使用免疫球蛋白片段的因子viia复合物的制作方法

专利名称：使用免疫球蛋白片段的因子viia复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于因子VIIa(factor Vila，FacVIIa)长效制剂的凝血复合物。更具体地，本发明涉及凝血复合物，其中FacVIIa、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fe区通过共价键结合在一起，从而显著延长血清半衰期、维持凝血功能、并且显著提高患者的角色行为(role behavior)的顺应性。本发明还涉及用于制备凝血因子复合物的方法。
背景技术：
据估算世界上有140，000人患有血友病，并且其发生率每年增长20%。遗传学上，血友病在每10，000个出生人口中发生一例，但只有血友病病例总数的约25%得到诊断或治疗。用凝血因子治疗后发生的最大问题之一是产生针对常规药物的抗体。血友病A是由凝血因子VIII缺乏引起的，且是这类疾病的最常见形式，占血友病病例的80%。血友病B 是与凝血因子XI缺乏相关的疾病，且占血友病病例的约20%。一些血友病患者产生针对给予他们之凝血因子的抗体，频率为对于血友病A为10 15%，对于血友病B为I 3%。FacVIIa是FacVII的活化形式。肝脏所产生的FacVII是由406个氨基酸构成的酶，其中10位为Y -羧基化谷氨酸，145位和322位为N-糖基化天冬酰胺，并且52位和60位为O糖基化丝氨酸。它具有两个EGF样结构域和一个丝氨酸蛋白酶结构域，且通过152位精氨酸与153位异亮氨酸之间的键切割(bond cleavate)而活化,这导致重链中的活性部位暴露。在该过程中，与轻链和重链键合在一起的单链FacVII被转化为FacVIIa，其具有分开的轻链和重链的双链结构。与其他多种凝血因子不同，FacVIIa作用于凝血机制的辅助途径，不产生抗体，因此可以高剂量施用。因此，FacVIIa适用于治疗血友病A和B，并且已开始用作血友病常规治疗剂的替代物，这是因为它在抗体产生和高剂量施用方面可安全地使用。此外，产生响应于给予血友病患者之因子的抗体使得难以应用除FacVIIa以外的凝血因子。但是，尽管FacVIIa不引起产生针对它的抗体，但它具有各种凝血因子中最短的血清半衰期。因此，FacVIIa不仅需要频繁地施用，给患者带来痛苦，而且需要较大的剂量，给患者带来经济负担。为克服这些缺点，应将FacVIIa配制成预期用于预防血友病的长效形式，而不仅是作为出血后的补充因子。rVIIa-FP (CSL Behring)(其中白蛋白与FacVIIa的C端融合)处于临床前期，并且发现它在大鼠中的血清半衰期与天然FacVIIa相比提高了 6. 7倍。然而，4. 38小时的半衰期太短，这使它仍不足以有效地用于血友病的预防和治疗。此外，FacVIIa的聚乙二醇化脂质体制剂PEGLip-FVIIa(Omri)也处于临床前期，并且血清半衰期仅为天然FacVIIa的两倍。MAXY-VII (Bayer/Maxygen)和 NN7128 (Novo/Neose)是因子 VII 产品，二者分别通过Gla结构域突变和高糖基化以及通过40K聚乙二醇化而延长血清半衰期，但在I期和II期研究的过程中，它们各自的血清半衰期比天然FacVII长5倍，这仍不足以用于血友病的预防和治疗。

发明内容
技术问题为了尽可能延长血清半衰期并同时维持体内活性而产生了本发明，使用了这样的制备方法，其中通过共价键将免疫球蛋白Fe、非肽基聚合物和FacVIIa位点特异性地彼此相连接。结果，凝血因子复合物的血清半衰期被显著地延长至长达60小时，这被证实比通过常规的聚乙二醇化或框内融合(in-frame fusion)技术所获得的血清半衰期长得多。解决方案因此，本发明的目的是提供=FacVIIa复合物，其允许在保持相对高水平体内活性的同时延长FacVIIa的血清半衰期，从而发挥出极好的凝血功能；包含所述复合物的长效制剂；以及所述复合物的制备方法。
发明优点如上所述，本发明的FacVIIa复合物确保了 FacVIIa的体内活性，并显著延长了FacVIIa的血清半衰期，因此所述复合物可用于开发长效FacVIIa制剂，其可提高血液不凝固患者的角色行为的顺应性。附图简述

图1是示出SD大鼠中FacVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa的血液水平随时间变化的图。图2是不出Novoseven、FacVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa的比较性体外效能测试结果的图。图3是不出Novoseven、FacVIIa和免疫球蛋白Fc-PE G-FacVIIa的比较性体外效能测试结果的图。最优实施方式根据本发明的一个方面，为实现上述目的，本发明论述了一种FacVIIa复合物，其中FacVIIa通过非肽基聚合物与免疫球蛋白Fe区相连接。本文中使用的术语“FacVIIa”是指凝血因子VII的活性形式。优选地，本发明的FacVIIa复合物通过FacVII复合物的活化来制备。在这种情况中，长效复合物由FacVI1、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fe区来制备，然后使其经过活化过程以形成包含FacVIIa、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fe区的FacVIIa复合物，其间所述复合物的体内活性增强且结构上变得更均一。将FacVII复合物转化为FacVIIa复合物的活化方法可包括但不限于柱上活化(on-column activation)法和溶液内活化(in-solution activation)法。优选地，柱上活化用于本发明的FacVII复合物。在柱上活化法中(还称为固相活化法)，将FacVIIa复合物固定在阴离子交换柱上，然后进行“自活化”，无需特殊的添加物。与柱上活化法不同，溶液内活化法需要多种因素(例如，钙离子浓度、pH、温度和FacVII浓度)来活化FacVII。本发明的FacVIIa是FacVII的活化肽，其参与凝血机制的辅助途径。所述肽中有天然FacVII的活化形式，FacVIIa的激动剂、前体、衍生物、片段和变体。
本文中使用的术语“FacVIIa激动剂”是指表现出与FacVIIa相同生物活性的物质,与FacVIIa的结构无关。本文中使用的术语“FacVIIa衍生物”是指具有体内调节凝血之功能的肽，其具有与天然FacVIIa至少80%的氨基酸序列同源性，并且可在一些氨基酸残基处通过化学取代(例如，α -甲基化、α -羟基化)、缺失(例如，脱氨基)或者装饰(decoration)(例如，N-甲基化)进行修饰。本文中使用的术语“FacVIIa衍生物”是指在FacVIIa氨基酸序列中添加或缺失一个或更多个氨基酸残基并且具有体内凝血活性的肽。所添加的氨基酸残基可是非天然氨基酸(例如，D-氨基酸)。 本文中使用的术语“FacVIIa变体”是指一个或更多个氨基酸与FacVIIa的氨基酸序列不同并且具有体内凝血活性的肽。除了单个的FacVIIa激动剂、衍生物、片段和变体之外，还可使用具有其性质组合的肽(例如，氨基酸序列中一个或更多个氨基酸残基不同且在其N端氨基酸处脱氨基的肽)，只要其具有凝血功能即可。优选地，本发明的FacVIIa复合物由非肽基聚合物、免疫球蛋白Fe区和FacVIIa组成，所述非肽基聚合物的一端与免疫球蛋白Fe区相连接，而所述非肽基聚合物的另一端与FacVIIa的N端相连接。更优选地，在本发明的FacVIIa复合物中，非肽基一端与免疫球蛋白Fe区相连接，而另一端与FacVIIa轻链的N端相连接。在FacVIIa的情况中使用的术语“N端”旨在涵盖包含FacVIIa之N端的区域。因此，在本发明的FacVIIa复合物中，非肽基聚合物可与FacVIIa最N端的氨基酸残基相连接，或者与距离N端稍远的氨基酸残基相连接，只要FacVIIa复合物保持期望的功能。因为FacVII在活化前是轻链与重链彼此相连接的单链结构，所以仅轻链的N端暴露在外。将FacVII转化为FacVIIa(152位精氨酸与153位异亮氨酸之间切割)，暴露了重链的活性部位，153位的异亮氨酸为重链的N端。因为重链N端在FacVIIa的活性中发挥重要作用，聚合物必须与轻链的N端(而非重链)相连接，从而提高效价。在一个实施方案中，PEG与免疫球蛋白Fe区的N端相连接，并选择性地与FacVII轻链的N端偶联以产生FacVI1-PEG-免疫球蛋白Fe复合物。然后实施另外的活化方法以完成FacVI1-PEG-免疫球蛋白Fe复合物。根据本发明制备的FacVI1-PEG-免疫球蛋白Fe复合物的血清半衰期为60小时，远长于常规治疗剂的血清半衰期，并在动物模型中显示出极好的凝血作用，因此可制备成保留极好体内活性的长效FacVIIa制剂。免疫球蛋白Fe区是可在体内代谢的可生物降解的多肽，因此可安全地用作药物载体。此外，免疫球蛋白Fe区在生产、纯化和产率方面更有优势，这是因为其与整个免疫球蛋白分子相比相对较小。此外，由于抗体彼此之间的氨基酸序列不同，可以预计的是，移除高度异质性的Fab极大地提高物质的同质性，并且降低诱导血液抗原性的可能性。本文中使用的术语“免疫球蛋白Fe区”是指缺乏轻链和重链可变区、重链恒定区I (CHl)和轻链恒定区I (CLl)的免疫球蛋白片段，即包含重链恒定区2和3 (CH2和CH3)的片段。任选地，重链恒定区还可包含铰链区。此外，只要显示出优于典型Fe区或与其基本相同的作用，本发明的免疫球蛋白Fe区也可以是延长的Fe区，其除了重链恒定区2和3(CH2和CH3)之外，还包含整个重链恒定区1 (CHl)和/或轻链恒定区I (CLl)或其一部分，仅排除免疫球蛋白轻链和重链的可变区。此外，它可以是这样的区域其中缺失对应于CH2和/或CH3区的相当长部分的氨基酸序列。因此，本发明的免疫球蛋白Fe区可由以下部分构成DCHl结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2) CHl结构域和CH2结构域，3) CHl结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5) —个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合，或者6)每个重链恒定区结构域和轻链恒定区结构域的二聚体。此外，本发明的免疫球蛋白Fe区不仅可包括野生型Fe，并且包括其氨基酸序列突变体。本文中使用的的术语“氨基酸序列突变体”是指由于一个或更多个氨基酸残基的缺失、插入、保守或非保守替换或其组合而不同于野生型的氨基酸序列。例如，在IgG Fe中，已知对于连接重要的214至238、297至299、318至322或327至331位的氨基酸残基可用作合适的修饰部位。可使用多种衍生物，例如通过移除二硫键部位、移除天然Fe的数个N端氨基酸或者向天然Fe的N端添加甲硫氨酸而制备的那些。此外，补体结合部位，例如Clq结合部位或ADCC部位可被去除以移除天然Fe区的效应子功能。制备免疫球蛋白Fe区的氨基酸序列突变体的技术在国际专利公布的No. WO 97/34631和WO 96/32478等中公开。不改变分子活性的蛋白质或肽分子中的氨基酸替换是本领域公知的。(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最常见替换发生在以下氨基酸残基之间Ala/Ser、Val/Ike、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和 Asp/Gly。任选地，氨基酸可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化(acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化以及酰胺化来修饰。上述Fe衍生物显示出与野生型相同的生物活性，但当遇热和pH时具有提高的结构稳定性。这些Fe区可作为来自人或动物(例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)的天然Fe区而获得，或者作为来自经转化动物细胞或微生物的重组或衍生化Fe区。天然Fe区可通过对从人或动物样品中分离的整个免疫球蛋白进行蛋白酶消化而获得。免疫球蛋白被木瓜蛋白酶切割成Fab和Fe，被胃蛋白酶切割成pF' c和F(ab' )2，随后用大小排阻色谱从其中分离Fe或pF' Co优选地，优选从微生物中获得的重组人Fe区。可用于本发明的免疫球蛋白Fe区可被糖基化至与天然形式相同的程度或更高和更低的程度，或者可被去糖基化。免疫球蛋白提高或降低的糖基化或去糖基化可通过典型方法实现，例如通过使用化学方法、酶法或使用微生物的基因工程方法。在本文中，当去糖基化时，所述免疫球蛋白Fe区的补体(Clq)结合变得显著降低，并且其抗体依赖细胞毒性或补体依赖细胞毒性降低或丧失，所以它不诱导不必要的体内免疫应答。在这种情况下，免疫球蛋白Fe区的去糖基化或无糖基化更符合作为药物载体的目的。本文中使用的术语“去糖基化”旨在表示从Fe区酶促移除糖。当与Fe区结合使用时，术语“无糖基化”意为由原核生物(优选由大肠杆菌(E. coli))表达的不含糖的Fe区。免疫球蛋白Fe区可源自人或动物(例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)，优选源自人。此外，免疫球蛋白Fe区可来源于IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合体。优选地，Fe区来源于人血液中最丰富的IgG或IgM,且最优选来源于IgG (已知其可延长配体结合蛋白质的血清半衰期)。本文中使用的“组合”意为编码相同来源的单链免疫球蛋白Fe区的多肽与不同来源的单链多肽相连接以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可由两种或更多种选自IgGlFc, IgG2Fc、IgG3Fc 和 IgG4Fc 的片段形成。本文中使用的术语“杂合体”意为编码两种或更多种不同来源免疫球蛋白Fe区的序列存在于单链免疫球蛋白Fe片段中。在本发明中，多种类型的杂合体是可能的。即，结构域杂合体可由选自 IgG Fe、IgM Fe、IgAFc、IgE Fe 和 IgD Fe 的 CHl、CH2、CH3 和 CH4 中的一至四个结构域构成，并且可包含铰链区。IgG分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类，且本发明可包括其组合或杂合体。优选 的是IgG2和IgG4亚类，且最优选的是几乎不具有效应子功能(例如，CDC(补体依赖细胞毒性))的IgG4Fc区。即，最适宜作为本发明药物载体的免疫球蛋白Fe区是源自人IgG4的无糖基化Fe区。源自人的Fe区比非人来源的Fe区更优选，后者可在人体内充当抗原并引起不期望的免疫应答，例如产生针对所述抗原的新抗体。本文中使用的术语“非肽基聚合物”是指包含通过除肽键之外的任何共价键结合在一起的至少两个重复单元的生物相容性聚合物。所述非肽基聚合物可具有两个或三个末端官能团。对本发明来说，可用的非肽基聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA (聚乳酸)和PLGA (聚乳酸乙醇酸)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合。最优选的是聚乙二醇。它们的衍生物是本领域中公知的，且可很容易地用本领域公知的方法制备的衍生物也在本发明的范围内。通过框内融合技术构建的在融合蛋白中使用的常规肽聚合物的缺点在于它们在体内易被蛋白酶切割，因此不能确保通过载体延长血清半衰期。相反，对蛋白酶有抗性的本发明聚合物保持肽的血清半衰期，如同载体那样。因此，只要对体内蛋白酶有抗性，任何非肽基聚合物均可无限制地在本发明中使用。非肽基聚合物分子量范围为I至IOOkDa,优地I至20kDa。另外，与免疫球蛋白Fe区相连接的非肽基聚合物不仅可以是单独的聚合物，还可以是不同聚合物的组合。可用于本发明的非肽基聚合物具有与免疫球蛋白Fe区和蛋白质药物偶联的官能团。上文中讨论的非肽基聚合物具有两个或三个末端。且官能团优选选自醛、丙醛、丁醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物。对于琥珀酰亚胺，还可使用其衍生物包括琥珀酰亚胺丙酸酯(succinimidyl propionate)、轻基玻拍酸亚胺(hydroxy succinimidyl)、琥拍酰亚胺乙酸酯(succinimidylcarboxymethyl)或琥拍酰亚胺碳酸酯(succinimidylcarbonate)。尤其是当所述非肽基聚合物在其两端具有醛官能团时，所述聚合物可通过其间最小的非特异性反应有效地在其两端分别与生理活性多肽和免疫球蛋白相连接。通过经由醛键的还原烷基化产生的终产物比通过酰胺键连接的那些更稳定。醛官能团在低PH下与氨基端特异性地反应，而在高pH(例如，pH 9.0)时，可与赖氨酸残基形成共价键。非肽基聚合物的两个或三个末端官能团可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一端具有马来酰亚胺基团，并且其他端或另一端可具有醛基、丙醛基或丁醛基。当在两端具有羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，羟基可在用于本发明之前被活化成上述官能团。或者，市售的具有经修饰官能团的聚乙二醇可用于制备本发明的蛋白质复合物。根据本发明的另一个方面，本发明提供用于凝血的药物组合物，其包含FacVIIa复合物。优选地，本发明提供用于治疗凝血相关疾病(包括血友病、出血、急性脑内出血、创伤和FacVII缺乏症)的药物组合物。本文中使用的术语“施用”意为通过某种适合的方法将预定量的物质引入患者中。只要能引导复合物到达靶组织，可使用任何施用途径。考虑多种施用方式，包括腹膜内、静 脉内、肌内、皮下、皮内、经口、局部、鼻内、肺内和直肠内，但本发明不限于这些施用方式。然而，由于肽在经口施用后被消化，应当对用于经口施用之组合物的活性成分进行包衣或将其配制成阻止在胃中降解。优选地，可以注射剂形式施用本发明的组合物。此外，可使用某种能够将活性成分运送到靶细胞中的装置来施用本发明的药物组合物。 包含根据本发明复合物的药物组合物可包含可药用载体。对于经口施用，所述可药用载体可包括黏合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂和芳香物质(odoriferous substance)。对于可注射制剂,所述可药用载体可包括缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于用于局部施用的制剂，所述可药用载体包括基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。可将本发明的药物组合物配制成与上述可药用载体组合的多种剂型。例如，对于经口施用，可将所述药物组合物可配制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂或薄片剂(wafer)。对于可注射制剂，可将所述药物组合物可配制成单位剂型，例如单剂量剂型的安瓿或多剂量容器。还可将药物组合物配制成溶液剂、混悬剂、片剂、丸齐U、胶囊剂和长效制剂。适用于药物制剂的载体、赋形剂和稀释剂包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇(erythritol)、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶(acacia rubber)、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。此外，药物制剂还可包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、芳香物质和防腐剂。可通过活性组分的药物类型以及通过数种相关因素(包括待治疗疾病的类型，施用途径，患者的年龄、性别、体重和疾病严重程度)来确定本发明药物组合物的剂量。由于本发明的药物组合物具有非常长的体内作用时间和高效价，所以它具有显著降低药物施用频率的优点。根据本发明的另一方面，本发明提供用于治疗凝血相关疾病的方法，其包括向对其有需要的对象施用本发明的FacVIIa复合物或药物组合物。优选地，所述疾病是由凝血不充分引起的，并且可包括但不限于血友病、出血、急性脑内出血、创伤和FacVII缺乏症。所述对象可以是哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、猪、牛、狗、绵羊等，优选人。FacVIIa复合物、组合物和施用如上所述。
根据本发明的另一方面，本发明提供用于制备FacVIIa复合物的方法，其包括(I)将末端具有醛、马来酰亚胺或琥珀酰亚胺衍生物作为官能团的非肽基聚合物通过共价键与免疫球蛋白Fe区的胺基相连接以产生缀合物；(2)从步骤(I)的反应混合物中分离所述非肽基聚合物-免疫球蛋白Fe区缀合物；(3)将FacVII与所分离缀合物中所述非肽基聚合物的另一端共价相连接以得到FacVII复合物，其中所述非肽基聚合物一端与所述免疫球蛋白Fe区相连接，而另一端与FacVII相连接；和 (4)将步骤(3)的FacVII复合物活化成FacVIIa复合物，其中FacVIIa通过所述非肽基聚合物与所述免疫球蛋白Fe区相连接。根据本发明的另一方面，本发明提供用于制备FacVIIa复合物的方法，其包括(I)将每一末端具有醛基的非肽基聚合物于pH 5. O至7. O下通过共价键与免疫球蛋白Fe的N端相连接以产生免疫球蛋白-非肽基聚合物缀合物；(2)从步骤(I)的反应混合物中分离所述缀合物；(3)将FacVII与所述缀合物中所述非肽基聚合物的另一端共价相连接以形成FacVII复合物，其中所述非肽基聚合物一端与所述免疫球蛋白Fe区相连接，而另一端与FacVII相连接；和(4)将步骤(3)的FacVII复合物活化成FacVIIa复合物，其中FacVIIa通过所述非肽基聚合物与所述免疫球蛋白Fe区相连接。根据本发明的另一方面，本发明提供用于制备FacVIIa复合物的方法，其包括(I)将每一末端具有醛基的非肽基聚合物通过共价键与FacVII相连接以产生缀合物；(2)从步骤(I)的反应混合物中分离所述FacVI1-非肽基聚合物缀合物；(3)将免疫球蛋白Fe区与所分离缀合物中非肽基聚合物的另一端共价相连接以产生FacVII复合物，其中非肽基聚合物一端与免疫球蛋白Fe区相连接，另一端与FacVII相连接；和(4)将步骤(3)中FacVII复合物活化成FacVIIa复合物，其中FacVIIa通过非肽基聚合物与免疫球蛋白Fe区相连接。优选地，将所述FacVII复合物附着于阴离子交换柱，并通过柱上活化(自活化)而活化成FacVIIa复合物。在此方法中，FacVII优选地在其N端与非肽基聚合物相连接。更优地，上述N端来自FacVII的轻链。在此方法的一个优选的实施方案中，FacVII是天然FacVII，或FacVII激动剂、前体、衍生物、片段或变体。最优选的是天然FacVII。此方法的另一个优选的实施方案中，FacVIIa是天然FacVIIa，或FacVIIa激动剂、前体、衍生物、片段或变体。最优选的是天然FacVIIa。可用于本发明方法的非肽基聚合物的实例包括聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化的多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA (聚乳酸)和PLGA (聚乳酸乙醇酸)、脂质聚合物、几丁质和透明质酸。最优选的是聚乙二醇。本发明的方法中，优选地，非肽基聚合物具有醛基衍生物作为末端官能团，并且更优选地在三个末端具有醛基官能团。
具体实施例方式通过以下列出的用以举例说明的实施例可更好地理解本发明，但所述实施例不应解释为限制本发明。实施例1 :免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa复合物的制备将免疫球蛋白Fe在N端用5K丙醛(3) PEG (具有三个末端丙醛基团的PEG，N0F，日本)聚乙二醇化。就这一点而言，6mg/mL的免疫球蛋白Fe与PEG在4°C下反应4. 5小时，免疫球蛋白Fe与PEG的摩尔比设定为1: 2。该反应在pH 6. O的IOOmM磷酸钾缓冲液中，在20mM的SCB(NaCNBH3)作为还原剂存在下进行。将反应混合物加载到S0URCEQ(LRC2585ml， Pall公司)上以纯化单聚乙二醇化的免疫球蛋白Fe。然后，将FVII与免疫球蛋白Fc_5KPEG以1: 10(FVI1:免疫球蛋白Fc-5K PEG)的摩尔比在4°C下偶联18小时，总蛋白质浓设定为20mg/mL。偶联反应在pH 6. O的IOOmM磷酸钾中，在20mM SCB作为还原剂存在下进行。偶联反应混合物通过流过两个柱进行纯化。为去除仍未偶联的免疫球蛋白Fc-5K PEG缀合物，采用了 SOURCE Q(LRC2585ml，Pall Corporation) 给以 20mM Tris (pH 7.5)中 IMNaCl的盐梯度，该柱首先洗脱相对弱结合的免疫球蛋白Fc-5K，然后是免疫球蛋白Fc_3臂PEG-FVII。然后，使用SOURCE ISO (GE Healthcare)柱进行第二纯化以将免疫球蛋白Fc_3臂PEG-FVII与FVII和FVII多聚物杂质分离。在这种情况中，FVI1、免疫球蛋白Fc_3臂PEG-FVII和FVII多聚物杂质以该顺序洗脱。为了活化，将免疫球蛋白Fc-3臂PEG-FVII再加载到SOURCE Q上，随后倒入含有1. 75mM钙离子的流动相6小时。用35mM钙离子进行洗脱以获得免疫球蛋白Fc_3臂PEG-FVIIa0柱SourceQ(LRC2585ml, Pall 公司)流速4ml/分钟梯度AO —7% I 分钟B，7% —40%80分钟B(A :20mM Tris pH7. 5,B A+1M NaCl)柱S0URCEISO (23ml, 16/10HR 柱，GE Healthcare)流速2ml/分钟梯度B100 — 40% 60 分钟 A (A 20mM Tris pH7. 5，B A+1. 6M(NH4)2SO4)柱SourceQ(15ml, 16/10HR 柱，GE Healthcare)流速1ml/分钟流动相20mMTris pH 7. 5+1. 75mM CaCl2+l. 25mM NaCl实施例2 20k PEG-FacVIIa(N)缀合物的制备将FVII (FacVII)在 N 端用 20K mPEG 丁醛(Nektar，USA)聚乙二醇化。就这一点而言，5mg/mL的FVII与PEG在4°C下反应10小时，FVII与20K PEG的摩尔比设定1: 5。该反应在pH 5. O的IOOmM乙酸钠缓冲液中，在20mM SCB (NaCNBH3)作为还原剂存在下进行。单聚乙二醇化的FVII通过RESOURCE Q(lml，预包装，GE Healthcare)来纯化。给以20mMTris (pH 7.5)中IM NaCl的盐梯度，该柱依次洗脱多聚乙二醇化的FVI1、单聚乙二醇化的FVII 和 FVII。然后，使用 Superdex_200 (Hiroad 16/60，GE Healthcare)柱进行第二纯化以将单聚乙二醇化的FVII与FVII和FVII多聚物杂质分离。为了活化，将单聚乙二醇化的FVII再加载到SOURCE Q上，随后倒入含有1. 75mM钙离子的流动相洗脱I小时。用35mM钙离子进行洗脱以获得单聚乙二醇化的FVIIa。柱RESOURCEQ(lml，预包装，GE Healthcare)流速0.5ml/ 分钟梯度AO — 50% 50 分钟 B (A 20mM Tris pH 7· 5，B A+lMNaCl)柱Superdex_200(Hiroad 16/60HR 柱，GE Healthcare)流速1ml/分钟
流动相PBS柱RESOURCEQ(lml，预包装，GE Healthcare)流速0.5ml/ 分钟流动相20mMTris pH7. 5+1. 75mM CaCl2+l. 25mM NaCl实施例3 20K PEG-FacVIIa(Lys)缀合物的制备将FVII在赖氨酸残基处用20k mPEG SPA(Nektar，USA)聚乙二醇化。就这一点而言，3mg/mL的FVII与20k PEG在室温下反应3小时，FVII与20k PEG的摩尔比设定为1: 5。该反应在pH 8.0的IOOmM磷酸钠缓冲液中进行。单聚乙二醇化的FVII通过RESOURCE Q(lml，预包装，GE Healthcare)来纯化。给以 20mM Tris (pH 7.5)中 IM NaCl的盐梯度，该柱依次洗脱出多聚乙二醇化的FVI1、单聚乙二醇化的FVII和FVII。然后，用Superdex_200 (Hiroad 16/60, GE Healthcare)柱进行第二纯化以将单聚乙二醇化的FVII与FVII和FVII多聚物杂质分离。为了活化，将纯化的单聚乙二醇化的FVII再加载到SOURCE Q上，随后在柱上倒入含有1. 75mM钙离子的流动相I小时。用35mM钙离子进行洗脱以获得单聚乙二醇化的FVIIa。柱SOURCEQ (23ml, HR 柱，GE Healthcare)流速2ml/分钟梯度AO — 50% 50 分钟 B (A 20mM Tris pH 7· 5，B A+lMNaCl)柱Superdex_200(Hiroad 16/60HR 柱，GE Healthcare)流速1ml/分钟流动相PBS柱RESOURCEQ(lml，预包装，GE Healthcare)流速0.5ml/分钟流动相20mMTris pH 7. 5+1. 75mM CaCl2+l. 25mM NaCl实施例4 =FVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa血清半衰期的测量为评价其药代动力学参数，将FVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa各自以100 μ g/kg的剂量静脉内注射到正常SD大鼠中，随后进行ELISA分析以获得血清水平。静脉内注射后，在0. 25,0. 5、1、2、5、10、24和48小时从施用FVIIa的大鼠以及在0. 25,0. 5、1、2、5、10、24、48、72、96和120小时从施用免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa的大鼠取0. 5ml血样。将血样收集在装有朽1檬酸钠的试管中以防止凝固，用Eppendorf高速微型离心机离心5分钟以分离血清。通过使用FVIIa特异性抗体的ELISA(MUBIND，因子VIIaELISA试剂盒，American diagnostic inc.)测量血清蛋白质水平。图1和表I中给出了 FVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa的血清浓度-时间曲线和药代动力学分析结果。在如下的表格中，Tmax指药物达到最大血清浓度所需时间，T1/2指药物血清半衰期，并且MRT (平均滞留时间)指药物分子滞留在体内的平均时间。如表I和图1所示，观察到免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa具有长达约60小时的极好血清半衰期。表ISD大鼠中FVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa的药代动力学

权利要求
1.FacVIIa复合物，其包含通过非肽基聚合物与免疫球蛋白Fe区相连接的FacVIIa，所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、 聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合。
2.权利要求1所述的FacVIIa复合物，其中所述非肽基聚合物在末端分别与所述免疫球蛋白Fe区和FacVIIa的N端相连接。
3.权利要求1所述的FacVIIa复合物，其中所述非肽基聚合物在末端分别与所述免疫球蛋白Fe区和FacVIIa轻链的N端相连接。
4.权利要求1所述的FacVIIa复合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是无糖基化的。
5.权利要求1所述的FacVIIa复合物，其中所述免疫球蛋白Fe区包含一至四个选自 CH1、CH2、CH3和CH4的结构域。
6.权利要求5所述的FacVIIa复合物，其中所述免疫球蛋白Fe区还包含铰链区。
7.权利要求1所述的FacVIIa复合物，其中所述免疫球蛋白Fe区来源于IgG、IgA、IgD、 IgE 或 IgM0
8.权利要求7所述的FacVIIa复合物，其中所述免疫球蛋白Fe区为选自IgG、IgA、IgD、 IgE和IgM之两个或更多个结构域的杂合体，所述结构域具有来源于免疫球蛋白的不同来源。
9.权利要求7所述的FacVIIa复合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是由相同来源之结构域构成的单链免疫球蛋白的二聚体或多聚体。
10.权利要求7所述的FacVIIa复合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是IgG4Fc区。
11.权利要求10所述的FacVIIa复合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是无糖基化的人 IgG4Fc 区。
12.权利要求1所述的FacVIIa复合物，其中所述非肽基聚合物具有选自醛、丙醛、丁醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物的官能团。
13.权利要求12所述的FacVIIa复合物，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺丙酸酯、琥珀酰亚胺乙酸酯、羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺碳酸酯。
14.权利要求12所述的FacVIIa复合物，其中所述非肽基聚合物在两个或三个末端具有反应性醛基作为官能团。
15.权利要求12所述的FacVIIa复合物，其中所述非肽基聚合物在各个末端具有反应性醛基作为官能团。
16.权利要求15所述的FacVIIa复合物，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
17.用于凝血的药物组合物，其包含权利要求1至16中任一项所述的FacVIIa复合物。
18.用于制备FacVIIa复合物的方法，其包括(1)将末端具有醛、马来酰亚胺或琥珀酰亚胺衍生物作为官能团的非肽基聚合物通过共价键与免疫球蛋白Fe区的胺基或巯基相连接以产生缀合物；(2)从步骤(I)的反应混合物中分离所述非肽基聚合物-免疫球蛋白Fe区缀合物；(3)将FacVII与所分离缀合物中所述非肽基聚合物的另一端共价相连接以得到 FacVII复合物，其中所述非肽基聚合物一端与所述免疫球蛋白Fe区相连接，而另一端与 FacVII相连接；和(4)将步骤(3)的FacVII复合物活化成FacVIIa复合物，其中FacVIIa通过所述非肽基聚合物与所述免疫球蛋白Fe区相连接。
19.用于制备FacVIIa复合物的方法，其包括(1)将每一末端具有醛基的非肽基聚合物于PH5. O至7. O下通过共价键与免疫球蛋白 Fe的N端相连接以产生免疫球蛋白-非肽基聚合物缀合物；(2)从步骤(I)的反应混合物中分离所述缀合物；(3)将FacVII与所述缀合物中所述非肽基聚合物的另一端共价相连接以形成FacVII 复合物，其中所述非肽基聚合物一端与所述免疫球蛋白Fe区相连接，而另一端与FacVII相连接；和(4)将步骤(3)的FacVII复合物活化成FacVIIa复合物，其中FacVIIa通过所述非肽基聚合物与所述免疫球蛋白Fe区相连接。
20.权利要求18所述的方法，其中所述非肽基聚合物在各个末端处具有醛基，并且与 FacVII轻链的N端共价相连接。
21.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述FacVII在N端与所述非肽基聚合物共价键合。
22.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述FacVII复合物通过柱上活化或溶液内活化而活化。
23.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述FacVII和所述FacVIIa分别是天然FacVII和天然FacVIIa。
24.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
25.治疗凝血相关疾病的方法，其包括向对其有需要的对象施用权利要求1所述的 FacVIIa复合物。
26.治疗凝血相关疾病的方法，其包括向对其有需要的对象施用权利要求17所述的药物组合物。
27.权利要求25或26所述的方法，其中所述凝血相关疾病是血友病、出血、急性脑内出血、创伤或FacVII缺乏症。
全文摘要
公开了凝血因子复合物及其用途，其中FacVIIa、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区通过共价键键合。FacVIIa复合物确保了FacVIIa的体内活性并显著地延长了FacVIIa的血清半衰期，因此所述复合物可用于开发长效FacVIIa制剂，其可提高血液不凝固患者的角色行为的顺应性。
文档编号C07K16/18GK103025358SQ201180032580
公开日2013年4月3日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者宋大海, 林圣仁, 金昌焕, 洪性甲, 任大成, 权世昌 申请人:韩美科学株式会社