抗多聚遍在蛋白抗体及使用方法

专利名称：抗多聚遍在蛋白抗体及使用方法
抗多聚遍在蛋白抗体及使用方法
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本发明涉及抗多聚遍在蛋白(polyubiquitin)抗体领域,更具体的说就是不特异性结合单遍在蛋白(monoubiquitin)且对特定赖氨酸连接形式的多聚遍在蛋白特异性的抗多聚遍在蛋白抗体，及其使用方法。
发明背景
遍在蛋白(ubiquitin)是一种在诸多细胞途径中具有重要调节作用的小蛋白质。 经由第11位赖氨酸(Kll)连接的遍在蛋白链已经鉴定为细胞分裂的重要调节物(Jin et al. ,2008 ；Kirkpatrick et al. , 2006),而且已经与遍在蛋白连接酶后期促进性复合物 (APC/C)底物的降解信号传导，即真核细胞分裂中的一个关键步骤联系起来(Jin et al.， 2008 ；ffiIliamson et al.，2009)。APC/C募集两种E2酶，即启动遍在蛋白链的UbcHlO和延长链的Ube2S,它们以高特异性装配Kll连接的链(Garnett et al. ,2009 ；ffilliamson et al.，2009 ；ffu et al.，2010)。这种APC/C特异性E2模块的Loss导致有丝分裂行进的缺陷 (Williamson et al. , 2009 ；Song and Rape, Molecular Cell in press)。虽然这些结果提示KlI连接的链在有丝分裂期间驱动蛋白酶体对蛋白质的降解，但是由APC/C、UbcH10和 Ube2S装配的遍在蛋白链的表征很大程度上依赖于体外实验。缺乏Kll连接的多聚遍在蛋白链在细胞中调节蛋白质降解的直接证据，原因就在于缺乏可用于直接检测它们的工具。
发明概述
本发明提供抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体及其使用方法。在一个实施方案中， 本发明提供一种特异性结合包含Kll赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白，其中该第二赖氨酸连接不同于Kll赖氨酸连接。在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合包含Kll赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白和包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白二者的分离的抗体， 其中该第二赖氨酸连接不同于Kll赖氨酸连接，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白，且其中该抗体以与该抗体对该第一多聚遍在蛋白的结合亲和力相比实质性降低的结合亲和力结合第二多聚遍在蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合赖氨酸-Ii连接的多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。一方面，抗体包含至少一个高变 (HVR)序列，该序列选自SEQ ID NO 2和57—60任一的HVR-LU SEQ ID NO 3和61任一的HVR-L2、SEQ ID NO :4 的 HVR_L3、SEQID NO :6_11 任一的 HVR_H1、SEQ ID N0:12_17 和 67 任一的HVR-H2、和SEQID NO : 18-23、68和69任一的HVR-H3。另一方面，抗体包含至少一个选自HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-Hl包含氨基酸序列Xl X2X3 X4 He X5 (SEQ ID NO 24)，其中氨基酸Xl选自丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X2选自天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸，氨基酸X3选自酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X4选自色氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和酪氨酸，而氨基酸X5选自丝氨酸和组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列X6 X7 Ile X8 ProX9 Gly XlO Thr Xll (SEQ ID NO :25)，其中氨基酸X6选自甘氨酸和丙氨酸，氨基酸 X7选自天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸和缬氨酸，氨基酸X8选自丝氨酸、酪氨酸和天冬酰胺，氨基酸X9选自天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸和天冬酰胺，氨基酸XlO选自酪氨酸和丝氨酸，而氨基酸Xll选自酪氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；且其中HVR-H3包含氨基酸序列X12 X13 X14 X15 X16X17 X18 X19 X20 X21 Asp (SEQ ID NO :26)，其中氨基酸 X12 选自精氨酸和赖氨酸，氨基酸X13选自谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，氨基酸X14选自丝氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸，氨基酸X15选自色氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X16选自色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X17选自丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸，氨基酸X18选自丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甘氨酸、或不存在，氨基酸X19选自色氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸、或不存在，氨基酸X20为缬氨酸或不存在，而氨基酸X21 选自甲硫氨酸和苯丙氨酸。
另一方面，抗体包含至少一个选自HVR-Ll、HVR-L2的序列，其中HVR-Ll包含氨基酸序列X22 X23 Ser X24· X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 (SEQ ID NO :73)，其中氨基酸X22 选自精氨酸和甘氨酸，氨基酸X23选自丙氨酸和缬氨酸，氨基酸X24选自谷氨酰胺和组氨酸，氨基酸X25选自天冬氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸，氨基酸X26选自亮氨酸和缬氨酸，氨基酸X27选自丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸，氨基酸X28选自苏氨酸和丝氨酸，氨基酸 X29选自丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X30选自缬氨酸和异亮氨酸，而氨基酸X31选自丙氨酸和丝氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列X32 X33 X34 Phe X35 Tyr Ser (SEQ ID NO 74)，其中氨基酸X32选自丝氨酸和天冬酰胺，氨基酸X33选自谷氨酰胺和丙氨酸，氨基酸X34选自谷氨酸和丝氨酸，而氨基酸X35选自亮氨酸和缬氨酸。权利要求3的抗体，包含至少一个选自HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-H2包含氨基酸序列X36 He AsnPro X37 Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO :75),其中氨基酸X36选自丙氨酸和甘氨酸而氨基酸X37选自丙氨酸和天冬酰胺；且其中HVR-H3包含氨基酸序列 Glu Trp Tyr X38 X39 Gly Tyr Val Met Asp Tyr (SEQ ID NO :76)，其中氨基酸X38选自苯丙氨酸和酪氨酸而氨基酸X39选自甘氨酸和天冬氨酸。
另一方面，抗体包含HVR-Ll序列 SEQ ID NO :2、HVR_L2 序列 SEQ IDNO :3、和 HVR-L3 序列SEQ ID NO :4。另一方面，抗体包含与图IB中克隆A3、A6、A9、B5、F5或G3所列HVR-H1、 HVR-H2、和HVR-H3序列对应的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。另一方面，抗体包含与图 4A 中克隆 1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6 或 2G4 所列 HVR-LU HVR-L2、和 HVR-L3 序列对应的HVR-LU HVR-L2、和HVR-L3序列。另一方面，抗体包含与图4B中克隆1A11、1C12、 1F12、2A3、2A6、2E6 或 2G4 所列 HVR-H1、HVR-H2、和 HVR-H3 序列对应的 HVR-H1、HVR-H2、和 HVR_H3 序列。
另一方面，抗体包含HVR-Ll 序列 SEQ ID NO :2、HVR_L2 序列 SEQ IDNO :3、HVR_L3序列 SEQ ID NO :4、HVR-Hl 序列 SEQ ID NO :11、HVR-H2 序列 SEQ ID NO 17 和 HVR-H3 序列 SEQ ID NO 23o 另一方面，抗体包含 HVR-Ll 序列 SEQ ID NO :58、HVR-L2 序列 SEQ ID NO :3、HVR-L3 序列 SEQID NO :4、HVR_H1 序列 SEQ ID NO :11、HVR_H2 序列 SEQ ID NO 17 和 HVR-H3 序列 SEQ ID NO :23。另一方面，抗体包含 HVR-Ll 序列 SEQ ID NO :59、HVR-L2 序列 SEQ ID NO :3、HVR-L3 序列 SEQ ID NO :4、HVR-Hl 序列 SEQ ID NO :11、HVR-H2 序列 SEQ ID NO 17 和 HVR-H3 序列 SEQ ID NO :23。另一方面，抗体包含 HVR-Ll 序列 SEQ ID NO :2、 HVR-L2 序列 SEQ ID NO :3、HVR_L3 序列 SEQ ID NO 4, HVR-Hl 序列 SEQ ID NO :11、HVR_H2 序列SEQID NO 67和HVR-H3序列SEQ ID NO :23。另一方面，抗体包含HVR-Ll序列SEQ ID NO :58、HVR-L2 序列 SEQ ID NO :3、HVR_L3 序列 SEQ ID NO 4,HVR-Hl 序列 SEQ ID NO :11、 HVR-H2 序列 SEQ ID NO 67 和 HVR-H3 序列 SEQ ID NO :23。另一方面，抗体包含 HVR-Ll 序列 SEQ ID NO :59、HVR-L2 序列 SEQ ID NO :3、HVR-L3 序列 SEQ ID NO :4、HVR-Hl 序列 SEQ ID NO :11、HVR-H2 序列 SEQ ID NO :67、和 HVR-L3 序列 SEQ ID NO :23。
另一方面，抗体包含选自SEQ ID NO :5和62_66的轻链氨基酸序列。另一方面，抗体包含选自SEQ ID NO 27-32和70-72的重链氨基酸序列。
另一方面，抗体包含与下述序列组合之一的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的轻链和重链氨基酸序列SEQ I D NO 5和32 ；SEQ ID NO 63和32 ；SEQ ID NO 65和32 ； SEQ ID NO 5 和 72 ；SEQ ID NO 63 和 72 ;及 SEQ ID NO 65 和 72。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体，其中该抗体与任一前述抗体结合Kll连接的多聚遍在蛋白上相同抗原决定簇，且其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供一种与任前述抗体竞争对多聚遍在蛋白的结合的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供任何前述分离的抗体，其中该抗体特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质。在另一个实施方案中，本发明提供任何前述分离的抗体，其中该抗体调控至少一种由多聚遍在蛋白介导的信号传导途径。
在一个一般方面，任何上述抗体是单克隆抗体。在另一个一般方面，任何上述抗体是人抗体。在另一个一般方面，任何上述抗体是人源化抗体。在另一个一般方面，任何上述抗体是嵌合抗体。在另一个一般方面，任何上述抗体是结合Kll连接的多聚遍在蛋白的抗体片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，其编码任何上述抗体。在另一个实施方案中，本发明提供一种载体，其包含编码任何上述抗体的分离的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含编码任何上述抗体的分离的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含载体，该载体包含编码任何上述抗体的分离的核酸。
在另一个实施方案中，本发明提供一种生成任何上述抗体的方法，包括在该抗体生成的条件下培养上文所述宿主细胞。一方面，该方法进一步包括自宿主细胞回收抗体。另一方面，该方法进一步包括纯化抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种免疫缀合物，其包含任何上述抗体和细胞毒剂。在另一个实施方案中，本发明提供一种药物配制剂，其包含任何上述抗体和药学可接受载体。一方面，该药物配制剂进一步包含别的治疗剂。在一个此类方面，该别的治疗剂为化疗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供作为药物使用的任何上述抗体。在另一个实施方案中，本发明提供在治疗细胞周期相关疾病或病症中使用的任何上述抗体。一方面，细胞周期相关疾病或病症选自与异常升高的细胞周期行进(cell cycle progression)有关的疾病或病症和与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症。在一个此类方面，与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症是癌症。在另一个此类方面，与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症选自变性肌肉病症(degenerative muscle disorder)和变性神经病症(degenerative nerve disorder)。
在另一个实施方案中，本发明提供任何上述抗体在制备药物中的用途。一方面，药物用于选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症。在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗具有选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症的个体的方法，包括对个体施用有效量的任何上述抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种测定怀疑含有多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的存在的方法，包括使该样品暴露于至少一种前述抗体并测定该至少一种抗体对该样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化 的蛋白质的结合。在另一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的Kll连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质与非Kll连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质分开的方法，包括使该样品与至少一种前述抗体接触。在另一个实施方案中，本发明提供一种测定细胞或样品中 Kll连接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该细胞或样品与至少一种前述抗体接触并评估所述接触步骤对该细胞或样品的影响。
附图简述
图IA和IB描绘实施例I中获得的Fab的轻和重链氨基酸序列。图IA描绘自未免疫种类的VH文库分离的克隆的轻链序列。由于文库设计，对于所有获得的克隆，轻链的序列是相同的。图IB描绘自未免疫VH文库种类分离的克隆的重链序列比对。为每一个克隆标示了自第3轮和第4轮分选鉴定的同胞克隆的数目。在图IA和IB中，为每一个克隆以带框的区域标示了 HVR序列，第一个框标示HVR-Ll (

图1A)或HVR-Hl (图1B)，第二个框标示HVR-L2 (图1A)或HVR-H2 (图1B)，而第三个框标示HVR-L3 (图1A)或HVR-H3 (图1B)。
图2描绘噬菌体点ELISA，展现每一个获得的克隆对一组遍在蛋白蛋白质在波长 450nm处的相对结合信号，如实施例I中描述的。每一个Fab文库克隆含有gD标签，而且通过对抗gD抗体的结合来评估Fab在噬菌体上的展示。使用未包被孔作为阴性对照。
图3A-3C描绘纯化的G3 Fab的结合特性，如实施例I中描述的。图3A显示在 ELISA中评估不同浓度的纯化的G3 Fab结合一组遍在蛋白蛋白质的能力的实验的结果。图 3B描绘测量纯化的G3 Fab对Kll连接的二遍在蛋白的亲和力的IC50竞争ELISA的结果。 图3C显示在固定化背景中测定G3 Fab特异性识别一组遍在蛋白蛋白质的能力的Western 印迹分析的结果。考马斯染色的凝胶展现出每一份样品的迁移率(mobility)。
图4A和4B描绘实施例2中获得的亲和力成熟克隆的轻和重链氨基酸序列。图4A 描绘亲和力成熟克隆的轻链序列。图4B描绘亲和力成熟克隆的重链序列比对。为每一个克隆标示了自第4轮分选鉴定的同胞克隆的数目。在图4A和4B，为每一个克隆以带框的区域标示了 HVR序列，第一个框标示HVR-Ll (图4A)或HVR-Hl (图4B)，第二个框标示HVR-L2 (图4A)或HVR-H2 (图4B)，而第三个框标示HVR-L3 (图4A)或HVR-H3 (图4B)。以灰色凸显相对于G3亲本序列的氨基酸变化。
图5A-5B描绘为了评估在噬菌体上展示的亲本G3克隆和8个亲和力成熟变体对一组遍在蛋白蛋白质的结合而实施的ELISA实验的结果，如实施例2E中描述的。
图6A和6B描绘实施例2中获得的杂合克隆的轻和重链氨基酸序列。图6A描绘杂合克隆的轻链序列。图6B描绘杂合克隆的重链序列比对。在图6A和6B中，为每一个克隆以带框的区域标示了 HVR序列，第一个框标示HVR-Ll (图6A)或HVR-Hl (图6B)，第二个框标示HVR-L2 (图6A)或HVR-H2 (图6B)，而第三个框标示HVR-L3 (图6A)或HVR-H3 (图 6B)。以灰色凸显相对于G3亲本序列的氨基酸变化。
图7A-7D描绘评估与亲本G3克隆和对照相比杂合IgG的结合特征的研究的结果， 如实施例3中描述的。图7A提供ELISA结果，显示G3、1C12/2E6、和2A3/2E6 IgG在4M脲中对一组遍在蛋白蛋白质的结合。图7B提供G3UC12/2E6、或2A3/2E6 IgG对Kll连接的二遍在蛋白(1000、500、250、125、63、31、和16ng/道，标示了梯度)或单遍在蛋白、线性二遍在蛋白、K48连接的二遍在蛋白、和K63连接的二遍在蛋白(lyg/道)的2倍连续稀释液的结合的Western印迹分析。考马斯染色的凝胶(左上小图)提供每一种测试的遍在蛋白在凝胶中迁移的指示。图7C描绘实验的结果，其中用泛遍在蛋白抗体P4D1(中间小图)或2A3/2E6 IgG (右边小图)对单遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白2_7(长度为2 至7个遍在蛋白亚基)、K63连接的多聚遍在蛋白2-7 (长度为2至7个遍在蛋白亚基)、和 Kll连接的多聚遍在蛋白(lyg/道)进行免疫印迹。考马斯染色揭示样品的组成(左边小图)。图7D描绘实验的结果，其中用2A3/2E6 IgG(右边小图)对Kll连接的二遍在蛋白(diubiquitin) (50ng/道)、K48连接的二遍在蛋白(I μ g/道)、K63连接的二遍在蛋白 (I μ g/道)、来自293T细胞(100 μ g/道)和酿酒酵母(S. cerevisiae)的全细胞裂解物进行免疫印迹。考马斯染色揭示样品的组成(左边小图)。
图8A-8E显示测试杂合抗体2A3/2E6自体外遍在蛋白化反应特异性识别和/或免疫沉淀Kll连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质的能力的实验的结果。图8A提供在MuRFl自我遍在蛋白化之后用泛遍在蛋白抗体P4D1实施的Western印迹。添加El (Ubel)、E2 (UbcH5c)、 和E3 (MuRFl)酶导致MuRFl上单遍在蛋白转变成多聚遍在蛋白链(MuRFl-Ub (η))。图8Β显示免疫沉淀测定法的结果，其中使用用野生型遍在蛋白实施的MuRFl自我遍在蛋白化测定法作为在不同浓度的脲存在下2A3/2E6IgG免疫沉淀的底物。用泛遍在蛋白抗体(P4D1)通过Western印迹检测输入反应以及免疫沉淀的材料。图8C显示与图8B所述同样实施的实验的免疫印迹结果，只是使用KllR遍在蛋白代替野生型遍在蛋白。图8D显示Western印迹，其源自在体外使用WT、K11R、K48R、和K63R遍在蛋白实施的MuRFl自我遍在蛋白化反应， 用2A3/2E6抗体(Kll)或同种型对照抗体任一免疫沉淀，并进行Western分析。括弧中的数字标示凝胶上的有关道和(E)中的柱。用泛遍在蛋白抗体对自我遍在蛋白化反应(道I、4、7、和10中的输入)和免疫沉淀(道2、3、5、6、8、9、11、和12)进行免疫印迹。切出考马斯染色凝胶的白线标示区域进行质谱术AQUA分析,如Western印迹指导的。图8E显示对图 8D中标示的凝胶区域的质谱术AQUA分析的结果。标示了每一份样品中测量的K11、K48、和 K63连接的量。在每一种情况中，使用同等型对照抗体在免疫沉淀中检测到可忽略量的遍在蛋白连接。
图9A-9D显示测试杂合抗体2A3/2E6自细胞裂解物特异性识别和/或免疫沉淀 Kll连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质的能力的实验的结果。图9A显示实验设计和对来自模拟或用过表达WT或KO遍在蛋白的质粒转染的HEK293T细胞的细胞裂解物实施的免疫沉淀的Western印迹结果，其中用2A3/2E6抗体(Kll)或同种型对照抗体任一进行免疫沉淀。括弧中的数字标示凝胶上和图9B的柱中的有关道。用泛遍在蛋白抗体对全细胞裂解物(输入，道1、4、和7)和免疫沉淀(道2、3、5、6、8、和9)进行免疫印迹。切出考马斯染色凝胶的白线标示区域进行质谱术AQUA分析,如Western印迹指导的。图9B显示与图9A中显示的Western印迹等同的考马斯染色凝胶。切出考马斯染色凝胶中的区域A和B用于输入和免疫沉淀。编号对应于图9A中的编号。图9C显示对图9A和9B中标示的凝胶区域实施的质谱术分析的结果。标示了每一份样品中测量的KU、K48、和K63连接的量。在每一种情况中，使用同等型对照抗体在免疫沉淀中检测到可忽略量的遍在蛋白连接。图9D提供图，比较输入和免疫沉淀(抗Kll)中测量的总遍在蛋白连接中Kll连接的百分比，证明杂合抗Kll连接特异性抗体对Kll连接的富集。
发明详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域( VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、 8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间I : I相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
“激动性抗体(agonist antibody) ”在用于本文时指模拟目的多肽的至少一项功能性活性的抗体。
“拮抗性抗体(antagonist antibody) ”或“阻断性抗体(blocking antibody) ”指抑制或降低其特异性结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50%或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50%或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
术语“抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体”和“结合抗Kll连接的多聚遍在蛋白的抗体”指能够以足够亲和力结合Kll连接的多聚遍在蛋白，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向Kll连接的多聚遍在蛋白的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体结合无关的、非Kll连接的多聚遍在蛋白的蛋白质的程度小于该抗体对Kll连接的多聚遍在蛋白的结合的约10%。在某些实施方案中，结合Kll连接的多聚遍在蛋白的抗体具有彡ΙμΜ、彡ΙΟΟηΜ、彡ΙΟηΜ、彡InM, (O. InM, ( O. OlnM、或彡 O. 00InM(例如 ICT8M 或更少，例如 ICT8M 到 I(T13M,例如 ICT9M 到 I(T13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体结合在来自不同物种的Kll连接的多聚遍在蛋白中保守的Kll连接的多聚遍在蛋白表位。在用于本文时，术语“抗多聚遍在蛋白抗体”指能够特异性结合多聚遍在蛋白分子的抗体。
在用于本文时，术语“抗遍在蛋白抗体”和“抗单遍在蛋白抗体”可互换使用，指能够特异性结合遍在蛋白分子的抗体。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类IgA、IgD、 IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1UgG2UgGy IgG4UgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y和μ。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、Ι125、Υ9°、 Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素);化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物喊类(vinca alkaloids) (长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin) C、苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素， 包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“病症”指任何会受益于本发明抗体治疗的任何疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中要治疗的病症的非限制性例子包括癌症、和发育障碍(hypotrophy)病症，包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fe区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调jPB细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中的术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fe区和变体Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区自Cys226， 或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fe区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。 除非本文中另有规定，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作 EU索弓I,如记载于Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由 4个？1 域组成疋1 1、？1 2、？1 3、和？1 4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上 类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fe区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如 Kabat Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第1_3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如 Kabat等，见上文中的亚组K I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR;三个在 VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基 26-32 (LI) ,50-52 (L2) ,91-96 (L3) ,26-32 (Hl) ,53-55 (H2)、和 96-101 (H3) ο (Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol. 196 :901_917 (1987))。例示性的 CDR(CDR_L1、 CDR-L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR-H2、和 CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸残基 24-34、L2 的 50-56、L3 的 89-97,Hl 的 31_35B、H2 的 50-65、和 H3 的 95-102 (Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))。除了 VH中的CDRl外，CDR—般包含形成高变环的氨基酸残基。⑶R还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-⑶R，或 a-CDR 的 CDR 区内。例示性的 a_CDR (a_CDR_Ll、a_CDR_L2、a_CDR_L3、 a-CDR-Hl、a-CDR-H2、和 a-CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸残基 31_34、L2 的 50_55、L3 的 89-96、 Hl 的 31-35B、H2 的 50-58、和 H3 的 95-102 (见 Almagro 和 Fransson, Front. Biosci. 13 1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、 绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于 95%或99%的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如 Flatman 等，J. Chromatogr. B848 :79_87 (2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
在用于本文时，术语“K*连接的多聚遍在蛋白”和“Lys*连接的多聚遍在蛋白”可互换使用，指在一个遍在蛋白模块的C-末端与另一个遍在蛋白模块中的第*位赖氨酸之间包含至少一个异肽键的多聚遍在蛋白分子。例如，“K11连接的多聚遍在蛋白”与“Lysll连接的多聚遍在蛋白”可互换使用，这两个术语都指在分子中一个遍在蛋白模块的C-末端与分子中另一个遍在蛋白模块的第11位赖氨酸之间包含异肽键的多聚遍在蛋白分子。
在用于本文时，表述第一赖氨酸连接“不同”于第二赖氨酸连接指一个遍在蛋白模块与另一个遍在蛋白模块之间的该第一赖氨酸连接所牵涉的赖氨酸残基(例如，K6、KlU 1(27、1(29、1(33、1(48、和/或1(63)不同于一个遍在蛋白模块与另一个遍在蛋白模块之间的该第二赖氨酸连接。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150，000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CHl、CH2jPCH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信肩、O
关于参照多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序 ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office, Washington D. C. , 20559),其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech, Inc. , South San Francisco, California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX 操作系统，包括数码UNIX V4. OD上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与 (with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算
分数X/Y 乘 100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
在用于本文时,术语“多聚遍在蛋白(polyubiquitin) ”定义为所有种类的天然的人的和合成的遍在蛋白聚合链，其落入遍在蛋白不同聚合连接方式的人的和合成的类别，包括，但不限于，K6连接的多聚遍在蛋白、Kll连接的多聚遍在蛋白、K27连接的多聚遍在蛋白、K29连接的多聚遍在蛋白、K33连接的多聚遍在蛋白、K48连接的多聚遍在蛋白和 K63连接的多聚遍在蛋白。多聚遍在蛋白可以是任何长度的，包括至少两个遍在蛋白模块 (moity)。多聚遍在蛋白有别于最初作为单一蛋白质表达的遍在蛋白串联重复体。
在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、 预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
在用于本文时,术语“遍在蛋白(ubiquitin) ”和“单遍在蛋白(monoubiquitin)” 可互换使用，指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然遍在蛋白，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的遍在蛋白以及遍在蛋白因细胞中的加工所致的任何缩短或翻译后修饰形式，由多个遍在蛋白模块构成的分子除外。该术语还涵盖遍在蛋白的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人遍在蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO 1 MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVK AK IQDK EGIPPDQQRLIFAG K QLEDGRTLSDYNIQ K ESTLHLVLRLRGG (SEQ ID NO :1)。遍在蛋白具有氨基酸6、氨基酸11、氨基酸27、氨基酸29、氨基酸33、氨基酸48、和/或氨基酸63 处的至少一个赖氨酸残基(在上文SEQ ID NO 1中以粗体标示)。
在用于本文时，术语“遍在蛋白途径”指细胞中的或在体外重建的、包括遍在蛋白和/或多聚遍在蛋白的生化途径。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL) —般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和 3 个高变区(HVR) ο (见例如 Kindt 等 KubyImmunology,第 6 版,W. H. Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano 等，J. Immunol. 150 :880_887 (1993) ；Clarkson 等，Nature352 624-628(1991)。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于能够特异性识别含有第一多聚遍在蛋白连接的第一多聚遍在蛋白分子但不特异性结合含有第二多聚遍在蛋白连接的第二多聚遍在蛋白分子的抗体的创建。在某些实施方案中，提供特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白的抗体。本发明的抗体既可用于研究，又可用于例如例如诊断或治疗例如涉及异常细胞周期行进的疾病和病症。
本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体的独特特性使得它们特别可用于区分细胞系统中不同赖氨酸连接形式的多聚遍在蛋白，而不需要求助于麻烦且昂贵的遗传操作或生物物理方法诸如质谱术。本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体可用于在体外和在体内表征特定Kll连接的多聚遍在蛋白的功能和活性。本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体还可用于确定特定Kll连接的多聚遍在蛋白在疾病的形成和发病机理中的作用。本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体还可用于治疗其中一种或多种特定赖氨酸连接的多聚遍在蛋白受到异常调节或功能发挥异常的疾病，而不会干扰抗多聚遍在蛋白抗体对其不特异性的多聚遍在蛋白的正常活性。
已知后期促进性复合物(anaphase-promoting complex) (APC/C)起遍在蛋白化 E3连接酶(其负责有丝分裂期间合成的大部分Kll连接的多聚遍在蛋白链)的作用。特别地，由APC/C介导的对有丝分裂蛋白质诸如细胞周期蛋白、孪蛋白、和Plkl的Kll连接的多聚遍在蛋白化导致随后蛋白酶体对那些经标记的蛋白质的降解。当内源遍在蛋白发生突变，使得第11位赖氨酸变成精氨酸且因此不能用于赖氨酸连接时，所得突变细胞表现出重要有丝分裂蛋白质降解异常缺失和细胞周期停滞。在蟾蜍(Xenopus)中，这种突变导致胚胎在原肠胚形成前死亡。Kll连接的多聚遍在蛋白标记物的存在和可及性如此在正常细胞周期行进中发挥重要作用，而且本发明的抗体和Fab提供有用的治疗手段来调控细胞周期调节异常的病症和疾病状态。在一个实施方案中，本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体用于治疗其中细胞周期行进异常上调，导致细胞分裂太多的疾病和病症，诸如癌症。在另一个实施方案中，本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体用于治疗其中细胞周期行进异常下调，导致细胞分裂太少和伴随消瘦或组织破坏的疾病和病症。此类疾病的例子包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症(包括但不限于Charcot MarieTooth综合征、脊髓灰质炎、肌萎缩侧索硬化、和Guillain-Barre 二氏综合征)。
在用于本文时，术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、阑尾癌、 胰腺癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌 (liver cancer)、前列腺癌、夕卜阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症、及各种类型的头和颈癌。
术语“肿瘤”在本文中使用时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-canceixms)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“变性肌肉病症”指向或描述含肌肉动物中典型特征为骨骼肌和/或平滑肌衰退或弱化使得正常肌肉功能降低的生理疾患。变性肌肉病症的例子包括但不限于肌营养不良、强直性肌营养不良、先天性肌强直病、恶病质、肌肉减少症(sarcopenia)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、艾萨克(Isaac)氏综合征、僵人综合征、家族性周期性麻痹(familiarperiodic paralyses)、肌病、肌强直、横纹肌溶解、肌肉萎缩和各种类型的肌肉无力和肌肉强直。
术语“变性神经病症”指向或描述含神经动物中典型特征为神经组织退化或神经组织的细胞间通讯衰退的生理疾患。变性神经病症的例子包括但不限于神经变性疾病 (包括但不限于Lewy体疾病、脊髓灰质炎后综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森(Parkinson)氏病、多系统萎缩、肌萎缩侧索硬化、Guillian-Barre 二氏综合征、Carcot Marie Tooth综合征、纹状体黑质变性、由τ病引起或与τ病有关的和神经细胞/组织破坏、朊病毒病、延髓性麻痹、运动神经元疾病、痴呆、和神经系统异型变性疾病 (包括但不限于卡纳万(Canavan)病、亨庭顿(Huntington)氏病、神经元腊样脂褐质沉积症、亚历山大(Alexander)氏病、图雷特(Tourette)氏综合征、Menkes卷发综合征、科凯恩 (Cockayne)综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉(Iafora)病、Rett综合征、肝豆状核变性、Lesch-Nyhan 综合征、和 Unverricht-Lundborg 综合征)。
另一方面，本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体可用作试剂来检测和分离 Kll连接的多聚遍在蛋白，诸如检测各种细胞类型和组织中的多聚遍在蛋白，包括测定多聚遍在蛋白密度和在细胞群体中和给定细胞内的分布，和基于多聚遍在蛋白的存在或量的细胞分选。在又一个方面，本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体可用于开发具有与本发明主题抗体相似的阻断活性样式的多聚遍在蛋白拮抗剂。又例如，本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体可用于鉴定与本文中例示的抗体结合多聚遍在蛋白上基本上相同抗原决定簇(包括线性和构象表位)的其它抗多聚遍在蛋白抗体。
本发明的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体可用于基于涉及多聚遍在蛋白的生理途径的测定法，以筛选Kll连接的多聚遍在蛋白功能的小分子拮抗剂。例如，由于已知Kll 连接的多聚遍在蛋白链是正常细胞周期行进通过后期(cell cycle progression through anphase)所必需的(CITE),因此可以将抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体调控(上或下调) 处理细胞或组织中细胞周期行进的活性与Kll连接的多聚遍在蛋白的一种或多种潜在小分子拮抗剂调控细胞周期行进的活性比较。
Α.例示性抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体
一方面，本发明提供结合Kll连接的多聚遍在蛋白的分离的抗体。在某些实施方案中，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白，但不特异性结合单遍在蛋白。在某些实施方案中，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白，但不特异性结合具有任何其它赖氨酸连接(即Κ6、Κ27、Κ29、Κ33、Κ48、和 /或Κ63连接)的多聚遍在蛋白。
—方面，本发明提供一种抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体，其包含HVR-Hl区，该 HVR-Hl区包含SEQ ID NO :6_11和24中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体， 其包含HVR-H2区，该HVR-H2包含SEQ ID NO :12_17，25，67和75中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-H3区，该HVR-H3区包含SEQ ID NO : 18-23，26，68，69 和76中至少一种的序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-Hl区和HVR-H2区，该HVR-Hl区包含 SEQ ID N0:6-ll 和 24 中至少一种的序列，该 HVR-H2 区包含 SEQ ID NO :12_17，25，67 和 75 中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-Hl区和HVR-H3区，该HVR-Hl区包含SEQ ID N0:6-ll和24中至少一种的序列，该HVR-H3区包含SEQ ID NO =18-23,26, 68，69和76中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-H2区和HVR-H3 区，该HVR-H2区包含SEQ ID NO : 12-17，25，67和75中至少一种的序列，该HVR-H3区包含 SEQ ID NO : 18-23，26，68，69 和 76 中至少一种的序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-Ll区，该HVR-Ll区包含SEQID NO :2， 57-60和73中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-L2区，该HVR-L2 区包含SEQ ID NO :3，61和74中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含 HVR-L3区，该HVR-L3区包含SEQ IDNO 4的序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-Ll区和HVR-L2区，该HVR-Ll区包含 SEQ ID NO :2，57-60和73中至少一种的序列，该HVR-L2区包含SEQ ID N0:3，61和74中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-Ll区和HVR-L3序列SEQ ID NO :4，该HVR-Ll区包含SEQ IDNO :2，57-60和73中至少一种的序列。一方面，本发明提供一种抗体，其包含HVR-L2区和HVR-L3序列SEQ ID NO :4，该HVR-L2区包含SEQ ID NO :3， 61和74中至少一种的序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含下述至少一项、至少两项、至少三项、至少四项、至少五项或所有六项
(i)HVR-Hl序列，其包含SEQ ID NO :6_11和24中至少一种序列；
(ii)HVR-H2 序列，其包含 SEQ ID NO :12_17，25，67 和 75 中至少一种序列；
(iii)HVR-H3 序列，其包含 SEQ ID NO :18_23，26，68，69 和 76 中至少一种序列;
(iv)HVR-Ll序列，其包含SEQ ID NO :2，57_60和73中至少一种序列；
(v)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO 3,61和74中至少一种序列；和
(vi)HVR-L3 序列 SEQ ID NO :4。
一方面，本发明提供一种抗体，其以高亲和力特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白，但以实质性降低的亲和力结合具有一些其它赖氨酸连接的多聚遍在蛋白，该抗体包含下述至少一项、至少两项、至少三项、至少四项、至少五项或所有六项
(i)HVR-Hl序列，其包含SEQ ID NO :6_11和24中至少一种序列；
(ii)HVR-H2 序列，其包含 SEQ ID NO :12_17，25，67 和 75 中至少一种序列;
(iii)HVR-H3 序列，其包含 SEQ ID NO :18_23，26，68，69 和 76 中至少一种序列;
(iv) HVR-Ll序列，其包含SEQ ID NO :2，57-60和73中至少一种序列；
(v)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO 3,61和74中至少一种序列；和
(vi)HVR-L3 序列 SEQ ID NO :4。
一方面，本发明提供抗体，其包含图1B、4B、或6B中所示重链HVR序列。在一个实施方案中，抗体包含图1A、4A、或6A中所示轻链HVR序列。在一个实施方案中,抗体包含图 1B、4B、或6B中所示重链HVR序列和图1A、4A、或6A中所示轻链HVR序列。
本发明的抗体的一些实施方案包含如下文SEQ ID NO 79中所示的人源化4D5抗体(huMAb4D5-8) ( HLRClZPl N低 Genentech, Inc.，South SanFrancisco, CA, USA)(也参见美国专利 No. 6，407，213 和 Lee 等，J. Mol. Biol. (2004)，340 (5) 1073-93)的轻链可变域。
I Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg ValThr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn ThFKla Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala SerjRfeg Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr ProPro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 107 (SEQ ID NO 79) (HVR 残基是加下划线的)
在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变域序列在第28、30、31、53、66、和91位 (分别如上文以粗体/斜体所示的Asp、Asn、Thr、Phe、Arg、和His)的一个或多个位置处被修饰。在一个实施方案中，修饰的huMAb4D5-8序列在第28位包含Ser，在第30位包含Ser， 在第31位包含Ser，在第53位包含Ser，在第66位包含Gly，和/或在第91位包含Tyr。 因而，在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有下文SEQ ID NO :80所示序列的轻链可变域
I Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val SerSer Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Sev Leu Tyr Ser Gly Val ProSer Arg Phe Ser Gly Ser Oly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser LeuGln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 107 (SEQ ID NO 80) (HVR 残基是加下划线的)
相对于huMAb4D5_8，替代的残基用如上以粗体/斜体标明。
本发明的抗体可包含任何合适的框架可变域序列，前提条件是基本上保留了对 Kll连接的多聚遍在蛋白的结合活性。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组 III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，框架共有序列包含在第71、73和/ 或78位的替代。在这些抗体的一些实施方案中，第71位是A、第73位是T和/或第78位是A0在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5_8 ( HERCEPTIN , Genentech, Inc., South SanFrancisco, CA, USA)(也参见美国专利 No. 6，407，213 和 5，821，337，和 Lee 等， J. Mol. Biol. (2004)，340 (5) =1073-93)的重链可变域框架序列。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含人K I轻链框架共有序列。在一个实施方案中，这些抗体包含选自SEQ ID NO :2-4，57-61，73和74轻链HVR序列中至少一条、两条或所有的轻链HVR序列。在一个实施方案中，这些抗体包含如美国专利No. 6，407, 213和5，821，337中所描述的huMAb4D5_8 的轻链HVR序列。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(SEQ ID NO :783和784) (HKRdPnNH1Genentech, Inc.，South San Francisco, CA, USA)的轻链可变域序列 (也参见美国专利 No. 6，407，213 和 5，821，337，和 Lee 等，J. Mol. Biol. (2004)，340 (5) 1073-93)。
在一个实施方案中，本发明的抗体是亲和力成熟的，以获得期望的靶物结合亲和力。在一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白但以实质性降低的亲和力结合具有其它(非K11)赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的亲和力成熟抗体包含 HVR-H2氨基酸位置60和63处的替代。在另一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合 Kll连接的多聚遍在蛋白但以实质性降低的亲和力结合具有其它(非Kll)赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的亲和力成熟抗体包含HVR-H3氨基酸位置98和99处的替代。在另一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白但以实质性降低的亲和力结合具有其它(非KlI)赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的亲和力成熟抗体包含HVR-Ll氨基酸位置24，25，27和28-34处的替代。在另一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白但以实质性降低的亲和力结合具有其它(非Kll)赖氨酸连接的多聚遍在蛋白的亲和力成熟抗体包含HVR-L2氨基酸位置50-52和54处的替代。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO :27_32和70-72的至少一种重链可变域序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO 5和62-66的至少一种轻链可变域。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其包含SEQ ID NO 27-32 和70-72中至少一种序列，而且该抗体还包含轻链可变域，其包含SEQ ID NO :5和62-66中至少一种序列。在其它实施方案中，与特定克隆编号对应的本发明抗体包含重链可变域，该重链可变域包含图1B、4B或6B中对该克隆编号所示HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3序列。在其它实施方案中，与特定克隆编号对应的本发明抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含图1A、4A和6A中对该克隆编号所示HVR-Ll、HVR-L2和HVR-L3序列。在其它实施方案中， 与特定克隆编号对应的本发明抗体包含重链可变域，该重链可变域包含图1B、4B或6B中对该克隆编号所示HVR-Hl、HVR-H2、和HVR-H3序列，而且该抗体还包含轻链可变域，该轻链可变域包含图1A、4A和6A中对该克隆编号所示HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
一方面，本发明提供一种抗体，其与任何上述抗体竞争对Kll连接的多聚遍在蛋白的结合。一方面，本发明提供一种抗体，其与任何上述抗体结合Kll连接的多聚遍在蛋白上相同抗原决定簇。
如本文中所示，本发明的抗体特异性结合具有特定赖氨酸连接的分离的多聚遍在蛋白。如本文中所示，在该多聚遍在蛋白附着于异源蛋白质时，本发明的抗体还特异性结合具有特定赖氨酸连接的多聚遍在蛋白。
在任何上述实施方案中，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗Kl I连接的多聚遍在蛋白抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含VH，该VH包含SEQ ID NO 27-32和70-72中任何的FRU FR2、FR3、或FR4序列。在另一个实施方案中，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含VL，该VL包含SEQ ID NO 5 和 62-66 中任何的 FR1、FR2、FR3、或 FR4 序列。
另一方面，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体包含与SEQ ID NO :27_32和70-72中任何的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体保留结合 Kll连接的多聚遍在蛋白的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO :27-32和70-72任一中替代、插入和/或删除了总共I到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体包含SEQ ID NO 27-32和70-72中任何的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
另一方面，提供抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体，其中该抗体包含与SEQID NO 5和62-66中任何的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体保留结合Kll连接的多聚遍在蛋白的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO :5和62-66 任一中替代、插入和/或删除了总共I到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体包含 SEQ ID NO 5和62-66中任何的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
另一方面，提供抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO :27-32和70-72中任何的VH和SEQ ID NO 5和62-66中任何的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体是抗体片段，例如？￥、？813、？313’、80 ￥、双抗体、或？(313’ )2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgGl抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
提供组合物，其包含至少一种抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体或包含编码抗Kll 连接的多聚遍在蛋白抗体的序列的至少一种多核苷酸。在某些实施方案中，组合物可以是药物组合物。如本文中使用的，组合物包含结合一种或多种多聚遍在蛋白的一种或多种抗体和/或包含编码结合一种或多种多聚遍在蛋白的一种或多种抗体的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，诸如药学可接受赋形剂，包括缓冲剂，它们是本领域公知的。
在又一个方面，依照任何上述实施方案的抗Kll连接的多聚遍在蛋白抗体可单一地或组合地掺入下文1-7节中描述的任何特征
I.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有彡ΙμΜ、彡IOOnM, ^ IOnM, ^ InM, (O. InM、彡 O. OlnM、或< O. OOlnM(例如 10_8M 或更少，例如 ICT8M 至 10_13M，例如，10_9M 至 I(T13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中,Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等，J. Mol. Biol. 293 :865_881 (1999))。 为了建立测定法的条件，将M!C ROTlTLiR岡多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9. 6)中的5 μ g/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的 2% (w/v)牛血清清蛋白于室温(约23°C )封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中， 将IOOpM或26pM125I-抗原与连续稀释的感兴趣Fab (例如与Presta等，Cancer Res. 57 4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab_12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如I小时)。然后除去溶液，并用PBS中的O. I %聚山梨酯20 (TWEEN- 20 )洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔闪烁液(MICR0SCINT-20 ； Packard)，然后在T0PC0UNT 伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab 给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用IMAcorei -2000 或BiAeore -3000 (BIAcore，Inc.，Piscataway, NJ)于 25 °C 使用例如固定化抗原 CM5 芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’ -(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE, Inc·)。将抗原用IOmM乙酸钠pH 4. 8稀释至 5 μ g/ml (约O. 2 μ Μ)，然后以5 μ I/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25°C以约25μ I/分钟的流速注入在含O. 05%聚山梨酯20 (TWEEN-20 )表面活性剂的PBS(PBST) 中两倍连续稀释的Fab (O. 78ηΜ至500ηΜ)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模 M ( BIACORE Evaluation Software version 3. 2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kj和解离速率。平衡解离常数(Kd)以比率k Jkm计算。见例如Chen等，J. Mol. Biol. 293 =865-881 (1999)。如果根据上文 表面等离振子共振测定法， 结合速率超过IO6M-1S-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINC0 分光光度计 (ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS PH 7. 2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25 °C的荧光发射强度(激发=295nm ;发射= 340nm，16nm带通)的升高或降低。也容易获得用于靶抗原对芯片表面的其它偶联化学(例如链霉亲合素/生物素、疏水性相互作用、或二硫化物化学)来代替上文所述胺偶联方法学 (CM5芯片)，正如本领域普通技术人员会理解的。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、 Fab’、Fab’_SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见 Hudson 等 Nat. Med. 9 :129-134 (2003)。关于 scFv 片段的综述，见例如 Pluckthiin, 于 The Pharmacology of MonocIonalAntibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 编， (Springer-Verlag, New York)，第 269-315 页(1994);还可见 TO 93/16185 ;及美国专利 No. 5，571，894和5，587，458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No. 5，869，046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如 EP 404, 097 ；W0 1993/01161 ;Hudson 等，Nat. Med. 9 :129_134(2003) ;&Hollinger 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)。三抗体和四抗体也记载于 Hudson 等， Nat. Med. 9 :129-134 (2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis, Inc. ,Waltham,MA ;见例如美国专利 No. 6，248，516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞 (例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利 No. 4，816，567 ;及 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851_6855 (1984))。 在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类， 诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson, Front. Biosci. 13 1619-1633 (2008)，并且进一步记载于例如 Riechmann 等，Nature332 :323_329 (1988)； Queen 等，Proc. Nat，I Acad. Sci. USA 86 10029-10033 (1989);美国专利 No. 5，821，337， 7，527，791，6，982，321 和 7，087，409 ；Kashmiri 等，Methods 36 :25_34(2005)(描述了 SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan, Mol. Immunol. 28 :489_498 (1991)(描述了“重修表面”)； Dali，Acqua 等,Methods 36 43~60 (2005)(描述了 “FR 改组”);及 Osbourn 等，Methods 36 61-68(2005)和 Klimka 等，Br. J. Cancer,83 =252-260(2000)(描述了 FR 改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J. Immunol. 151 :2296 (1993));自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 4285(1992);及 Presta 等 J. Immunol.，151 =2623(1993));人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如 Almagro 和 Fransson, Front. Biosci. 13 1619-1633 (2008))； 和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等，J. Biol. Chem. 272 10678-10684 (1997) 及 Rosok 等，J. Biol. Chem. 271 :22611_22618 (1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 :368_74(2001)及 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20 :450_459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg, Nat. Biotech. 23 1117-1125(2005)。还可见例如美国专利 No. 6，075，181 和 6，150，584，其描述了 XEN0M0USE 技术；美国专利No. 5，770，429，其描述了 HUMAB 技术;美国专利No. 7, 041, 870,其描述了 K-MMOUSE 技术，和美国专利申请公开文本No. US 2007/0061900，其描述了VELOCIMOUSE 技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J. Immunol. , 133 3001 (1984)； Brodeur Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第 51-63 页(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987);及 Boerner 等，J. Immunol. , 147 :86(1991))。 经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103 3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No. 7，189，826 (其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人 IgM 抗体)和 Ni，Xiandai Mianyixue, 26 (4) =265-268(2006) (其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和 Brandlein, Histology and Histopathology,20(3) :927_937 (2005)及 Vollmers 和 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3) 185-91 (2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology 178:1-37(0，Brien 等编，Human Press, Totowa, NJ, 2001),并且进一步记载于例如 McCafferty 等，Nature348 :552_554 ；Clackson 等，Nature 352 :624_628(1991)； Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1992) ;Marks 和 Bradbury,于 Methods in Molecular Biology248 161-175 (Lo 编，Human Press, Totowa, NJ, 2003) ；Sidhu 等，J. Mol. Biol. 338(2) =299-310(2004) ；Lee 等，J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093 (2004) ；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34) :12467_12472 (2004)；及 Lee 等，J. Immunol. Methods 284(1-2) 119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR) 克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于 Winter 等,Ann. Rev. Immunol. ,12 :433_455 (1994)的。卩遼菌体通常以单链 Fv (scFv) 片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等， EMBO J,12 =725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由 Hoogenboom 和 Winter，J. Mol. Biol.，227 :381_388 (1992)所描述的。 描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如美国专利No. 5，750，373、和美国专利公开文本 No. 2005/0079574，2005/0119455, 2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598， 2007/0237764,2007/0292936 和 2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对Kll连接的多聚遍在蛋白，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合Kll连接的多聚遍在蛋白的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达KlI连接的多聚遍在蛋白的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello，Nature 305 :537 (1983))、WO 93/08829、和 Traunecker 等，EMBO J. 10 :3655 (1991))、和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No. 5，731，168)。也可以通过用于生成抗体Fe-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A1);交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利 No. 4, 676, 980,及Brennan等，Science, 229 81 (1985));使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如 Kostelny 等，J. Immunol. , 148 (5) 1547-1553 (1992));使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 6444-6448 (1993));及使用单链 Fv (sFv) 二聚体(见例如 Gruber 等，J. Immunol. , 152 5368(1994));及如例如Tutt等J. Immunol. 147 =60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括 “章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合Kll连接的多聚遍在蛋白及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF” (见例如US2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代、插入、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表I中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表I中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表I
权利要求
1.一种特异性结合包含Kll赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白，其中该第二赖氨酸连接不同于 Kll赖氨酸连接。
2.一种特异性结合包含Kll赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白和包含第二赖氨酸连接的第二多聚遍在蛋白二者的分离的抗体，其中该第二赖氨酸连接不同于Kll赖氨酸连接， 其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白，且其中该抗体以与该抗体对该第一多聚遍在蛋白的结合亲和力相比实质性降低的结合亲和力结合第二多聚遍在蛋白。
3.一种特异性结合赖氨酸-11连接的多聚遍在蛋白的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
4.权利要求3的抗体，其包含至少一个高变(HVR)序列，该序列选自SEQIDN0:2和 57-60 任一的 HVR-Ll、SEQ ID NO:3 和 61 任一的 HVR-L2、SEQID NO:4 的 HVR-L3、SEQ ID NO:6-11 任一的 HVR-H1、SEQ ID NO: 12-17 和 67 任一的 HVR-H2、和 SEQ ID NO: 18-23，68 和 69 任一的 HVR-H3。
5.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的序列，其中 HVR-Hl包含氨基酸序列XlX2X3X4Ile X5 (SEQ ID NO: 24)，其中氨基酸Xl选自丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X2选自天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸，氨基酸X3选自酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸，氨基酸X4选自色氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和酪氨酸，而氨基酸X5选自丝氨酸和组氨酸；其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 X6 X7 He X8 Pro X9 GlyXlO Tyr Xll (SEQ ID NO: 25), 其中氨基酸X6选自甘氨酸和丙氨酸，氨基酸X7选自天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸和缬氨酸，氨基酸X8选自丝氨酸、酪氨酸和天冬酰胺，氨基酸X9选自天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸和天冬酰胺，氨基酸XlO选自酪氨酸和丝氨酸，而氨基酸XlI选自酪氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；且其中 HVR-H3 包含氨基酸序列 X12 X13X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 Asp (SEQ ID NO: 26)，其中氨基酸X12选自精氨酸和赖氨酸，氨基酸X13选自谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，氨基酸X14选自丝氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸，氨基酸X15选自色氨酸、 甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X16选自色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸， 氨基酸X17选自丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸，氨基酸X18选自丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甘氨酸、或不存在，氨基酸X19选自色氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸、或不存在，氨基酸X20为缬氨酸或不存在，而氨基酸X21选自甲硫氨酸和苯丙氨酸。
6.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-L1、HVR-L2的序列，其中HVR-Ll包含氨基酸序列 X22 X23 Ser X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30X31 (SEQ ID NO:73)，其中氨基酸 X22选自精氨酸和甘氨酸，氨基酸X23选自丙氨酸和缬氨酸，氨基酸X24选自谷氨酰胺和组氨酸，氨基酸X25选自天冬氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸，氨基酸X26选自亮氨酸和缬氨酸，氨基酸X27选自丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸，氨基酸X28选自苏氨酸和丝氨酸，氨基酸 X29选自丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，氨基酸X30选自缬氨酸和异亮氨酸，而氨基酸X31选自丙氨酸和丝氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列X32 X33 X34 Phe X35 Tyr Ser (SEQ ID NO: 74)，其中氨基酸X32选自丝氨酸和天冬酰胺，氨基酸X33选自谷氨酰胺和丙氨酸，氨基酸X34选自谷氨酸和丝氨酸，而氨基酸X35选自亮氨酸和缬氨酸。
7.权利要求3的抗体，其包含至少一个选自HVR-H2和HVR-H3的序列，其中HVR-H2 包含氨基酸序列 X36 He Asn Pro X37 Gly Gly Tyr Thr Tyr TyrAla Asp Ser Val LysGly (SEQ ID NO: 75)，其中氨基酸X36选自丙氨酸和甘氨酸而氨基酸X37选自丙氨酸和天冬酰胺；且其中 HVR-H3 包含氨基酸序列 Glu Trp Tyr X38 X39 Gly Tyr Val Met Asp Tyr (SEQ ID NO: 76)，其中氨基酸X38选自苯丙氨酸和酪氨酸而氨基酸X39选自甘氨酸和天冬氨酸。
8.权利要求3的抗体，其包含HVR-Ll序列SEQID NO: 2、HVR-L2序列SEQID NO: 3、和 HVR-L3 序列 SEQ ID NO:4。
9.权利要求3的抗体，其包含与图18中克隆43、六6、么9、85、？5或63所列讯^-!11、 HVR-H2、和 HVR-H3 序列对应的 HVR-Hl、HVR-H2、和 HVR-H3 序列。
10.权利要求3的抗体，其包含与图4A中克隆1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6或 2G4 所列 HVR-L1、HVR-L2、和 HVR-L3 序列对应的 HVR-L1、HVR-L2、和 HVR-L3 序列。
11.权利要求3的抗体，其包含与图4B中克隆1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6或 2G4 所列 HVR-Hl、HVR-H2、和 HVR-H3 序列对应的 HVR-Hl、HVR-H2、和 HVR-H3 序列。
12.权利要求3的抗体，其包含与图6A中克隆1C1/2E6或2A3/2E6所列HVR-Ll、 HVR-L2、和 HVR-L3 序列对应的 HVR-Ll、HVR-L2、和 HVR-L3 序列。
13.权利要求3的抗体，其包含与图6B中克隆1C1/2E6或2A3/2E6所列HVR-Hl、 HVR-H2、和 HVR-H3 序列对应的 HVR-Hl、HVR-H2、和 HVR-H3 序列。
14.权利要求3的抗体，其包含HVR-Ll序列序列SEQID NO:2、HVR-L2序列SEQ ID N0:3、HVR-L3 序列 SEQ ID N0:4、HVR_H1 序列 SEQ ID NO: 11、HVR_H2 序列 SEQ ID NO: 17 和 HVR-H3 序列 SEQ ID NO:23。
15.权利要求3的抗体，其包含HVR-Ll序列序列SEQID N0:2、HVR-L2序列SEQ ID N0:3、HVR-L3 序列 SEQ ID NO:4,HVR-Hl 序列 SEQ ID N0:11、HVR_H2 序列 SEQ ID NO: 17 或 67 和选自 SEQ ID NO: 23，68 和 69 的 HVR-H3 序列。
16.权利要求3的抗体，其包含选自SEQID NO:2, 57，58和59的HVR-Ll序列、HVR-L2 序列 SEQ ID N0:3 或 61、HVR-L3 序列 SEQ ID NO: 4、HVR-Hl 序列 SEQ ID NO: 11、HVR-H2 序列 SEQ ID NO: 17 和 HVR-H3 序列 SEQ ID NO:23。
17.权利要求3的抗体，其包含HVR-Ll序列序列SEQID NO:58、HVR-L2序列SEQ ID N0:3、HVR-L3 序列 SEQ ID NO:4,HVR-Hl 序列 SEQ ID N0:11、HVR_H2 序列 SEQ ID NO:67 HVR-H3 序列 SEQ ID NO:23。
18.权利要求3的抗体，其包含HVR-Ll序列序列SEQID NO:60、HVR-L2序列SEQ ID N0:3、HVR-L3 序列 SEQ ID NO:4,HVR-Hl 序列 SEQ ID N0:11、HVR_H2 序列 SEQ ID NO:67 和 HVR-H3 序列 SEQ ID NO:23。
19.权利要求3的抗体，其包含选自SEQID NO:5和62-66的轻链氨基酸序列。
20.权利要求3的抗体，其包含选自SEQID NO:27-32和70-72的重链氨基酸序列。
21.权利要求3的抗体，其包含与任一下述序列组合的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的轻链和重链氨基酸序列SEQ ID NO 5和32;SEQ IDNO: 63和32 ;SEQ ID NO: 65 32 ；SEQ ID NO:5 和 72 ；SEQ ID NO:63 和 72 ;和 SEQ ID NO:65 和 72 ；SEQ ID NO:62 和 32 ； SEQ ID N0:64和32;SEQ ID N0:5 和 70;SEQ ID N0:5 和 71;SEQ ID NO:66 和 32
22.—种与权利要求1-21任一项的抗体结合Kll连接的多聚遍在蛋白上相同抗原决定簇的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
23.一种与权利要求1-21任一项的抗体竞争对多聚遍在蛋白的结合的分离的抗体，其中该抗体不特异性结合单遍在蛋白。
24.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体特异性结合Kll连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质。
25.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体调控至少一种由多聚遍在蛋白介导的信号传导途径。
26.权利要求1-21任一项的分离的抗体，其中该抗体是结合Kll连接的多聚遍在蛋白的单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或抗体片段。
27.—种分离的核酸,其编码权利要求1-21任一项的抗体。
28.—种载体，其包含权利要求27的核酸。
29.—种宿主细胞，其包含权利要求27的核酸。
30.一种生成特异性结合包含Kll赖氨酸连接的第一多聚遍在蛋白的抗体的方法，包括在该抗体生成的条件下培养权利要求29的宿主细胞。
31.权利要求30的方法，进一步包括自宿主细胞回收抗体。
32.—种免疫缀合物，其包含权利要求I的抗体和细胞毒剂。
33.一种药物配制剂，其包含权利要求I的抗体和药学可接受载体。
34.权利要求33的药物配制剂，进一步包含别的治疗剂。
35.作为药物使用的权利要求I的抗体。
36.在治疗细胞周期相关疾病或病症中使用的权利要求I的抗体。
37.权利要求36的抗体，其中所述细胞周期相关疾病或病症选自与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症和与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症
38.权利要求37的与异常升高的细胞周期行进有关的疾病或病症，其中所述疾病或病症是癌症。
39.权利要求37的与异常降低的细胞周期行进有关的疾病或病症，其中所述疾病或病症选自变性肌肉病症和变性神经病症。
40.权利要求I的抗体在制备药物中的用途。
41.权利要求40的用途，其中所述药物用于选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症。
42.一种治疗具有选自癌症、变性肌肉病症、和变性神经病症的疾病或病症的个体的方法，包括对该个体施用有效量的权利要求1-26任一项的抗体。
43.一种测定怀疑含有多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的存在的方法，包括使该样品暴露于权利要求1-26任一项的至少一种抗体并测定该至少一种抗体对该样品中多聚遍在蛋白或多聚遍在蛋白化的蛋白质的结合。
44.一种将样品中的Kll连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质与非Kll连接的多聚遍在蛋白化的蛋白质分开的方法，包括使该样品与权利要求1-26任一项的至少一种抗体接触。
45.一种测定细胞或样品中Kll连接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使该细胞或样品与权利要求1-26任一项的至少一种抗体接触并评估所述接触步骤对该细胞或样品的影响。
全文摘要
本发明提供了抗多聚遍在蛋白抗体及其使用方法。
文档编号C07K16/18GK102947335SQ201180029430
公开日2013年2月27日 申请日期2011年4月14日 优先权日2010年4月15日
发明者V.迪希特, R.F.凯利, M.L.马特苏莫托 申请人:基因泰克公司