病毒)接种鸡。 在6周龄时，将鸡运至生物安全水平(Bsl-) 3设施，然后分配至7个实验组，每组10只鸡。 通过在第21天单次肌内注射10、2或O. 4μ g sHA3抗原或以相同剂量肌内注射2次(在第 O天和第21天)而免疫6个组。作为攻击对照，利用在Stimune中的PBS模拟接种(在第 O天和第21天)一组10只鸡。接种后4周(第49天)，如上攻击鸡，并在14天的时间过程中每天观察鸡的临床体征。在接种之前，在第一次(第21天)和第二次(第49天)接种之后以及在感染后第14天采集血液样品。在如上所述的相同日期内采集气管和泄殖腔拭样。
病毒检测测定
将气管和泄殖腔拭子忙存在冷胰蛋白□肉汤培养基(tryptosebroth medium)中。 通过低速离心澄清培养基，收获上清液，将其等分并且于-70°C下贮存。在冷冻-解冻后，将在同一天从相同鸡采集的气管和泄殖腔拭子样品混合。提取RNA，使用针对Ml基因(编码流感病毒基质蛋白质)的定量RT-PCR测定法(Taq Man PCR)测定病毒RNA的存在。首先， 使用引物 5’ -CACTGGGCACGGTGAGC-3’ 合成 cDNA，随后在 TaqMan 荧光探针 5’ -6FAM-TCAGGCC CCCTCAAAGCCGA-X-ph 存在的情况下，通过使用引物 5’ -CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3’ 作为反向引物进行45个循环的Light Cycler PCR来扩增Ml基因的部分。平行地测试阴性和阳性对照样品。检测的下限经测定为约500 TCID500 一些样品给出不确定的结果，这意味着它们在超过31个循环后仅给出极弱的信号(荧光〈O. 07)。
血细胞凝集抑制测定
按照标准方法，利用1%的鸡红细胞和4HAU (血凝单位)的A/Vietnam/1194/04测试来自鸡血样品的热灭活的免疫血清的HI活性。红色扣状体(button)的形成被评定为血细胞凝集的证据。抗体滴度表示为显示HI的最高血清稀释度的倒数。结果H5三聚体的表达、纯化和表征为了在哺乳动物细胞中表达可溶性三聚HA胞外结构域(sHA3)，首先将编码H5胞外结构域的序列克隆入适当的表达载体。在使用的PCD5载体中，HA序列之前为信号肽编码序列(以允许重组蛋白质高效分泌)，之后为编码GCN4异亮氨酸-拉链三聚化基序的序列(Pancera等人，2005)和Strep-标签II (图2A)。通过将表达质粒瞬时转染入HEK细胞来实现HA胞外结构域的表达。通过将细胞培养物上清液经历凝胶电泳，然后使用针对Strep-标签II的抗体的蛋白质印迹来验证HA蛋白的表达和分泌(图2B)。结果显示,可在用表达质粒转染细胞后而非在模拟转染后在细胞培养物上清液中容易地检测到重组HA蛋白。通过使用Strep-tactin琼脂糖珠粒在单步骤方案中纯化分泌的HA蛋白。蛋白质产率为O. 4-lmg重组蛋白每IOOml细胞培养基。在从细胞培养物上清液纯化H5蛋白后，利用Superdex200凝胶过滤柱层析分析H5蛋白的寡聚状态(图2C)。大部分HA蛋白以寡聚体(推定地三聚体)的速率洗脱，而仅少量级分在外水体积(void volume)中被发现为聚集体。使用蓝-非变性凝胶电泳确认H5寡聚体的三聚体性质。利用唾液酸化的(sialidated)血液糖蛋白胎球蛋白，使用固相结合测定研究纯化的H5蛋白的生物学活性。利用缀合有HRP的抗-Str印-标签II抗体测量HA的结合，如材料和方法部分中详述的。H5制剂显示了对胎球蛋白的浓度依赖性结合。该结合为唾液酸依赖性的，因为当用VCNA处理胎球蛋白时，未观察到结合(图2D)。综上所述，生物学活性、可溶性三聚H5在哺乳动物细胞中高效地产生，并且易于纯化。sHAa疫苗在鸡中抗致死H5N1感染的功效为了评估sHA3在鸡中的保护性功效，用10 μ g以Stimune为佐剂的sHA3肌内(i.m.)接种10只鸡两次(第O天和第21天)，并且3周后，通过鼻内(i.n.)/气管内(i. t.)接种致死剂量的H5N1A/Vietnam/1194/04病毒进行攻击。此外，对10只鸡进行模拟接种以用作攻击对照。如图3中所显示的，利用IOug sHA3的接种能够产生完全的保护作用。没有一只接种的鸡死亡或显示指示流感相关疾病的症状，而所有模拟接种的鸡在2天内死亡。血液样品的血清学分析显示，所有模拟接种的鸡具有低于检测限的滴度。HI抗体滴度在sHA3加强后增加至最大1024。在加强后观察到的最低HI滴度为64，该滴度显然足以保护动物免受致死攻击。有趣地，50%的鸡在第一次接种后3周已产生了等于64或更高的HI抗体滴度。这些结果激励我们评估赋予保护作用所需的最小sHA3剂量，和检查利用sHA3的单次剂量是否也可具有保护性。在第二个接种-攻击实验中，利用10、2或O. 4ug sHA3接种鸡2次或通过单次注射来接种鸡，并且如上所述，在4周后通过感染致死剂量的A/Vietnam/1194/04来攻击鸡。利用O. 4ug剂量的sHA3的加强接种足以保护90%的鸡免受死亡，然而当施用2或10 μ g的加强接种时，所有鸡都存活(图4B)。此外，结果显示，利用sHA3的单次接种足以保护鸡免受致死感染；当给予2 μ g的剂量时，仅一只鸡死亡，而10 μ g的剂量对于所有鸡都具有保护性。甚至Ojyg的单次剂量也能够保护60%的鸡免于死亡。所有接受模拟疫苗(PBS)的鸡在2天内死亡。我们还分析，利用sHA3的接种是否减少或阻止病毒脱落。为此目的，在感染后第2、4和7天从来自图4显示的实验的已接种并且被攻击的鸡获得气管和泄殖腔拭子。将在同一天从相同鸡取样的气管和泄殖腔拭子混合在一起，通过使用检测Ml基因的定量RT PCR测定法来分析病毒RNA在混合的拭子中的存在。结果示于表I中。在接受利用HA抗原的加强接种的鸡中，仅2只鸡(两者均接受最少量的抗原)被测试为阳性。未在任何其它鸡中观察到病毒脱落，虽然3个拭子给出不确定的结果。同样地，当鸡仅接受一次接种时，显示大部分鸡都不脱落任何病毒。在接种IOyg sHA3后，在感染后第4天和第7天没有一只鸡脱落病毒。结果显示，病毒脱落的不存在与鸡被保护免受HPAIH5N1的致死攻击相关。
权利要求
1.一种免疫原性组合物，其包含至少一种融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白的重组多聚胞外结构域或其部分，和药学上可接受的稀释剂。
2.权利要求I的免疫原性组合物，其中所述流感病毒蛋白的重组多聚胞外结构域或其部分选自重组三聚流感血凝素胞外结构域或其部分和重组四聚流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分。
3.权利要求2的免疫原性组合物，其中重组流感血凝素胞外结构域或其部分的三聚化由基于GCN4的三聚化结构域提供。
4.权利要求2的免疫原性组合物，其中重组流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分的四聚化由基于GCN4的四聚化结构域提供。
5.权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，还包含载体和/或佐剂。
6.一种包含表达盒的载体，所述表达盒包含a)编码信号序列的核酸序列；b)编码流感病毒蛋白的重组胞外结构域或其部分的核酸序列；c)编码三聚化或四聚化序列的核酸序列，和；d)编码链霉抗生物素蛋白亲和标签的核酸序列。
7.一种免疫原性组合物，其包含权利要求6的载体和药学上可接受的稀释剂。
8.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述载体为病毒载体，例如新城疫病毒衍生的载体。
9.权利要求1_5、7和8中任一项的免疫原性组合物，其用作疫苗。
10.权利要求6的载体在制备用于引发针对流感病毒的免疫应答的免疫原性组合物中的用途。
11.一种用于制备权利要求1-5中任一项的免疫原性组合物的方法，包括a)提供权利要求6的载体；b)用所述表达载体转化宿主细胞；c)在培养基中培养所述宿主细胞，由此允许表达融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白的重组多聚胞外结构域或其部分；d)分离所述融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白的重组多聚胞外结构域或其部分，从而制备免疫原性组合物。
12.权利要求11的方法，其中使用所述链霉抗生物素蛋白亲和标签来分离所述融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的流感病毒蛋白的重组多聚胞外结构域或其部分。
13.一种用于引发个体的抗流感病毒的免疫应答的方法，包括给所述个体施用权利要求1-5中任一项的免疫原性组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述个体为哺乳动物或鸟类。
全文摘要
本发明涉及免疫原性组合物，其包含融合至链霉抗生物素蛋白亲和标签的重组多聚流感蛋白或其部分，优选重组三聚流感病毒血凝素和/或重组四聚流感病毒神经氨酸酶，或包含编码此类流感蛋白的核酸序列的载体。本发明还涉及用于制备此类免疫原性组合物的方法及其用途，以及用于引发个体的免疫应答的方法。
文档编号C07K14/11GK102939102SQ201180025123
公开日2013年2月20日 申请日期2011年4月8日 优先权日2010年4月9日
发明者P·J·M·罗特尔, B·J·博世, C·A·M·德汉 申请人:乌得勒支大学控股有限责任公司