专利名称：新介质、装置和方法
技术领域：
本发明涉及一种包括固定在支持物上的多肽的分离介质。本发明也涉及一种包括这种分离介质的医疗装置和包括这种医疗装置的透析装置，连同这类装置的用途，例如用于血液透析、血液滤过和/或血液透滤。另外，本发明涉及一种用于从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白的方法，和一种通过从患者的血液中去除低分子量蛋白、或其片段或衍生物进行治疗的方法。置量肾是用于清除哺乳动物血液中不想要的多肽的最重要器官(Brenner (布伦纳)BM(2003)Brenner (布伦纳)&Rector (莱克特)的肾(The Kidney)(第7版))，并且肾功 能的丧失导致多肽的明显积累(Naseeb (纳西布)U等人(2008)Blood Purif.(血液净化)26(6) :561-8)。肾功能障碍二分成急性肾衰竭(特征为肾功能在数小时或数日时段内劣化，并且导致肾不能排泄氮类废物和维持流体和电解质稳态)和慢性肾病(CKD)(指这些功能或小或大程度地永久性丧失)(Brenner (布伦纳)BM(2003)，上文)。急性肾衰竭主要因供应给肾滤过装置的血液减少而发生，并且在低血容量性休克患者中是最常见的(Brenner (布伦纳)BM(2003)，上文)，而CKD具有多种原因并且现在已经在显示CKD体征的10%_12%西方人群中中达到流行比例(Wen (文)CP等人(2008) Lancet (柳叶刀)371 (9631) : 2173-82)。一系列基础性疾病引起CKD，数量上最重要的是归因于糖尿病的糖尿病型肾病、归因于高血压的肾硬化和肾小球肾炎(Brenner (布伦纳)BM(2003)，上文)。尽管开始不同，晚期CKD肾功能障碍表型在病因学之间是明显类似的，并且随着其中明显降低的肾小球过滤率到来，或早或晚需要定期透析或肾移植以存活。尽管肾替换疗法方面取得进展，然而，急性肾损伤或慢性肾病患者均遭受循环性多肽的增加(Naseeb (纳西布)U等人(2008)，上文)，其中认为所述增加来源于降低的肾小管清除率(Moestrup (莫斯特鲁普)SK等人(1995)，JClin Invest.(临床研究杂志)96 (3) : 1404-13 ;Vinge (维格)L 等人(2010)，Nephrol DialTransplant (肾脏病透析移植)，advance e-publication (发展电子出版物)do1: 10. 1093/ndt/gfq044)并且涉及生活质量和存活。这种症状未通过现有疗法解决。大量的小分子量或中等分子量多肽连同一些大分子量多肽经过肾小球滤并且终止于肾小管中。在那里，它们由肾小管细胞的管腔表面上的清道夫受体结合并且通过内吞作用摄取(Moestrup(莫斯特鲁普)SK等人(1995)，上文)。随后使得这些多肽经胞吞作用返回至循环或在管周细胞中经降解以便再循环成氨基酸用于新蛋白合成(Christensen (克里斯坦森)EI等人(2002)Nat Rev Mol Cell Biol.(自然评论分子细胞生物学)3 (4) : 256-66 ;Russo (鲁索)LM等人(2007)Kidney Int.(国际肾脏)，71 (6) :505-13)。因此，这些管周受体是生理上保护大量对正常身体功能必需的蛋白和多肽免于经尿损失而必需的。多配体、内吞受体巨蛋白和cubilin共定位于肾小管中。这两种受体对于正常小管重吸收肾小球中滤过的、包括白蛋白尿中的蛋白均是重要的(Russo (鲁索)LM等人(2007)，上文；Vinge (维格)L 等人(2010),上文)。肾功能障碍的目前治疗选项集中在以下方面通过特异性结合剂(例如钾和磷酸盐结合剂)使小分子(主要是水和盐)处于稳态，或通过透析(例如血液透析和腹膜透析)非特异性去除它们。腹膜透析利用腹膜作为滤器。血液透析，连同血液滤过和血液透滤，利用体外回路及合成性(通常为塑料)滤器。治疗肾功能非特异性丧失的全部当前方法基于分子筛分滤器，以除去不想要和潜在地危害的分子。可替代地，存在众多更特异的方法，它们在特定的情况下去除靶向的化合物。这些包括了设计成在移植之前除去白细胞的蛋白A柱(Weiss (魏斯)L等人(1986)ApplBiochem Biotechnol.(应用生物化学与生物技术)13(2) :87-96)、用针对免疫球蛋白轻链的抗体包被以除去髓瘤患者中这类轻链的柱(Hutchinson (哈钦森)CA等人(2007) J Am Soc Nephrol.(美国肾脏学会期刊)18(3) :886-95)和用于去除处于发炎状态的肝素结合性细胞因子的半特异性肝素涂覆装置(Axelsson (阿克塞尔松)J等人(2010)ASAIO J.(美国人造体内器官学会志)56(1) :48-51)。
美国专利申请公开2004/0235161致力于体内人工肾的用途，它包括带有细胞的海绵层，其中这些细胞具有在表面上表达的巨蛋白。完整的肾小管细胞用于血液的清洁。PCT申请公开W02003/102593致力于巨蛋白保护免遭外源给予的多肽影响的用途。需要在透析治疗期间导致从复杂生物流体(例如血液)中特异性去除毒性、生理性和病理性多肽的血液纯化技术。发明披露本披露的目的是缓解至少一些与现有技术相关的问题。具体而言，本披露的一个目的是提供一种分离介质，它允许从流体中去除低分子量蛋白和/或其片段或衍生物。本披露的一个目的也是提供一种医疗装置，它允许从复杂生物流体中选择性去除低分子量蛋白和/或其片段或衍生物。本披露的另一个目的还是提供一种医疗装置，它允许恢复复杂生物流体的组成。本披露的又另一个目的是提供一种用于从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白和/或其片段或衍生物的方法。以上提到的目的连同本领域技术人员在面对本披露时将显而易见的其他目的分别由本发明的不同方面至少之一解决。在其第一方面，本发明提供一种分离介质，包括固定在支持物上的a)至少一种巨蛋白多肽和/或b)至少一种cubilin多肽。在本发明的背景下，术语“分离介质”指用于分离的介质，例如柱或滤器。贯穿本披露，术语“巨蛋白多肽”指巨蛋白受体或其保留巨蛋白受体的至少一种功能的变体、结构域、片段或衍生物。例如，至少一种功能可以是针对至少一种配体的结合功能。巨蛋白受体是与低密度脂蛋白受体(LDLR)具有结构类似性的受体家族的成员，并且也称作“低密度脂蛋白相关蛋白2” (LRP2) (Christensen (克里斯坦森)EI等人(2002)，上文；Cui (崔)S等人(2010) Am J Physiol. Renal Physiol.(美国生理学-肾脏生理学杂志)298(2) : 335-345)。巨蛋白受体是在许多吸收性上皮细胞的质膜中发现的多配体结合受体。这种蛋白发挥作用以介导配体的内吞，从而导致在溶酶体中降解或转胞吞作用。在人中，这种蛋白由LRP2基因编码。人巨蛋白受体的氨基酸序列的一个非限制性实例在所附的序列表中作为SEQ ID号1披露。如下文实验部分中例举，巨蛋白受体的不同片段保留巨蛋白受体的至少一种功能，并且可以本身或以这类片段彼此或与全长受体或与其他片段的任何组合对于本发明的不同方面是有用的。这类片段或结构域的实例在此表示为MEGl (SEQID 号2)、MEG2 (SEQ ID 号3)、MEG3 (SEQ ID 号4)、MEG4 (SEQ ID 号5)、MEG5 (SEQ ID号:6)、MEG6 (SEQID 号:7)、MEG7 (SEQ ID 号8)、MEG8 (SEQ ID 号9)、MEG9 ((SEQ ID 号10)、MEGlO ((SEQ ID号11)和MEG5-8 (SEQ ID号12)。然而，“巨蛋白多肽”也可以指实现巨蛋白受体的至少一种功能的类似蛋白、片段、结构域或衍生物。这种多肽的氨基酸序列可以例如与在此确切披露的氨基酸序列因一个或多个保守性置换突变而相关，其中，披露的序列中的氨基酸残基已经由相同组的共有物理-化学特性的氨基酸残基中的另一个氨基酸残基替换。这类分组是蛋白工程领域技术人员熟知的。换句话说，“巨蛋白多肽”可以与特定披露的巨蛋白多肽序列类似至少80%如至少85%、例如至少90%或例如至少95%的类似性或同一'I"生程度。按照类似的方式，在本发明的背景下，术语“cubilin多肽”指cubilin受体或其保留cubilin受体的至少一种功能的片段。例如,至少一种功能可以是针对至少一种配体的结合功能。在体内，cubilin(也称作cubulin、肠道内在因子受体、内在因子-维生素B12 受体和460kDa受体)位于肠和肾的上皮内(Christensen(克里斯坦森)EI等人(2002)，上文；Kozyraki (科塞拉基)R 等人(1998) Blood (血液)91(10) :3593-3600 ;美国专利 6 586389)。在人中，这种蛋白由CUBN基因编码。人cubilin受体的氨基酸序列的一个非限制性实例在序列表中披露为SEQ ID号13。如下文实验部分中例举，cubilin受体的不同片段保留cubilin受体的至少一种功能，并且可以本身或以这类片段彼此或与全长受体或与其他片段的任何组合对于本发明的不同方面是有用的。这类片段或结构域的实例在此表示为CUBEGF(SEQ ID 号:14)、CUB1-7(SEQ ID 号15)、CUB5-8 (SEQ ID 号16)、CUB6-12(SEQ ID号:17)、CUB11-17(SEQ ID 号18)、CUB16_22(SEQ ID 号:19)和 CUB21-27 (SEQID 号20)。然而,“cubilin多肽”也可以指实现cubilin受体的至少一种功能的类似蛋白、片段、结构域或衍生物。这种多肽的氨基酸序列可以例如与在此确切披露的氨基酸序列因一个或多个保守性置换突变而相关，其中，公开序列中的氨基酸残基已经由相同组的共有物理-化学特性的氨基酸残基中的另一个氨基酸残基替换。这类分组是蛋白工程领域技术人员熟知的。换句话说，“cubilin多肽”可以与公开的具体cubilin多肽序列类似至少80%如至少85%、如至少90%或如至少95%的类似性或同一性程度。在如本申请中披露的分离介质中，可以使用一种或多种巨蛋白多肽(它们可以是相同或不同的)和/或一种或多种cubilin多肽(它们可以是相同或不同的)。在本发明的背景下，术语“支持物”指在其上固定至少一种巨蛋白多肽和/或至少一种cubilin多肽的表面。例如，这种支持物可以由珠或膜组成。如果存在，珠可以用在柱中并且膜可以用在滤器中。具备固定由的巨蛋白和/或cubilin多肽的柱或滤器可以用于分离蛋白，例如低分子量蛋白和/或其片段或衍生物。还在本发明的背景下，并且如技术人员轻易地理解，术语“固定在支持物上”意指已经将某个种类有意地固定至支持物，与也固定至相同持物的其他种类分开。在巨蛋白和cubilin多肽这二者均存在的本发明实施方案中，这些多肽“固定在支持物上”的事实意指每个多肽种类分开地固定到支持物上。这种固定可以是间接的，如使用熟知的亲和系统。实例包括在相应多肽中的His-标签和配有螯合部分(例如N1-NTA基团)的支持物之间(或反之亦然)的，或相应多肽中的生物素基团和配有链霉亲和素基团的支持物之间(或反之亦然)的相互作用。这种固定也可以直接的，即多肽共价地附接到支持物。考虑了用于固定所讨论的每种多肽的这些及其他方法和手段的任意组合，并且可以由技术人员在没有过度负担的情况下付诸实施。包括至少一种巨蛋白多肽和/或至少一种cubilin多肽的分离介质的一个优点是，这种介质允许结合能够与巨蛋白、与cubilin或与二者结合(如情况可以允许)的多种蛋白和/或其其片段或衍生物。通过利用与巨蛋白和/或cubilin的相互作用，可以至少部分地从流体去除这些蛋白。例如，这种分离介质可以用于医疗装置中或用于透析装置中，例如目地在于透析患者的血液。在这种应用中，可以减少在血液中低分子量多肽和/或它们的片段或衍生物的量，并且多种低分子量分子在血液中的原始组成可以恢复。具有恢复的蛋白组成的血液与已经通过肾并且具有肾正常在血液中保留的蛋白的组成的血液类似。在分离介质的一些实施方案中，其中这种介质包括巨蛋白和cubilin多肽，巨蛋白和cubilin多肽之间的摩尔比可以处于从1:100至100:1的范围,例如从1:50至50:1, 例如从1:10至10:1，例如从1:5至to5:1，例如从1:2至2:1或例如1:1。在本披露的背景下，摩尔比是巨蛋白多肽的摩尔浓度与cubilin多肽的摩尔浓度的比率。发明人已经发现，巨蛋白多肽和cubilin多肽之间的具体摩尔比10:1显示良好的结果，在于许多低分子量蛋白由分离介质捕获并且从复杂生物流体中去除。然而，其他摩尔比也令人满意地起作用。鉴于在此的教导内容并且使用以上比率作为指导，本领域技术人员随后将能够进行必要的实验以优化根据本发明的分离介质的这些实施方案中巨蛋白和cubilin多肽的摩尔比。为了避免怀疑，本发明的多个方面还提供一种分离介质，仅包括固定的巨蛋白多肽(即不包括cubilin多肽)或仅包括固定的cubilin多肽(即不包括巨蛋白多肽)，在一些情况下，这可以在捕获低分子量蛋白和/或其片段或衍生物方面具有令人满意的效果。例如，如以下实例11中所述，一种包括固定的巨蛋白多肽(MEG5-8)的分离介质结合来自复杂生物流体的胰岛素。此外，如下文实例12和13中所述，一种包括固定的全长巨蛋白的分离介质，可以用来成功地处理经部分肾切除的大鼠的血液。在这些实例中，巨蛋白多肽足以获得对于去除至少一种低分子量蛋白有用的分离介质。然而，在其他情况下，需要至少一种巨蛋白多肽与至少一种cubilin多肽的组合以实现令人满意的结果。在一些实施方案中，固定的巨蛋白的表面密度可以是1-100000个巨蛋白多妝分子每P m2,例如100-50000个分子每μ m2,例如1000-20000个分子每μπι2或例如3000-10000 个分子每 μπι2。在一些实施方案中，固定的cubilin的表面密度可以是1-100000个cubilin多肽分子每μ m2，例如100-50000个分子每μ m2，如1000-20000个分子每μ τα或如3000-10000
个分子每μ m2。巨蛋白多肽可以重组地或经由化学合成产生。类似地，cubilin多肽可以重组地或经由化学合成产生。在一些实施方案中，支持物的材料可以选自下组，该组由以下各项组成玻璃、纤维素、乙酸纤维素、壳多糖、壳聚糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、琼脂凝胶支持物、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、娃氧烧和淀粉酶包覆的粒子。例如，聚苯乙烯可以选自氨基磺酸聚苯乙烯(anilo sulfonic polystyrene)和三乙醇胺甲基聚苯乙烯。在一个实例中,支持物由交联葡聚糖(例如Sephadex )组成。支持物的其他实例是Sepharose 和Dynabeads 。鉴于本文中提供的指导，本领域技术人员理解，可以借助试验和误差选择支持物。便宜并且易于制造和操作的支持物连同保持物质从支持物材料中泄漏至最小量的支持物是有利的。此外，可以对支持物消毒。支持物可以具有不同形式。例如，支持物可以包括珠或粒子，例如微粒子或纳米粒子。在其他实例中，支持物可以包括一条或多条中空纤维。支持物可以是柱，例如多孔柱。此外，支持物可以是滤器。至少一种巨蛋白多肽和/或至少一种cubilin多肽可以共价附接到支持物。共价附接可以选自下组，该组由以下各项组成共价聚合物接枝、等离子体处理、物理吸附、化学吸附和化学衍生。在其他实例中，至少一种多肽可以用CnBr偶联法附接到支持物。仍在其他实例中，可以使用生物素-抗生物素蛋白或谷胱甘肽S-转移酶(GST)偶联法。 在其另一个方面，本发明提供了一种用于体外处理复杂生物流体的医疗装置，它包括如上所述的分离介质。在此和在本发明的其他方面的背景下，术语“复杂生物流体”指一种水基流体，包括例如多样溶质、悬浮的天然存在的或制造的多肽和细胞。例如，复杂生物流体可以包括蛋白、盐和其他分子，例如细胞。在一些实例中，复杂生物流体是血液，例如哺乳动物血液，例如人血。在其他实例中，复杂生物流体是血浆、血清或尿。在本披露的背景下，血浆是血液的黄色液体组分，全血中的血细胞通正常将悬浮在其中。它是细胞外液的血管内流体部分。它大部分是水并且包括溶解的蛋白、葡萄糖、凝血因子、矿质离子、激素和二氧化碳。血浆可以通过在离心机中旋转含有抗凝剂的新鲜血液的管直至血细胞降至管底部来制备。然后倾出或吸出血浆。在本披露的背景下，血清是没有纤维蛋白原或其他凝血因子的血浆(即减去细胞和凝血因子这二者的全血)。血清可以包括不在血液凝固中使用的全部蛋白和全部电解质、抗体、抗原、激素和任何外源物质(例如，药物和微生物)。在本发明的背景下，体外处理指在身体(例如人体)外的处理。例如，体外处理可以包括血液透析。处理复杂生物流体(例如血液)可以包括从血液中去除分子,例如蛋白。在一些实施方案中，复杂生物流体包括至少一种低分子量蛋白和/或其片段或衍生物。这种低分子量蛋白可以是更大蛋白的一部分。在一些实例中，低分子量蛋白具有50kDa或更低的分子量。在其他实例中，低分子量蛋白具有35kDa或更低的分子量。仍在其他实例中，低分子量蛋白具有20kDa或更低的分子量。例如，复杂生物流体可以包括低分子量蛋白和/或其片段或衍生物的混合物。此外，复杂生物流体可以包括大于例如50kDa的蛋白和除蛋白外的其他分子。在本发明的一些实施方案中，低分子量蛋白可以是修饰的。这类修饰的实例是糖基化，例如，甘露糖-6-磷酸化和唾液酸化，和富亮氨酸区域修饰。其他实例涉及金属蛋白酶或蛋白内切酶的作用。在一些实例中，可以降解低分子量蛋白或其片段或衍生物。低分子量蛋白或其片段或衍生物可以具有巨蛋白结合基序，意指这种蛋白具有与如在此定义的巨蛋白多肽结合的能力。在其他实例中，低分子量蛋白或其片段或衍生物可以具有cubilin结合基序，即，具有与如在此定义的cubilin多肽结合的能力。低分子量蛋白或其片段或衍生物可以具有至少一个巨蛋白结合基序、至少一个cubilin结合基序或其组合。在一些实施方案中，低分子量蛋白可以选自下组，该组由以下各项组成肽激素、酶和维生素结合蛋白。例如，这种低分子量蛋白可以选自下组，该组由以下各项组成细胞因子、胰岛素、白蛋白、载脂蛋白、β2-和Ci1-微球蛋白、肌球蛋白和免疫球蛋白轻链及其片段和衍生物。在一个实例中，载脂蛋白可以是载脂蛋白H。在一些实施方案中，根据本发明的医疗装置可以额外地包括筛分滤器(sizef iIter)。过滤是通过插入仅流体可以穿过的介质，而用于从流体中分离固体的机械或物理操作。网状、袋状和纸质滤器可以用来除去悬浮在流体中的大颗粒，而膜处理(包括微过滤、超滤、纳米过滤、反渗和透析)使用合成膜并且可以用来分离微米级或更小的种类。可以用在根据本发明医疗装置中的筛分滤器可以具有50kDa截留。在其他实例中，截留是35kDa。仍在其他实例中，截留是20kDa。例如，筛分滤器可以从复杂生物流体中去除大蛋白，例如白蛋白。在其他实例中，筛分滤器可以从血液中去除血细胞。 在根据本发明的医疗装置的一些实施方案中使用的筛分滤器可以具有不同形式。例如，筛分滤器可以是纤维型、穿孔片型或网型滤器。筛分滤器可以由天然材料制成。例如，天然材料可以是纤维素或其衍生物、壳聚糖、碳或氧化铝。在其他实例中，筛分滤器可以由例如选自下组的人造材料制成，该组由以下各项组成尼龙6-6、聚偏氟乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚醚砜、玻璃和金属。鉴于在此提供的指导，本领域技术人员理解，可以借助试验和误差选择筛分滤器。筛分滤器优选是便宜、可消毒、易于制造和操作的，并且来自筛分滤器材料的泄漏优选是低的。在一些实施方案中，这种医疗装置可以进一步包括电荷滤器(charge filter)。在一些实例中，电荷滤器仅允许具有< 8的等电点(pi)的种类通过。在其他实例中，电荷滤器仅允许具有< 7的pi的种类通过。仍在其他实例中，电荷滤器仅允许具有< 5. 8的pi的种类通过。电荷滤器可以具有不同形式。例如，电荷滤器可以是纤维型、穿孔片型或网型滤器。电荷滤器可以由天然材料制成。例如，天然材料可以是纤维素或其衍生物、壳聚糖、碳或氧化铝。在其他实例中，电荷滤器可以由例如选自下组的人造材料制成，该组由以下各项组成尼龙6-6、聚偏氟乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚醚砜、玻璃和金属。鉴于本文中提供的指导，本领域技术人员理解，可以借助试验和误差选择电荷滤器。电荷滤器优选地是便宜、可消毒并且易于制造及操作的，并且来自电荷滤器材料的泄漏优选是低的。在一些实施方案中，筛分滤器和电荷滤器是相同的滤器。在一些实例中，筛分滤器和电荷滤器是两种不同的滤器。例如，筛分滤器可以在医疗装置中置于电荷滤器之前。在这个实例中，添加至医疗装置的复杂生物流体抵达电荷滤器之前的筛分滤器。在其他实例中，电荷滤器在医疗装置中置于筛分滤器之前。在本发明的一些实施方案中，医疗装置可以在使用之前消毒。消毒指从表面有效杀死或消除可传染病原体(例如真菌、细菌、病毒、孢子形式、等)的任何过程。消毒可以用热、化学品、照射、高压或过滤进行。一种用于热消毒的广泛使用的方法是高压釜法。高压釜常使用加热至121-134° C的蒸汽。在其他实例中，该装置可以用Y辐射消毒。Y射线是穿透力非常强的，并且通常用于一次性医疗器械(例如注射器)的消毒。其他替代方式包括使用消毒液，；例如乙醇。在本发明的一些实施方案中，这种装置可以不作为一个整体消毒，反而是在无菌环境中使用事先消毒的部件组装。在其另一个方面，本发明提供了一种用于体外处理复杂生物流体的透析装置，它包括如在此所述的医疗装置。这种透析装置可以包括如在此所述的医疗装置外的其他部分。例如，根据本发明的透析装置可以包括多于一个医疗装置。多于一个医疗装置可以是平行或串联地安排。在其另一个方面，本发明提供了用于从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白的方法，包括以下步骤a)提供复杂生物流体样品，它含有对巨蛋白和/或cubilin具有结合亲和力的低分子量蛋白，b)使所述样品与如上披露的分离介质、医疗装置或透析装置在允许所述低分子量蛋白与所述至少一种巨蛋白多肽和/或至少一种cubilin多肽结合的条件下接触， c)从所述支持物中分离所述样品，使得起初存在于所述样品中的所述低分子量蛋白的总量的至少一部分保留在该支持物上，并且d)回收含有减少量的所述低分子量蛋白的所述样品。用于从复杂生物流体中体外去除至少一种低分子量蛋白的方法可以用作为用于体外处理复杂生物流体的方法。在用于体外处理的方法中，可以使用如在此所述的根据本发明分离介质，例如包括于如在此所述的根据本发明医疗装置中。在本发明方法的一些实施方案中，复杂生物流体可以是血液。在一些实例中，血液是哺乳动物血液，例如人血。在其他实例中，复杂生物流体可以是血浆、血清或尿。复杂生物流体的样品可以通过使用例如血液透析回路获得。血液透析回路可以被连接至患有肾病的患者。样品与至少一种巨蛋白多肽和/或至少一种cubilin多肽接触。例如，可以使样品与包括巨蛋白和cubilin多肽中任一种或全部二者的分离介质或包括这种分离介质的医疗装置或透析装置接触。在分离期间，考虑至少一种低分子量蛋白或其片段或衍生物结合巨蛋白多肽和/或cubilin多肽并且从复杂生物流体中被保留。流体流过分离介质，同时至少一种低分子量蛋白或其片段或衍生物结合在分离介质中支持物上固定的多肽。在分离期间，复杂生物流体中至少部分低分子量蛋白或其片段或衍生物可以被并且随后从复杂生物流体中去除。复杂生物流体可以在通过分离介质后进行回收。与进入分离介质的复杂生物流体的蛋白的组成(和量)相比，回收的复杂生物流体将具有改变的蛋白的组成(和量)。用于从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白或其片段或衍生物的方法的一个优点是，这种方法类似正常发挥作用的肾的功能。患有功能异常的肾的人可能具有血液中低分子量蛋白或其片段或衍生物的量增加的问题，这引起严重问题，例如淀粉样变(血液中增加的β -微球蛋白浓度)或内质网应急(增加的巨蛋白和/或cubilin结合残基浓度)。通过使用从复杂生物流体(例如血液)中体外去除低分子量蛋白或其片段或衍生物的方法，流体的蛋白的量和蛋白的组成可以恢复至这样的状态，它类似具有正常发挥作用的肾的人的血液的内容物。另外，用于从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白的方法可以用来通过减少血液中低分子量蛋白或其片段或衍生物的量而防止肾衰竭。例如，用于从血液中体外去除低分子量蛋白的方法可以用来减少可以由肌肉创伤引起的血液中增加的肌球蛋白浓度。血液中增加的肌球蛋白浓度可以引起肾衰竭。在另一个实例中，用于从血液中体外去除低分子量蛋白的方法可以用来减少与血液恶性肿瘤(如骨髓瘤)相关的循环型免疫球蛋白轻链的量。为了避免怀疑，本发明的多个方面还提供了一种使·用仅包括固定的巨蛋白多肽(即不包括cubilin多肽)或仅包含固定的cubilin多肽(即不包括巨蛋白多肽·)的分离介质，从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白或其片段或衍生物的方法，这在一些情况下，这可以在捕获低分子量蛋白方面具有令人满意的效果。然而，在其他情况下，需要至少一种巨蛋白多肽与至少一种cubilin多肽的组合以实现令人满意的结果。 在一些实施方案中，低分子量蛋白或其片段或衍生物可以具有50kDa或更低的分子量。在其他实例中，低分子量蛋白或其片段或衍生物具有35kDa或更低的分子量。仍在其他实例中，低分子量蛋白或其片段或衍生物具有20kDa或更低的分子量。在本发明的一些实施方案中，低分子量蛋白或其片段或衍生物可以是修饰的。不受任何特定科学理论约束，这类修饰的一些实例是糖基化、甘露糖-6-磷酸化、富亮氨酸区域修饰和唾液酸化。其他实例涉及金属蛋白酶或蛋白内切酶。在一些实例中，可以降解低分子量蛋白或其片段或衍生物。在本发明方法的实施方案中，低分子量蛋白或其片段或衍生物可以具有至少一个巨蛋白结合基序、至少一个cubilin结合基序或其组合。在一些实施方案中，低分子量蛋白可以选自下组，该组由以下各项组成肽激素、酶和维生素结合蛋白。例如，低分子量蛋白可以选自下组，该组由以下各项组成细胞因子、胰岛素、白蛋白、载脂蛋白、β2-和Ci1-微球蛋白和免疫球蛋白轻链。在一个实例中，载脂蛋白可以是载脂蛋白H。在一些实施方案中，该方法进一步包括使样品经历筛分过滤步骤的一个步骤，其中可以在进行步骤b)之前从样品中去除高分子量组分。在本发明的背景下，术语“组分”指复杂生物流体中存在的蛋白或其他分子。例如，高分子量组分可以具有50kDa或更高的分子量。在其他实例中，闻分子量组分可以具有35kDa或更闻的分子量。仍在其他实例中，闻分子量组分可以具有20kDa或更闻的分子量。在一些实施方案中，涵盖方法进一步包括使样品经历电荷过滤步骤，其中在进行步骤b)之前从样品中去除具有不大于8的pi的组分。在其他实例中，去除的组分可以具有不大于7. O的pi。仍在其他实例中，去除的组分可以具有不大于5. 8的pi。在一些实施方案中，筛分过滤和电荷过滤同时进行。筛分滤器和电荷滤器可以是相同的。在其他实例中，筛分过滤可以在电荷过滤之前进行。仍在其他实例中，电荷过滤在筛分过滤之前进行。在一些实施方案中，该方法还可以进一步包括其中洗脱保留的低分子量蛋白的步骤e)。可以收集并且分析洗脱的蛋白。例如，蛋白的量和蛋白的类型对于确定患者的疾病状态或用于确定患有肾病的患者的疗法可以是有利的。可以将这种医疗装置或透析装置再使用多于一次。这种装置可以在两次添加复杂生物流体之间经历洗脱。本发明还提供了一种用于治疗患有因低分子量蛋白或其片段或衍生物引起或加重的病状的哺乳动物受试者的方法，包括以下步骤
a)从所述受试者提取血液，b)使用如上所述的体外去除方法从所述提取的血液中去除低分子量蛋白或其片段或衍生物，使得起初存在于所述血液中的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的总量的至少部分保留在支持物上，并且c)将含有减少量的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的血液再导入受试者的血流中。患有因低分子量蛋白或其片段或衍生物引起或加重的病状的受试者可以是患有肾病的患者。患有肾病的患者可以具有一个或两个功能异常的肾。功能异常的肾的可能后果可以是血液中增加量的低分子量蛋白或其片段或衍生物。例如，血液的提取和再导入可以在一个连续的环中进行。这个环可以包括受试者的一部分血流。在其他实例中，血液的提取可以使用带有外部血液回路的透析装置进行。在其他实例中，用于治疗的方法可以在人体内进行，其中血液与包括巨蛋白和/或cubilin多肽的装置接触。这种装置可以安排在人体内。与进入装置时相比，离开这个装置的血液可以具有减少量的蛋白。在其另一个方面，本发明提供了一种可以用于血液透析、血液滤过和/或血液透滤的医疗或透析装置。这种装置可以与一种血液回路串联和/或平行地使用。在一些实例中，这种血液回路可以是透析设备。该装置可以用于从一种复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白或其片段或衍生物。这种复杂生物流体可以是如在此所述的血液、血浆、血清或尿。如在此所述,复杂生物流体可以包括至少一种低分子量蛋白或其片段或衍生物。低分子量蛋白或其片段或衍生物可以是肽激素、酶或维生素结合蛋白。例如，低分 子量蛋白可以是炎性细胞因子。在另一个实例中，低分子量蛋白可以是免疫球蛋白轻链。例如，骨髓瘤造成轻链在肾中沉积，并且为了减少血液中免疫球蛋白轻链的量，使用根据本发明的装置可能是有利的。在一些实例中，该装置可以用于恢复复杂生物流体的组成。患有肾病的人可以在血液中具有增加量的修饰蛋白或其片段或衍生物。大部分的修饰蛋白或其片段或衍生物未由肾从血液中去除(至少没有到令人满意的程度)，原因在于肾的功能异常。可以使用根据本披露的装置以便恢复血液的组成。根据本发明的装置可以用于治疗或预防存在患有肾衰竭风险的受试者的方法。例如，可以使用该装置以便减少显示肾衰竭症状的受试者的血液中聚集性低分子量蛋白或其片段或衍生物的量。在本发明的一个实施方案中，根据本发明的装置可以用于从生物反应器中获得功能蛋白。在分离蛋白并且通过例如使用亲和柱分离后，根据本发明的装置可以用于从功能蛋白分离功能异常的蛋白。可以使用根据本发明的装置作为生物反应器中产生后获得分离的蛋白时的额外步骤。在其他实例中，根据本发明的装置可以在败血症疗法中使用。例如，该装置可以用于减少显示败血症症状的受试者的血液中细胞因子的量。仍在其他实例中，根据本发明的装置可以用来治疗急性肾衰竭。急性肾衰竭可以由例如肌肉创伤后肌球蛋白积累引起。根据本发明的装置可以用于减少显示急性肾衰竭症状的受试者的肌球蛋白的量。根据本披露的医疗或透析装置可以与连接至体外血液回路的另一个医疗或透析装置平行或串联地使用。例如，其他医疗或透析装置可以是透析血液滤器或体外血液增氧
>J-U ρ α装直。
_5] 分列的实施方案清单以下是本披露的实施方案的非限制性和分 列清单，其出于描述由本发明在其某些方面提供的不同特征和组合的目的而提出。项1. 一种分离介质，包括固定在支持物上的至少一种巨蛋白多肽。2.根据项I的分离介质，其中所述巨蛋白多肽选自下组，该组由以下各项组成SEQ ID 号1、SEQ ID 号2、SEQ ID 号3、SEQ ID 号4、SEQ ID 号5、SEQ ID 号6、SEQID 号:7、SEQ ID 号:8、SEQ ID 号:9、SEQ ID 号:10、SEQ ID 号11 和 SEQ ID 号12 和与其具有至少80%，如至少85%、如至少90%、如至少95%同一性的氨基酸序列。3.根据项2的分离介质，其中所述巨蛋白多肽选自下组，该组由以下各项组成SEQ ID 号1、SEQ ID 号2、SEQ ID 号3、SEQ ID 号4、SEQ ID 号5、SEQ ID 号6、SEQID 号:7、SEQ ID 号:8、SEQ ID 号:9、SEQ ID 号:10、SEQ ID 号:11 和 SEQ ID 号12。4.根据前述项中任一项的分离介质，其中固定的巨蛋白的表面密度是1-100000个巨蛋白多肽分子每μπι2。5.根据项4的分离介质，其中固定的巨蛋白的所述表面密度是3000-10000个巨蛋白多肽分子每μ m2。6.根据前述项中任一项的分离介质，其中至少一种巨蛋白多肽重组地或经化学合成产生。7. 一种分离介质，包括固定在支持物上的至少一种cubilin多肽。8.根据项7的分离介质，其中所述cubilin多肽选自下组，该组由以下各项组成SEQ ID 号13、SEQ ID 号14、SEQ ID 号15、SEQ ID 号16、SEQID 号17、SEQ ID 号18、SEQ ID号19和SEQ ID号20和与其具有至少80%(如至少85%、如至少90%、如至少95%)同一性的氨基酸序列。9.根据项8的分离介质，其中所述cubilin多肽选自下组，该组由以下各项组成SEQ ID 号13、SEQ ID 号14、SEQ ID 号15、SEQ ID 号16、SEQID 号17、SEQ ID 号18、SEQ ID 号19 和 SEQ ID 号20。10.根据前述项中任一项的分离介质，包括固定在支持物上的至少一种巨蛋白多肽和至少一种cubilin多肽。11.根据项10的分离介质，其中所述巨蛋白多肽和所述cubilin多肽之间的摩尔比处于从1:100至100:1的范围内。12.根据项11的分离介质，其中所述巨蛋白多肽和所述cubilin多肽之间的摩尔比处于从1:50至50:1的范围内，例如处于从1:10至10:1的范围内。13.根据项12的分离介质，其中所述巨蛋白多肽和所述cubilin多肽之间的摩尔比是10:1。14.根据项7-13中任一项的分离介质，其中固定的cubilin的表面密度是1-100000 个 cubilin 多妝分子每 P m2。15.根据项14的分离介质，其中固定的cubilin的所述表面密度是3000-10000个cubilin多肽分子每μπι2。16.根据项7-15中任一项的分离介质，其中至少一种cubilin多肽重组地或经化
学合成产生。17.根据前述项中任一项的分离介质，其中所述支持物的材料选自下组，该组由以下各项组成玻璃、纤维素、乙酸纤维素、壳多糖、壳聚糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、琼脂凝胶支持物、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、硅氧烷和淀粉酶包覆的粒子。
18.根据项17的分离介质，其中所述材料是聚苯乙烯，并且所述聚苯乙烯选自氨基磺酸聚苯乙烯和三乙醇胺甲基聚苯乙烯。19.根据项17的分离介质，其中所述材料是交联葡聚糖。20.根据项17-19中任一项的分离介质，其中所述支持物包括珠。21.根据项20的分离介质，其中所述珠是微粒子。22.根据项20的分离介质，其中所述珠是纳米粒子。23.根据前述项中任一项的分离介质，其中所述至少一种巨蛋白多肽和/或所述至少一种cubilin多肽和/或这二者共价附接到所述支持物。24.根据项23的分离介质，其中所述共价附接可以选下组，该组由以下各项组成共价性聚合物接枝、等离子体处理、物理吸附、化学吸附和化学衍生。25.用于体外处理复杂生物流体的医疗装置，包括根据前述项中任一项的分离介质。26.根据项25的医疗装置，其中所述复杂生物流体是血液。27.根据项25-26的医疗装置，其中所述复杂生物流体包含低分子量蛋白或其片段或衍生物。28.根据项27的医疗装置，其中所述低分子量意指具有50kDa或更低的分子量。29.根据项28的医疗装置，其中所述低分子量蛋白意指具有35kDa或更低的分子量。30.根据项27-29中任一项的医疗装置，其中所述低分子量蛋白是修饰的。31.根据项27-30中任一项的医疗装置，其中所述低分子量蛋白具有巨蛋白结合基序。32.根据项27-31中任一项的医疗装置，其中所述低分子量蛋白具有cubilin结合基序。33.根据项27-32中任一项的医疗装置，其中所述低分子量蛋白选自下组，该组由以下各项组成肽激素、酶、免疫球蛋白轻链、肌球蛋白和维生素结合蛋白及其片段和衍生物。34.根据项33的医疗装置，其中所述低分子量蛋白选自下组，该组由以下各项组成细胞因子、胰岛素、白蛋白、载脂蛋白、β2-和Ci1-微球蛋白、免疫球蛋白轻链、肌球蛋白和氧结合蛋白及其片段和衍生物。35.根据项25-34中任一项的医疗装置，其中所述装置在使用之前消毒。
36.根据项25-35中任一项的医疗装置，其中所述装置包含筛分滤器。37.根据项36的医疗装置，其中所述筛分滤器具有50kDa的截留。38.根据项37的医疗装置，其中所述截留是35kDa。39.根据项36-38中任一项的医疗装置，其中所述筛分滤器是纤维型、穿孔片型或网型滤器。40.根据项36-39中任一项的医疗装置，其中所述筛分滤器由例如选自下组的天然材料制成，该组由以下各项组成纤维素或其衍生物、壳聚糖、碳或氧化铝。41.根据项36-39中任一项的医疗装置，其中所述筛分滤器由例如选自下组的人造材料制成，该组由以下各项组成尼龙6-6、聚偏氟乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚醚砜、玻 璃和金属。42.根据项25-41中任一项的医疗装置，其中所述装置包括电荷滤器。43.根据项42的医疗装置，其中所述电荷滤器仅允许具有<8的pi的种类通过。44.根据项43的医疗装置，其中所述电荷滤器仅允许具有< 5. 8的pi的种类通过。45.根据项42-44中任一项的医疗装置，其中所述电荷滤器由例如选自下组的天然材料制成，该组由以下各项组成纤维素或其衍生物、壳聚糖、碳和氧化铝。46.根据项42-44中任一项的医疗装置，其中所述电荷滤器由例如选自下组的人造材料制成，该组由以下各项组成尼龙6-6、聚偏氟乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚醚砜、玻璃和金属。47.根据项36-46中任一项的医疗装置，其中当二者同时存在时，所述筛分滤器和所述电荷滤器是相同的滤器。48.用于体外处理复杂生物流体的透析装置，包括根据权利要求25-47中任一项所述的医疗装置。49.用于从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白或其片段或衍生物的方法，包括以下步骤a)提供复杂生物流体样品，含有对巨蛋白和/或cubilin具有结合亲和力的低分子量蛋白或其片段或衍生物，b)使所述样品与根据项1-24中任一项的分离介质或根据项25-48中任一项的装置在允许所述低分子量蛋白或其片段或衍生物与所述至少一种巨蛋白多肽和/或所述至少一种cubilin多肽结合的条件下接触，c)从所述支持物中分离所述样品，使得起初存在于所述样品中的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的总量的至少一部分保留在支持物上，并且d)回收含有减少量的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的所述样品。50.根据项49的方法，其中所述复杂生物流体是血液。51.根据项50的方法，其中所述血液是哺乳动物血液。52.根据项51的方法，其中所述哺乳动物血液是人血。53.根据项49的方法，其中所述复杂生物流体是血浆。54.根据项49的方法，其中所述复杂生物流体是尿。55.根据项49-54中任一项的方法，其中所述低分子量蛋白或其片段或衍生物具有50kDa或更低的分子量。56.根据项55的方法，其中所述低分子量蛋白或其片段或衍生物具有35kDa或更低的分子量。57.根据项49-56中任一项的方法，其中所述低分子量蛋白或其片段或衍生物是修饰的。58.根据项49-57中任一项的方法，其中所述低分子量蛋白或其片段或衍生物具
有巨蛋白结合基序。59.根据项49-58中任一项的方法，其中所述低分子量蛋白或其片段或衍生物具有cubilin结合基序。
60.根据项49-59中任一项的方法，其中所述低分子量蛋白选自下组，该组由以下各项组成肽激素、酶、免疫球蛋白轻链、肌球蛋白和维生素结合蛋白及其片段和衍生物。61.根据项60的方法，其中所述低分子量蛋白选自下组，该组由以下各项组成细胞因子、胰岛素、白蛋白、载脂蛋白、β2-和Ci1-微球蛋白、免疫球蛋白轻链、肌球蛋白和氧结合蛋白及其片段和衍生物。62.根据项49-61中任一项的方法，进一步包括使所述样品经历筛分过滤步骤，因而在进行步骤b)之前从样品中去除高分子量组分。63.根据62项的方法,其中所述闻分子量组分具有50kDa或更闻的分子量。64.根据63项的方法,其中所述闻分子量组分具有35kDa或更闻的分子量。65.根据项49-64中任一项的方法，进一步包括使所述样品经历电荷过滤步骤，因而在进行步骤b)之前从样品中去除具有不大于8的pi的组分。66.根据项65的方法，其中所述去除的组分是具有不大于5. 8的pi的组分。67.根据项62-66中任一项的方法，其中当二者同时存在时，所述筛分过滤和所述电荷过滤同时进行。68.根据项49-67中任一项的方法，其中所述方法进一步包括步骤e)，其中洗脱所述保留的低分子量蛋白或其片段或衍生物。69.用于治疗患有因低分子量蛋白或其片段或衍生物引起或加重的病状的哺乳动物受试者的方法，包括以下步骤a)从所述受试者提取血液，b)根据项的用途49-68中任一项的方法从所述提取的血液中去除低分子量蛋白或其片段或衍生物，从而起初存在于所述血液中的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的总量的至少一部分保留在支持物上，并且c)将含有减少量的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的血液再导入所述受试者中。70.根据项的方法69，其中血液的提取和再导入可以在一个连续的环中进行，所述环包括受试者的一部分血流。71.根据项1-24中任一项的分离介质的用途，用于血液透析、血液滤过和/或血液透滤。72.根据项25-48中任一项的医疗或透析装置的用途，用于血液透析、血液滤过和/或血液透滤。
73.根据项72的用途，其中所述装置与血液回路串联和/或平行地使用。74.根据项73的用途，其中所述血液回路是透析设备。75.根据项25-48中任一项的医疗或透析装置的用途，用于从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白。76.根据项25-48中任一项的医疗或透析装置的用途，用于恢复复杂生物流体的组成。77.根据项76的用途，其中复杂生物流体是血液。78.根据项77的用途，其中所述血液包含至少一种低分子量蛋白或其片段或衍生 物。79.根据69-70项中任一项的方法或根据项78的用途，其中所述低分子量蛋白或其片段或衍生物是修饰的。80.根据项69-70中任一项的方法或根据项78-79中任一项的用途，其中所述低分子量蛋白是炎性细胞因子。81.根据项69-70中任一项的方法或根据项78-79中任一项的用途，其中所述低分子量蛋白是免疫球蛋白轻链。82.根据项25-48中任一项的医疗或透析装置与连接至体外血液回路的另一个医疗或透析装置在平行或串联状态下的用途。83.根据项82的用途，其中所述其他医疗或透析装置是透析血液滤器或体外血液
增氧装置。现在将通过以下附图和实例，以在非限制性方式描述根据本发明用于结合低分子量蛋白的至少一种巨蛋白多肽和/或至少一种cubilin多肽的用途。附图简要说明
图1是一张凝胶照片，显示来自3个不同个体的肾活组织检查样品中的mRNA的RNA印迹结果。图注从左至右是“梯”、“活组织检查1”、“活组织检查2”和“活组织检查3”。图2是一张凝胶照片，它显示两种多肽，即MEGl (SEQ ID号2)和CUB5-8 (SEQ ID号16)的蛋白印迹结果。MEGl和CUB5-8的大小均是约40kDa。图3是在通过含有已经使巨蛋白和cubilin多肽固定到其上的Sepharose 的柱(HEP)或通过仅含有Sephamse 的柱(CTR)之前和之后，过滤(<30kDa)的血液的免疫印迹凝胶照片，其中血液来自健康志愿者(健康)和来自通过维持血液透析治疗的慢性肾病患者(尿毒症的)。图4显示来自反相HPLC (高效液相色谱法)的层析图，显示来自穿过(“SIZE+”)和不穿过(“SIZE-”)大小排阻柱和在穿过柱之前(“C0L-”)和之后(“C0L+”)的四份不同样品的结果，其中所述柱含有已经使多肽MEG3 (SEQ ID号4)和CUB1_7(SEQ ID号15)固定到其上的珠。图5是在穿过以不同巨蛋白和cubilin比率具有固定的巨蛋白和cubilin多肽的柱之前和之后的样品中总蛋白含量(TPC) (g/Ι)的图。图6A显示来自ELISA (酶联免疫吸附测定)测定的结果的图，显示在穿过具有固定的巨蛋白多肽MEG5-8(SEQ ID号12)的柱之后胰岛素量(pg/mL)的变化。显示了 3根不同柱的结果；对照柱(没有添加的抗体)、含有添加的抗胰岛素抗体的柱和含有添加的抗巨蛋白抗体的柱。图6B显示蛋白印迹物的凝胶的照片。第一泳道显示没有向其添加抗体的复杂生物流体的穿过。第二泳道显示向其添加抗胰岛素抗体的复杂生物流体的穿过。第三泳道显示向其添加抗巨蛋白抗体的复杂生物流体的穿过。第四泳道显示向其添加抗胰岛素抗体和抗巨蛋白抗体的复杂生物流体的穿过。对于每个穿过，提供TPC值。图7是2-D凝胶图片，显示(A) MEG柱和(B) CTRL柱对汇集的大鼠<30kDa血浆蛋白组的不同影响。图8是显示在汇集的血样穿过含有(MEG)或不含有(CTRL和SHAM)结合的巨蛋白的柱后，在3天记录肾切除(MEG和CTRL)和未进行肾切除的(SHAM)大鼠期间典型行为的频率的图。对于SHAM，n=4 ;对于MEG，n=3 ;和对于CTRL，n=3。SM在以下非限制性实例1-10中，显示使用巨蛋白和cubilin多肽用于从复杂生物流 体中去除至少一种低分子量蛋白的原理。此外，非限制性实例11-13显示，在某些环境下，巨蛋白多肽在从复杂生物流体中去除至少一种低分子量蛋白时足以获得令人满意的结果。实例I巨蛋白和cubilin cDNA的产生按照在Andersen (安徒生)CB 等人，(2010)，Nature (自然)464:445-448 中所述的过程。简言之,使用.AllPirep DNA/RNA/Protein微量试剂盒(Qiagen公司),如制造商所指示，从人肾皮质(来自3位个体的肾活组织检查)提取总RNA。使用Oligofcx 试剂盒(Qiagen公司)分离mRNA。使用Qiagen逆转录试剂盒，用表I和2中给出的引物，以产生编码所示巨蛋白和cubilin多肽(其完整氨基酸序列在所附序列表中提供)的DNA连同所示限制性酶的切割位点，进行RACE以获得cDNA。确保质量的RNA印迹在1%甲醛凝胶上以100V并以I μ g mRNA进行I小时，并且用辣根过氧化物标记的核糖核酸探针可视化以检验质量(图1)。表1:在RACE中使用的引物，以获得用于在大肠杆菌(E. coli)细胞中表达的巨蛋白和 cubilin cDNA
引物名称I引物序列和限制性位点^
MEGALIN—正向 GTCGACTCatggatcgcgggccggcagcag (Sal I)
MEGALIN—反向 GCGGCCGCctatacttcagagtcttctttaac (Not I)
MEG1—正向GAATTCtgtgacagtgcgcattttcg (EcoR I)
MEG1—反向CTCGAGccgatagcttccatccaaatttac (Xho I)
MEG2—正向GTCGACTCgttctcaatgtttctgttgaaacc (Sal I)
MEG2—反向GCGGCCGCtcgatctgttccatccacg (Not I)
MEG3—正向GGATCCattgtgaacagcagtctgg (BamH I)
MEG3—反向CTCGAGtcgatggtggccctccaaatcag (Xho I)
MEG4—正向GTCGACTCcgacacacggtgtatgatg (Sal I)
MEG4—反向GCGGCCGCtacttcagagtcttctttaac (Not I)
MEG5—正向GGATCCtgtgacagtgcgcattttc (BamH I)
MEG5—反向CTCGAGttcatccgcgtcatctgaacag (Xho I)
MEG6—正向GGATCCtgctcaagtcatcagataac (BamH I)
MEG6—反向CTCGAGgcaagcatgttcgtcactg (Xho I)
MEG7—正向GTCGACTCtgcggtggttaccagttcac (Sal I)MEG7—反向GCGGCCGCtctgtctaaaccatcaaagg (Not I)
MEG8—正向GAATTCcagtgtggcttattttcctt (EcoR I)
MEG8—反向CTCGAGgcggaagtttcctcccaatgtg (Xho I)
MEG9—正向GGATCCattgtgaacagcagtctgg (BamH I)
MEG9—反向CTCGAGatcaacacaagtccgcttgtc (Xho I)
MEG10—正向GTCGACTCgatattgatgaatgcacagag (Sal I) MEG10—反向GCGGCCGCtacttcagagtcttctttaac (Not I)
MEG5-8—正向GGATCCtgtgacagtgcgcattttc (BamH I)
MEG5-8—反向CTCGAGgcggaagtttcctcccaatgtg (Xho I)
CUBILIN—正向GTCGACTCatgatgaacatgtctttaccttttc (Sal I)
CUBILIN—反向GCGGCCGCttagctgtcccaagttaatcgg (Not I)
CUBEGF—正向GGATCCaaaaaggtttgcagcagcaatc (BamH I)
CUBEGF—反向CTCGAGaggaacctgacagagagctccag (Xho I)
CUB1-7—正向GGATCCtgtggagagtccctctcaggaa (BamH I)
CUB1-7—反向GCGGCCGCtgtctgccggtattcagccttg (Not I)
CUB5-8—正向GGATCCtgtggagaaattcttacagaac (BamH I)
CUB5-8—反向CTCGAGaccgtaaacaaaccactgct (Xho I)
CUB6-12—正向GGATCCtgtttgcaagactacacagatg (BamH I)
CUB6-12—反向CTCGAGgccaaatatcttcataaatgtg (Xho I)
CUB11-17—正向GGATCCtgcggaggccacatcctcacc (BamH I)
CUB11-17—反向CTCGAGctcttccatactggattcaaatcg (Xho I)
CUB16-22—正向CGGCCGtgtgggggcaacgtctacatccat (Eag I)
CUB16-22—反向CTGCAGggagattatcctataggaaaact (Pst I)
CUB21-27—正向GGATCCtgtggtggaatatttcattctg(BamH I)
CUB21-27—反向CTCGAGgctgtcccaagttaatcggaatgc(Xho I)表2 :在RACE中使用的引物，以获得用于在HEK293细胞中与Hisltl标签一起表达的巨蛋白和cubilin cDNA
引物名称I引物序列和限制性位点—
HIS-MEGALIN—正向CTCGAGTatggatcgcgggccggcagcag (Xho I)
HIS-MEGALIN—反向GGGCCCctatacttcagagtcttctttaac (Apa I)
HIS-CUBILIN—正向GGATCCaaaaaggtttgcagcagcaatc (BamH I)
HIS-CUBILIN—反向CTCGAGgctgtcccaagttaatcggaatgc (Xho I)实例2GST-偶联的巨蛋白多肽和cubilin多肽在大肠杆菌中的表达将如实例I中所述产生的cDNA产物连接至pGEX_4T_3载体中(GEHealthcare)并且使用电穿孔法转化至大肠杆菌菌株DH5 a (New EnglandBiolabs Inc.公司)中。通过DNA凝胶提取试剂盒(Promega公司)进行cDNA产物的再循环。通过在含有100mg/ml氨节青霉素的LB琼脂平板上涂布并且在37° C孵育过夜，鉴定转化的细胞。将单菌落接种至3mlLB-氨苄青霉素培养基中并且允许在37° C在回转摇床中生长过夜，伴以250转/分钟恒定振摇。接下来，将培养1:100稀释入200ml新鲜LB-氨苄青霉素(100mg/ml)培养基中并且在37° C以250转/分钟恒定振摇下孵育直至OD6tltl是约O. 5 (2-3小时)。随后通过向培养物添加IPTG至终浓度O. 5mM诱导蛋白表达，并且将培养物在15° C以250转/分钟恒定振摇再孵育过夜。次日，将培养在4° C以6000g离心10分钟以便形成细胞沉淀。仍在4° C，将沉淀重悬于IOml冷的裂解缓冲液中，在冰上超声处理(在30%振幅，5个10秒骤增和每次骤增之间的一个30秒冷却间隔时间)，并且通过Bradford (布拉德福德)反应监测蛋白释放(10 μ I级分+90 μ I水+Iml Bradford (布拉德福德)试剂(Pierce公司)；测量在590nm和450nm的吸光度，并且这些吸光度之间的比用来计算蛋白浓度)。通过在4° C以20000g离心30分钟使裂解物澄清，此后将上清液等分并且在冰上储存。对于质量控制，将重组质粒通过IllustraPlasmid Prep MiniSpin (GE Healthcare公司)根据制造商的说明书提取，使用表I中对所示多肽给出的限制性酶切割并且在这个试剂盒中提供的凝胶上评估。通过如Hodneland (郝德内兰德)等人，(2002), Proc Natl Acad Sci USA (美国国家科学院院刊)，91 (21) :9725-9中所述的谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和层析，完成表达的构建体的纯化。简而言之，将2ml谷胱甘肽-Sepharose (Sigma公司)树脂与玻璃柱中的细胞裂解物和Iml的O. 25M NaCl混合并且温和地搅拌I小时。使用3个柱体积每次15ml洗涤缓冲液(20mM Tris, pH 7. 5+0. 25M NaCl+lmM EDTA+2mM EGTA+0. 03%Brij-35 (Sigma公司))进行洗涤。随后使用预混的洗涤缓冲液进行蛋白洗脱，其中已经向其中添加20mM谷胱甘肽(Sigma公司)和NaOH以造成pH 8. O。在每次洗脱后，使用Bradford (布拉德福德)反应检查蛋白产率。接下来将纯蛋白(典型产率对于MEGl是9-12mg/L培养物并且 对于 CUB5-8 是 18-21mg/L 培养物)在 PBS 中洗脱，使用 VivaSpin 20 (Sartorius StedimBiotech公司)超滤离心柱在4° C和3000g浓缩，并且最后储存在-80° C。在图2中显示所获得产物的蛋白印迹凝胶的代表性样品。实例3生物素-偶联的巨蛋白多肽和cubilin多肽在大肠杆菌中的表达将半胱氨酸-生物素如先前所描述(Liu (刘)等人，Mol Biotechnol.(分子生物学技术)39(2) :141-53)那样合成。简而言之，将2. 6mmol N-t-Boc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸、3.1mmol四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鐵六四氟硼酸盐(TBTU)和3. 9mmol1-轻基苯并三唑添加至50ml无水二甲基甲酰胺(DMF)。将混合物在室温搅拌20分钟。接下来，添加7. 8mmol N-甲基吗啉和2. 6mmol生物素酰乙二胺(Promega公司)。允许反应在温和搅拌下继续3小时，此后使用配备有油泵的旋转蒸发器在真空中蒸发溶剂。将这种粗反应混合物溶解于200ml 二氯甲烷(DCM)中，并且将有机层用水萃取(3 X IOOml)，然后通过通过添加无水MgSO4 (25g)持续5分钟伴以定期搅拌而干燥。将生成的溶液(180ml)小心地滗析至清洁烧瓶中并且使用蒸发器在真空中浓缩。通过在玻璃柱中装填的硅胶(200g)上快速色谱(DCM中的4% -8%v/v MeOH)进行半胱氨酸-生物素的纯化。将如实例I中所述产生的cDNA产物(每个批次一个引物对)连接至pMD_18_TX载体中(Promega公司)并且使用电穿孔法转化至大肠杆菌菌株ER2566中。通过在37° C孵育过夜的含有100mg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上涂布,鉴定转化的细胞。将单菌落接种至3ml LB-氨苄青霉素培养基中并且允许在37° C在回转摇床中生长过夜，伴以250转/分钟恒定振摇。接下来，将培养1:100稀释入200ml新鲜LB-氨苄青霉素(100mg/ml)培养基中并且在37° C以250转/分钟恒定振摇下孵育直至OD6c 是约O. 5 (2_3小时)。然后通过向培养物添加至终浓度O. 5mM的异丙基β -D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，并且将培养物在15° C以250转/分钟恒定振摇再孵育过夜。次日，将培养在4° C以6000g离心10分钟以便形成细胞沉淀。仍在4° C，将沉淀重悬于IOml冷的裂解缓冲液中，在冰上超声处理(在30%振幅，5个10秒骤增和每次骤增之间的一个30秒冷却间隔时间)，并且通过Bradford (布拉德福德)蛋白测定法监测蛋白释放。通过在4° C以20000g离心30分钟使裂解物澄清，此后将上清液等分并且在冰上储存。将蛋白通过HPLC色谱以柱中每升培养物20ml壳多糖珠，使用流速O. 5-lml/分钟分离并且在该柱上使用30mM2_巯基乙磺酸(Sigma公司)和ImM半胱氨酸-生物素进行生物素酰化。最后，生物素酰化的蛋白用IOml PBS洗脱和储存在-80° C。实例4在HEK293细胞中表达全长加Hisltl-标记的巨蛋白和cubilin·
使用〖nvitrogcn Freestyle MAX 293表达系统(目录号K9000-10)连同载体pcDNA 4/HisMax A、B和C进行表达，在带有N端Hisltl-标签的CMV启动子控制下表达重组蛋白。使用在表2中提供的引物根据实例I获得cDNA。在开始实验前，将细胞建立至少5个传代。早期传代细胞用于实验(低于10次传代)。当到达I X IO6和3 X IO6个活细胞之间的细胞密度(总体上每48-72小时)时，将培养物分瓶。台盼蓝排除法用来确定细胞生存力(见下文)。FreeStyle 293表达培养基如所提供那样使用。对于悬浮FreeStyle 293-F细胞的转染，我们引入随同该试剂盒中所包括的基于阳离子脂质的FreeStyle MAX试剂。提供阳性对照pCMV SPORT-β gal作为用于转染和表达的阳性对照载体。为了转染30ml体积中的FreeStyleTM293-F细胞悬液，添加37. 5 μ g质粒DNA。在转染之前约24小时，将FreeStyle 293-F细胞以6-7 X IO5个细胞/ml传代。将烧瓶在37° C，8%C02时置于以135转/分钟转动的回转摇床平台上。在转染当日，检查细胞密度并且弃去含有少于1.2X106个细胞/ml的集落。接下来，将细胞稀释至I X IO6个细胞/ml。然后将30ml的细胞添加至每只125ml摇瓶中。随后将FreeStyle MAX转染试剂的管颠倒若干次并且随37. 5 μ g质粒DNA—起在试剂盒中所提供的OptiPro SFM (Invitrogen公司)内稀释至总体积O. 6ml。在一根分开的管中，也将OptiPro SFM中的37. 5 μ I FreeStyle MAX试剂稀释至总体积0. 6ml并且通过摇动温和地混合。将混合物在室温温和地孵育10分钟以允许复合物形成。然后，将1.2ml of DNA-脂质混合物添加至每个含有细胞的125ml瓶中。接下来，将转染的细胞培养物在37° C，8%C02在以135转/分钟转动的回转摇床平台上孵育5天。在转染4-8小时内，蛋白表达是可检测的，取决于所表达的构建体，转染后2天和7天之间具有最大蛋白产率。通过如Smith (史密斯)T等人(2000)，Arch Biochem Biophys (生物化学与生物物理学集刊)375 (I) : 195-200中所述的Ni亲和和阴离子交换FPLC色谱进行表达的构建体的纯化。接下来将纯蛋白在缓冲液中洗脱，使用VivaSpin 20(Sartorius Stedim Biotech公司)超滤离心柱在4° C和3000g浓缩，并且最后储存在-80° C。使用配备延迟提取和反射器(delayed extraction and reflector)的BrukerBiflex III仪(Bruker Daltonics公司),通过基质辅助激光解吸附电离时间飞行(MALD1-T0F)质谱法(MS)分析表达的蛋白。使用来自胰蛋白酶的自裂解性肽，内在校准肽谱。为鉴定蛋白，在NCBInr序列数据库中使用ProFound检索引擎执行检索。允许甲硫氨酸的一个错误切割、烷基化和部分氧化。根据概率值、“Z”值和序列覆盖率评估鉴定的显著性。肽的预期m/z均在质谱中显示为优势峰。实例5使用GST 使 MEGl 和 CUB5-8 端点附接(End-point attachment)到珠上
如实例2中所述那样表达的MEGl和CUB5-8与谷胱甘肽-Sephadex 珠如Hodneland (郝德内兰德)⑶等人，上文中所述那样附接。简而言之，将2mg谷胱甘肽-S^hadex (Sigma 公司)与玻璃柱中的 20 μ g 纯化的 MEG1、20 μ g CUB5-8 和 2ml O. 25MNaCl混合并且温和地搅拌I小时。使用缓冲液(20mM Tris, pH 7. 5+0. 25M NaCl+2mMEDTA+2mM EGTA+0. 03%Brij-35 (Sigma 公司))进行洗涤。通过以下方式检测成功的结合首先用PBS洗涤该柱5次(总计5个柱体积)，然后将 Img 珠与 O. 5ml 洗涤缓冲液(20mM Tris+0. 25M NaCl+2mM EDTA+2mMEGTA+0. 03%Brij-35+20mM谷胱甘肽)和NaOH混合直至pH 8. 0，并且对上清液进行蛋白印迹以检测MEGl和CUB5-8。实例6使用生物素-抗生物素蛋白附接使MEG3和CUB1-7端点附接到珠上 生物素酰化的蛋白如实例3中所述那样合成。将Dynabcads MyOne 链霉亲和素Cl (Invitrogen公司)根据制造商的说明书用于偶联。简而言之，在PBS中重悬并且洗涤3次后，将10 μ g MEG3纯化的蛋白和10 μ g CUB1-7纯化的蛋白添加至每mg珠。将混合物在室温孵育30分钟伴以温和转动。使用磁体来分离包覆的珠，然后将这些珠在添加有O. 1%BSA和O. 01%吐温-20的PBS中洗涤6次。储存该柱直至使用。通过以下方式检测成功的结合首先用PBS洗涤该柱15次(总计15个柱体积)，随后将Img珠与IOml的1. 8mg/ml EDTA pH 8. 2和95%甲酰胺混合。在室温下温和搅拌4小时后，对上清液进行蛋白印迹以检测MEG3和CUB1-7。实例7使用Hisltl-标签使全长巨蛋白和cubilin端点附接到珠上镍-氨三乙酸(N1-NTA)琼脂糖珠(Qiagen公司)在含有5mM CaCljP ImM MgCl2的Tris 缓冲盐水(TBS) (25mM Tris-HCl，137mM NaCl 和 3mM KCl, pH 7.0)中平衡，并且将如实例4中所述那样表达并且在相同缓冲液中制备的10 μ g重组His标记巨蛋白和cubilin蛋白在室温孵育I小时。添加额外的蛋白直至结合饱和(如通过检测到剩余上清液中的过量蛋白确定)。对于Iml镍琼脂糖珠，分别结合约12 μ g cubilin和巨蛋白。随后将蛋白包覆的珠用Iml TBS+20mM咪唑洗涤四次(每次5分钟)，并且在TBS中悬浮为50%浆液。通过以下方式检测成功的结合首先用PBS洗涤该柱15次(总计15个柱体积)，并且随后将Img珠与Iml的150mM咪唑混合，并且温和地在室温振摇5分钟。随后通过蛋白印迹法分析上清液以检测结合的巨蛋白和cubilin。实例8使用用巨蛋白和cubilin多肽包覆的珠结合循环型肽激素将如实例2中所述那样产生的GST与MEGl和CUB5-8或MEG3和CUB1-7的融合蛋白以1:1蛋白摩尔比如实例5中所述那样固定在谷胱甘肽Sephiw ei)4B珠上。这些珠然后沉积在一根5ml柱中(命名为“HEP”;4ml珠，死空间1ml)。制备仅具有S印harose 4B珠的对照柱(命名为“CTR”;4ml珠，死空间1ml)。静脉血(各自IOml)从健康人供体和一位依赖维持血液透析的患者获得并且与达肝素(dalteparin)混合(Pfizer ;lIE/ml血液)并经离心以便去除细胞。对于所得到的血浆,允许来自每位个体的I个等分试样按Ig穿过每根柱(HEP和CTR)。然后未结合的部分直接用于二维凝胶电泳，并且将柱随后用PBS洗涤10次，此后将结合的部分使用15ml洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8和IOmM还原型谷胱甘肽，Sigma公司)洗脱至每根填塞的柱中，将这些柱在室温摇动20分钟，随后以500g离心5分钟，排干，并且收集流体。洗脱过程对每根柱重复总计3次，并且将每根柱的总洗脱物汇集用于二维凝胶电泳。使用Bradford (布拉德福德)反应(10 μ I部分+90 μ I水+Iml Bradford (布拉德福德)试剂(Pierce公司)检验来自传代之前和之后的血浆的总蛋白含量；测量在590nm和450nm的吸光度，并且这些吸光度之间的比用来计算蛋白浓度)。相同的等分试样随后与含有β -巯基乙醇的等体积SDS-PAGE上样缓冲液混合并且在100° C煮沸5分钟。变性的蛋白随后在单个10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后在银溶液和考马斯亮兰溶液中染色。将纯化的蛋白转移至硝酸纤维素膜(在4° C恒流20mA过夜)和并用PBS中的5%奶粉封闭(室温2h)。将凝胶干燥并曝光并且在FujiX2000磷屏成像仪(Fuji公司)中扫描。银染凝胶然后在图像扫描仪(Image Scanner) (Amersham公司)中用MagicScan32 (Amersham 公司)和AIDA (IMG公司)软件扫描并且由Image Master 2D Elite软件(Amersham公司)分析。图3中显示生成的图像。实例9大小排阻对蛋白结合的影响静脉血(各自5ml)从需要维持血液透析的7位慢性肾病患者获得，汇集并且与达肝素(dalteparin) (Pfizer公司；ΙΙΕ/ml血液)混合。随后将混合物离心以去除细胞。对于所得血浆，允许Iml的I个等分试样穿过具有2mgSq3hadex 的柱，其中根据实例6，Sephadex 生物素酰化至MEG3和CUB1-7并且进行制备。使另一个Iml血浆等分试样立即穿过大小排阻滤器(Centricone 30K, Millipore公司；以5000g离心10分钟)并且然后穿过根据实例6制备的具有MEG3和CUB1-7的另一根柱。使用rpHPLC分开地分析来自4个组中每组的样品(存在和不存在大小排阻和在柱之前和之后)。在mRP_C18柱(Agilent Technologies公司)上加载300 μ g血衆。向每份样品中添加脲颗粒(22mg)连同6μ I净冰乙酸，产生终浓度6M脲和O. 1%乙酸。在流速O. 75ml/min和柱温度80° C进行反相HPLC，其中缓冲液A(水/0. 1%TFA)和B(乙腈/0. 1%TFA)的线性多阶梯度如下时间 Omin 3%B ；Imin 3%B ；6min 30%B ；39min 55%B ；49min 100%B ；53min100%B ；58min 3%B。如预期，大小排阻去除显著量的(但非全部的)更大分子量蛋白。这种去除导致剩余肽显著更好地结合至柱，这可能由于更少的竞争性结合。所得色谱图的代表性样品如图4显示。实例10通流体积和巨蛋白cubilin比率对总蛋白结合的影响如实例5中所述产生柱，其中例外在于纯化的巨蛋白结构域和cubilin结构域的比率(w/w)在 1:10 (lug MEGl 和 IOyg CUB5_8/ml 珠)和 10:1 (IOyg MEGl 和 I μ gCUB5-8/ml珠)之间变化。接下来，如实例9中那样获得静脉血浆。允许一个Iml血浆等分试样穿过具有2mg表面固定巨蛋白和cubilin的珠的玻璃柱，同时立即分析Iml血楽；。使用如实例8中所述的Bradford (布拉德福德)反应确定总蛋白含量(TPC)。实验重复3次，并且在图5中给出蛋白浓度变化的平均差异(在等分试样之后-之前)。因此，2mol巨蛋白对Imol cubilin的比率以类似的方式减少蛋白至Imol巨蛋白对2mol cubilin。然而，IOmol巨蛋白对lmol cubilin取得了过柱期间显著更高水平的蛋白去除。实例11胰岛素与亲和柱中MEG5-8的结合GST融合蛋白MEG5-8如实例2中所述那样产生并且如实例5中所述那样固定在谷胱甘肽-Sephadex 4B珠上(每2mg基质与20 Ug纯化MEG5-8混合)。这些珠随后沉积在3根相同的5ml柱中(4ml珠,死空间1ml)。为检验巨蛋白结合配体的特异性，我们使用与5%BSA (Sigma)和PBS混合至终体积 5ml 的 60pg/ml 纯化的人胰岛素(humulin 100IE/ml ；Sanof1-Aventis 公司)。将混合物添加至柱，本身(空白)、与抗巨蛋白抗体(Abeam公司；20ng)混合、与抗胰岛素抗体混合(Millipore公司；20ng)亦或与这两种抗体(20+20ng)混合。收集通流部分并且进行蛋白印迹，其代表性样品在图6B中给出。使用商业ELISA (Millipore公司)，我们还评估了通 过的样品中的胰岛素浓度(见图6A)。如图6B中所示，抗巨蛋白(而不是抗胰岛素)显著减少结合至柱的胰岛素，证明由我们的装置，以巨蛋白特异性方式捕获胰岛素。实例12全长巨蛋白柱的制备使用在Invitrogen Freestyle MAX HEK-293 细胞(目录号 R790-07)中事先制备的4个pcDNA 载体，如实例4中那样制备全长Hisltl标记的巨蛋白。使用蛋白印迹分析，用国家医学与健康研究院(巴黎)的Renata (雷纳塔)Kozyraki (科塞拉基)教授友好馈赠的抗体，如先前所描述那样证实表达(Le (勒)Panse (潘斯)等人(1995) Eur J Cell Biol (欧洲细胞生物学杂志)67(2) :120-129 ；Moestrup (莫斯特鲁普)等人(1993) J Biol Chem (生物化学杂志)268:16564-16570)。镍-氨三乙酸(N1-NTA)琼脂糖珠(Qiagen公司)在含有5mM CaCl2和ImM MgCl2的 Tris 缓冲盐水(TBS) (25mM Tris-HCl，137mM NaCl 和 3mM KCl, pH 7.0)中平衡，并且将相同缓冲液中制备的2μ g重组HislO标记的蛋白在室温孵育I小时。添加额外的蛋白直至结合饱和(如通过使用Bradford (布拉德福德)测定法检测到剩余上清液中的过量蛋白所确定)。对于Iml镍琼脂糖珠，结合约10 μ g巨蛋白。随后将蛋白包覆的珠用lmlTBS+20mM咪唑洗涤4次(每次5min)，并且在TBS中悬浮为50%浆液。通过以下方式检测成功的结合首先洗涤该柱15次(总计15个柱体积)，并且然后将Img珠与Iml的150mM咪唑混合,并且温和地在室温振摇5分钟。然后通过如上文的蛋白印迹法分析上清液，以检测结合的巨蛋白。最后,用珠制备的1. 5ml配备8μΜ熔块(frit) (VThatman Grade40盘式滤器)的高压灭菌玻璃柱，将其在室温干燥并且在温和振摇的同时用20%乙醇加满。将最终的柱加盖、密封和在8° C储存直至使用(在8天内)。实例13使用全长巨蛋白柱治疗5/6肾切除的大鼠动物从杳士睿华实验室(Charles River Labs)获得8周龄的雄性和雌性斯普拉道来(Sprague-Dawley)大鼠。将动物以1:1:1比率,随机分配给巨蛋白(MEG)或安慰剂(CTRL)柱或分配给假手术(SHAM)。柱如实例12中那样制备全长巨蛋白柱。以完全相同的方式制备安慰剂柱，但是使用没有结合的巨蛋白蛋白的镍-氨三乙酸(N1-NTA)琼脂糖珠(Qiagen公司)。动物处置:在I周适应期后，8只雄性大鼠如先前所述那样经历5/6部分肾切除术(Shimamura (岛村)和Morrison (莫里森)(1975)Am J Pathol (美国临床病理学杂志)79:95-106)。其他四只雄性大鼠经历假性腹壁部分切除术，而未经历肾实质摘除。每个肾切除组中的一只动物在手术期间死亡。在手术后，大鼠具有2周复原期，同时每日处置以减少实验应激。水和标准饲料在整个试验期间是随意可获得的。大鼠在标准笼中饲养，每个笼中容纳I只雄性和2只雌性。环境丰富度是可获得的。研究采样研究在手术后第15天开始。将大鼠每天在早上使用七氟醚(sevoflourane)气体吸入法麻醉一次,在整个过程期间伴以补充性02。使用每次分离性输血后取下的尾静脉导管和用以前的麻醉药油膏剂，将2ml血液抽入含有1.1mg 一水合柠檬酸作为抗凝血剂的管中。将血液混合并且立即经30kDa截留CentriCcme 滤器(Mi 11 ipore公司)离心，全部时间均保持处于39° C的加热罩中。随后将这个滤器用预加热至38° C 的O. 5ml等渗盐水小心地回洗(washed backwards)。接下来,使筛分滤器通流部分穿过预洗涤的珠柱(根据研究组所确定的MEG或CTRL)，并且收集O.1ml并储存在-80° C用于稍 后的汇集分析。将剩余的处理血浆与筛分滤器洗脱物/非通流部分混合。将所得到的处理血液立即经导管回注并且这个过程重复3次。使假性手术的动物暴露于安慰剂柱(即没有结合的巨蛋白)。行为监测在研究第20天开始，每天对大鼠记录24小时，持续3天时间。使用IR，由连接于PC (个人计算机)的数字视频摄像机(SonyHDR-CX550)进行记录。回看保存的图像，并且将大鼠的采食频率和性行为(如Sisk (西斯克)和Meek (米克)(2001)，CurrentProtocols in Neuroscience (神经科学实验操作手册)中的 “Sexual and ReproductiveBehaviors (性行为和繁殖行为)”第8. 2. 1-8. 2. 15节中所述)使用软件SBR (Claro (克拉洛)等人(1990) Physiol Behav (生理 & 行为)48 (3) : 489-493)定量。结果图7中显示来自经8天24次过柱的汇集的处理部分的凝胶和蛋白含量。与具有正常肾功能的SHAM组相比，肾切除的大鼠具有显著更高水平的血清肌酐(SHAMO. 8±0.1 对比 MEG1. 8±0.4 和 CTRL 1.5±0. 4mg/dl ;对于 SHAM 对比其他组，ρ〈0· 05)和脲(分别是22. 7±6· I对比45. 0±5· 7和57. 8±8· 2mg/dl ;ρ〈0· 05)。此外，如图8中所示，尽管在CTRL大鼠中性行为和采食行为这二者都显著减少，但是与SHAM未进行肾切除的大鼠相比，在MEG大鼠中不是这样。SHAM和CTRL之间的差异均是显著的，而SHAM和MEG之间的差异不是这样。采食、勃起和快速翻转(quickflip)行为在MEG大鼠中比CTRL大鼠中显著地更常见(P〈0. 05)，而长翻转(Iongflip)行为的差异在这两组之间不是统计显著的。
权利要求
1.一种分离介质,包括a.至少一种巨蛋白多肽，以及b.至少一种cubilin多肽，它们固定在一个支持物上。
2.一种分离介质，包括固定在一个支持物上的至少一种巨蛋白多肽。
3.一种分离介质，包括固定在一个支持物上的至少一种cubilin多肽。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的分离介质，其中所述巨蛋白多肽的氨基酸序列选自下组，该组由以下各项组成SEQ ID号1、SEQ ID号2、SEQ ID号3、SEQ ID号4、 SEQ ID 号:5、SEQ ID 号:6、SEQ ID 号:7、SEQ ID 号:8、SEQ ID 号:9、SEQ ID 号:10、SEQ ID号11和SEQ ID号12和与其具有至少80%，如至少85%、如至少90%、如至少95%同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的分离介质,其中当存在时,所述cubilin多肽选自下组，该组由以下各项组成SEQ ID号13、SEQ ID号14、SEQ ID号15、SEQ ID 号16、SEQ ID 号17、SEQ ID 号18、SEQ ID 号19 和 SEQ ID 号20 和与其具有至少 80% 如至少85%、如至少90%、如至少95%同一性的氨基酸序列。
6.一种用于体外处理复杂生物流体的医疗装置，包括根据权利要求1-5中任一项所述的一种分离介质。
7.一种根据权利要求6所述的医疗装置，其中所述复杂生物流体是血液。
8.一种根据权利要求6-7中任一项所述的医疗装置，其中所述复杂生物流体包括一种低分子量蛋白。
9.一种根据权利要求8所述的医疗装置，其中所述低分子量蛋白选自下组，该组由以下各项组成多种肽激素、酶、免疫球蛋白轻链、肌球蛋白和维生素结合蛋白。
10.一种根据权利要求6-9中任一项所述的医疗装置，其中所述装置包括一个筛分滤器(size filter)。
11.一种根据权利要求6-10中任一项所述的医疗装置，其中所述装置包括一个电荷滤器(charge filter)。
12.一种用于体外处理复杂生物流体的透析装置，包括一种根据权利要求6-11中任一项所述的医疗装置。
13.用于从复杂生物流体中体外去除一种低分子量蛋白或其片段或衍生物的方法，包括以下步骤a)提供复杂生物流体样品，其含有对巨蛋白和/或cubilin具有结合亲和力的一种低分子量蛋白或其片段或衍生物，b)使所述样品与根据权利要求1-5中任一项所述的一种分离介质或根据权利要求 6-12中任一项所述的一种装置在允许所述低分子量蛋白或其片段或衍生物与所述至少一种巨蛋白多肽和/或所述至少一种cubilin多肽结合的条件下接触，c)从所述支持物中分离所述样品，使得起初存在于所述样品中的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的总量的至少一部分保留在该支持物上，并且d)回收含有一个减少量的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的所述样品。
14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括使所述样品经历一个筛分过滤步骤，因而在进行步骤b)之前从样品中去除多种高分子量组分。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，进一步包括使所述样品经历一个电荷过滤步骤，因而在进行步骤b)之前从样品中去除具有不大于8的一个pi的多种组分。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括步骤e)，其中洗脱所述保留的低分子量蛋白或其片段或衍生物。
17.用于治疗患有因一种低分子量蛋白或其片段或衍生物引起或加重的病状的一个哺乳动物受试者的方法，包括以下步骤a)从该受试者提取血液，b)使用根据权利要求13-16中任一项所述的方法从所述提取的血液中去除低分子量蛋白或其片段或衍生物，使得起初存在于所述血液中的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的总量的至少一部分保留在该支持物上，并且c)将含有减少量的所述低分子量蛋白或其片段或衍生物的血液再导入该受试者中。
18.根据权利要求6-12中任一项所述的一种医疗或透析装置的用途，用于血液透析、 血液滤过和/或血液透滤。
全文摘要
提供了一种分离介质，包括固定在支持物上的至少一种巨蛋白多肽和/或至少一种cubilin多肽。还提供了包括该分离介质的多种装置，连同利用这种分离介质用于从复杂生物流体中体外去除低分子量蛋白其片段或衍生物的方法和用途。
文档编号C07K14/705GK103025762SQ201180030011
公开日2013年4月3日 申请日期2011年6月17日 优先权日2010年6月22日
发明者乔纳斯·阿克塞尔森 申请人:Jjk 医疗有限公司