专利名称：细胞内免疫的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物，其是特异于病原体的配体与RING结构域的缀合物。在一个实施方式中，RING结构域衍生自TRM多肽，例如TRM21。
背景技术：
病毒及其宿主共同进化了数百万年，这导致了免疫复合系统传统地分为固有和适应性反应^固有免疫包括识别病原体相关分子模式或PAMPs的种系编码的受体和效应子机制2。固有免疫的优点是其迅速且普适；但是，病毒善于通过抑制固有免疫或通过改变其分子模式来躲避识别。相反地，适应性免疫能够“治愈”感染的宿主并提供保护以免于将来的感染。与固有免疫的PAMP受体不同，适应性免疫利用如抗体的蛋白质来靶向病原体。人类中的抗体是独特的，在于其在个体的生命过程中进化，能够持续靶向进化的病原体3。适应性免疫的弱点在于其花费I 一 2周以达到完全的效果。而且，最近100年抗体免疫的教义是抗体仅仅提供细胞外保护^认为一旦病毒进入细胞溶质，抗体就不能预防其感染。
已经开发了细胞内抗体；例如，参见Moutel S，Perez F., Med Sci (Paris).2009Dec; 25 (12): 1173-6; Stocks Μ., Curr Opin Chem Biol.2005Aug;9 (4):359-65。但是，使用细胞内抗体或胞内抗体(intrabody)的结果被混合了。一般地，开发细胞内抗体的尝试着眼于单链抗体片段，例如scFv,以及单一结构域抗体,例如Vhh抗体和dAbs。
抗体和免疫血清被长时间用于治疗病原体感染。例如，在1890年代马抗血清被用于治疗破伤风和白喉。但是，抗血清被人免疫系统视为外源性的，其通过产生对抗其的抗体进行反应，特别是在重复剂量时。在20th世纪的大多数时期，动物抗体的副作用促进了来自供体的人抗血清的使用，这些供体是疾病的恢复者，典型地用于呼吸道和B型肝炎感染的预防。在由于毒性的问题而使抗体疗法的普及降低之后，人源化和人抗体消除了这些问题，并导致这些治疗方法的恢复。参见Casadevall等人，Nature ReviewsMicrobiology2, 695-703 (2004九月)用于回顾。使用抗体疗法所靶向的疾病包括炭疽、百日咳、咳嗽、破伤风、肉毒中毒(Botulism)、隐球菌病、隐孢子虫病、肠病毒的胃肠道感染、链球菌群感染、坏死性筋膜炎、B型肝炎、麻疹、肺结核、脑膜炎、再生障碍性贫血、狂犬病、RSV感染、肺炎、带状疱疹、水痘和VZV引起的肺炎、和天花。虽然有这些发展，但是，仅仅当没有其它适合的疗法存在时才考虑抗体疗法，其需要大剂量抗体并产生不可预期的结果。
抗病原体的抗体有效性被理解为至少部分依赖于抗体Fe部分，该部分负责介导补体的作用。因而，尽管其具有小尺寸和较低的生产成本的优点，通常并不提议将抗体片段用于抗病毒疗法。
病毒疾病的初级疗法仍然是接种，其是预防性的方法。相信由抗原提呈细胞如树突细胞处理的病毒抗原被 提呈至免疫系统并诱导初始T细胞Cnane T-cells)分化为记忆和效应T细胞。记忆T细胞负责对次级感染的更攻击性的和迅速的免疫反应，介导接种的益处。参见 Kaech 等人 Nature Reviews Immunology, volume2,四月 2002，251 用于回顾。
另一种对感染疾病疗法的基于免疫的方法是细胞因子的应用，包括干扰素。干扰素是首先被提议用于治疗癌症和多发性硬化，以及病毒感染的。从1998年起已被许可用于C型肝炎的治疗。而且，尤其在东欧，施用低剂量的口服或鼻内干扰素用于感冒和流感的治疗。但是，其作用机制不清楚，因为所用的剂量被认为低于可观察到抗病毒效果的剂量。O’Brien 等人，J Gen Virol.2009Apr; 90 (Pt 4): 874-82 使用干扰素作为抗 VEEV 腺病毒递送的疫苗的佐剂；他们观察到抗病毒保护中的降低，但在对病毒载体的免疫反应中的增强。
最近，我们描述了一种称为TRIM21的细胞内细胞溶质蛋白，其能够通过它的PRYSPRY结构域结合抗体分子的不变区域4。我们发现该活性在哺乳动物当中是结构、热动力学和动力学保守的5。已经提出了对TRIM21功能的假设，包括其参与凋亡以及将B细胞中产生的未折叠IgG引导到蛋白酶体中的作用。发明内容
抗体是细胞外蛋白，其全部为已知的哺乳动物IgG受体(FcRn除外，其是细胞内的但不是细胞溶质的)。因而，对于我们而言似乎是不一致的，因为TRIM21应该普遍是保守的细胞内蛋白，且仍然是高亲和性、高特异性的IgG受体。我们假设可能是目前对抗体免疫的理解是不完全的，存在一些发生在细胞内的由TRM21介导的“不明(missing)”免疫系统。文中呈现的数据证明这种不明的免疫系统的存在，并证明了其在预防两种不相关病毒一dsDNA腺病毒和ssRNA克萨奇病毒一感染中的活动。
因而，在本发明的第一方面，提供了一种化合物，其包括:
(a)配体，如果所述配体不是TRM21的PRYSPRY结构域，则其直接或间接地特异地结合于病原体的抗原；和
(b) RING结构域和/或TRM21表达的诱导子。
我们表明TRM21是对免疫球蛋白高亲和性的配体。TRM21的RING结构域是E3连接酶，其是泛素化的，且将免疫球蛋白与其结合的抗原一起引导至蛋白酶体。
根据本发明，至少一个RING结构域，例如TRM多肽的RING结构域能够结合针对抗原的配体。这种配体优选直接结合抗原，并可以包括免疫球蛋白分子的至少一部分；但是，可以使用其它配体，包括肽、基于肽和核酸的适体(aptamer)、天然发生的配体、受体及其结合片段。
在另一个 实施方式中，配体间接地结合抗原。例如，配体可非特异性地结合免疫球蛋白，例如结合免疫球蛋白的Fe部分。在该实施方式中，配体不是TRIM21的PRYSPRY结构域。示例性的配体包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、肽，例如识别免疫球蛋白Fe区域的、抗Fe抗体及其片段的肽、等等。在此情况下，由对病原体抗原特异的抗体或抗体片段提供靶向特异性。这种抗体可以与本发明的化合物共同施用，或可以是天然发生的。
在本发明的上下文中，术语“配体”用于指结合对当中两个中的任一个。
当配体是免疫球蛋白时，其可以是任何免疫球蛋白分子，例如选自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、dAb、VHH、IgNAR、TCR 及其多价组合的免疫球蛋白分子。多价抗体包括，例如二价抗体和抗体片段、双特异抗体和抗体片段、其三价版本、以及如双价抗体(diabody)的专有形式。单一结构域抗体,例如dAbs和Vhh抗体,特别适合结合以形成多价和/或多特异性的分子。
当配体是抗体时，抗体分子包括Vh结构域和\结构域、或其等同物中的至少一个。
在一个实施方式中，TRM多肽选自TRM5a、TRIM19, TRIM21和TRM28。尽管由于其抗体结合特性，优选TRIM21，但是如果多肽或其结构域本身结合其抗原或对抗原特异的配体，则不再需要抗体结合能力。在这样的情况中，可以使用来自TRIM多肽的RING结构域，而不是TRM21，以达到相同的作用。有利地，还可增加其它结构域，如B盒结构域或卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋结构域负责TRIM21的二聚化。
优选地，RING结构域在根据本发明的化合物上以两个或更多拷贝出现。通过其卷曲螺旋结构域发生TRM21的二聚化，且有助于蛋白通过E3介导的泛素连接靶向至蛋白酶体。
在一个实施方式中，本发明的化合物包括基本上完整的TRM多肽，其中PRYSPRY(B30.2)结构域被抗原或抗原特异的配体所取代。例如，其能够被包含Vh结构域和\结构域中的至少一个的抗体所取代。
在进一步的实施方式中，本发明的化合物包含TRM表达的诱导子，而非TRM结构域，或者也包含TRM结构域。TRIM21的表达被干扰素上调，因而TRM表达的诱导子有利地是干扰素或干扰素诱导子。本领域中已知多种干扰素诱导子，包括细菌多糖和核苷类似物例如聚1:C。
干扰素诱导子可细胞内发挥作用，或在细胞表面发挥作用。当干扰素诱导子在细胞表面发挥作用时，向受试者施用的化合物的至少一部分停留在细胞表面，结合于干扰素诱导子受体。在一个有利的实施方式中，干扰素诱导子可通过不稳定的连接结合于化合物，例如在生理条件下具有有限半衰期的连接。例如，半衰期将足以使配体结合至病原体以及结合至干扰素受体，但没有显著地更长。
在第二个方面中，提供了一种用于治疗病原体感染的方法，其包括向受试者施用根据本发明第一方面的化合物。
相似地，提供了根据本发明第一方面的化合物用于在受试者中诱导免疫反应的用途。
在第三方面中，本发明提供了用于在受试者中治疗感染的方法，包括向受试者联合施用对引起所述感染的病原体抗原特异的抗体，以及包含结合所述抗体的配体和RING结构域的多肽。
相似地，提供了对在受试者中引起感染的病原体的抗原特异的抗体，和包含结合所述抗体的配体和RING结构域的多肽用于治疗所述感染的用途。
我们证明了用病毒特异性抗体和野生型的或修饰的TRIM21的细胞治疗导致了病毒感染性的抑制，甚至在内源TRM21被敲低(knockdown)的细胞中。相应地，TRIM21的联合施用可被用于增强用于治疗感染性疾病的抗病毒疗法。
在第四个方面中，提供了用于在遭受感染的受试者中治疗这种感染的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含间接结合病原体抗原的配体和RING结构域的多肽。
相似地，提供了包含间接结合病原体抗原的配体和RING结构域的多肽用于在受试者中治疗感染性疾病的用途。
优选地，包含TRM21的PRYSPR Y结构域和RING结构域的多肽包含TRM多肽的其它结构域，例如来自TRIM21的。在一个实施方式中，多肽包含卷曲螺旋结构域和/或B盒结构域。在一个实施方式中，多肽是TRM21，优选人TRM21。
以前没有提出过TRIM21具有抗感染特性。但是，如文中所示，其以非常高的亲和性结合至IgG和IgM的Fe受体，并将抗体以及任何结合的抗原引导至蛋白酶体。因而，夕卜源TRIM21增强了内源抗体对病原体的反应。
我们的结果揭示了存在不明的细胞内免疫系统，通过所述免疫系统抗体介导被感染细胞的细胞溶质内的病毒中和。该细胞内系统结合了传统地独占地与适应性或固有的免疫相关的性质。通过适应性免疫以抗体的形式提供病原体靶向，而由细胞内受体(TRM21)和固有的降解途径提供中和。TRIM21不同于其它抗体效应子机制，其是系统的并基于免疫监视。TRIM21在大多数细胞中表达，且并不仅仅是专门的免疫细胞，这意味着每一次感染事件是一个中和的机会。包裹于宿主细胞中的免疫可能对抑制病毒的扩散是非常重要的。最后，TRIM21既利用IgM又利用IgG，表明其既与感染早期阶段的固有免疫一并行动，又与适应性免疫一并行动，以提供长期保护。
在最近100年，TRM21已经促成了许多抗体中和实验。事实上，如我们所看到的，TRIM21介导有力的腺病毒的抗体中和，重新评价是否其它病毒的抗体中和是由进入的阻断所引起的，或者是否是TRM21依赖的，将是重要的。在疫苗设计中这可能是一个重要的考虑，因为有效的疫苗可能需要刺激TRIM21免疫。我们表明在其它病毒的抗体中和中，TRIM21参与的良好预测物将是干扰素和抗体间的协同关系。事实上，已经报道了对于单纯疱疹病毒8、肠病毒708和辛德比斯病毒9的干扰素和抗体间的未解释的协同性。TRIM21可能还增进了没有添加抗体的实验中的病毒中和，因为在常规组织培养中所用的胎牛血清含有潜在交叉反应特异性的抗体库(repertoire )。
TRIM21/抗体细胞内免疫反应的存在可能有助于解释在病毒感染中一些未解释的现象。已经报道了，甚至当允许病毒预粘附于靶细胞时，发生了脊髓灰质炎病毒w和呼吸道合胞体病毒11的抗体中和。还观察到单一的IgG足以介导脊髓灰质炎病毒12和腺病毒13的中和，对于鼻病毒仅需要5 — 6个IgG分子14。最后，有许多完整抗体比其蛋白降解片段远远更有效的报导，甚至比维持二价抗原结合的Fab2更有效。例如，已经表明Fab2片段在中和黄热病毒15、HSV16和流感病毒17中没有完整的IgG有效，表明Fe结构域效应子有效的中和功能。TRM21介导的降解可能解释所有这些现象。
图1:TRM21介导细胞内抗体中和。(A)腺病毒感染的HeLa细胞的共聚焦显微镜图像。可以在细胞内看 到预包被于抗体、且在感染后用次级Alexa-fluor546 (红色)检测的腺病毒。以绿色表示内源性TRIM21的位置，蓝色表示DAPI染色的核。这些通道的融合表明TRIM21定位于抗体包被的病毒颗粒。图像是Z投影，在缩放框中比例尺是10 μ m和2 μ m。(B)用 IFNa、TRIM21siRNA(KD), siRNA 对照(HeLa)或 IFNa &TRM21siRNA (IFNaKD)处理的细胞在不同的多克隆抗体浓度下感染GFP腺病毒。通过测量GFP阳性细胞百分比确定感染水平，对于每个条件，相对于不存在抗体的水平进行归一化。在TRIM21表达水平最高的细胞中，腺病毒感染降低了 2-log。(C)在每个条件下的TRM21蛋白水平的Western印迹。(D)在浓度渐增的人血清IgG存在下用克萨奇病毒处理的细胞的感染。IFNa和抗体协同作用来中和病毒。通过特异地敲低TRM21来逆转该作用。
图2:TRIM21不依赖细胞类型和抗体中和感染。(A)在抗体存在下，TRM21的中和通过敲低被逆转，不依赖于siRNA序列或siRNA比shRNA。(B) TRIM21在三种不同细胞系中中和腺病毒感染。通过IFNa增强中和，而通过敲低(KD)逆转中和。(C)当使用不同的多克隆或抗六邻体(Hexon)单克隆IgG时，TRM21中和腺病毒感染。(D)与TRM21介导的中和相比，进入中和(entry neutralisation)极小。病毒的抗体依赖的TRIM21中和需要Fe结构域的存在。Fab2片段是二价的，对于进入中和具有与完整IgG相同的潜能，但是其对感染表现出有限的作用。通过敲低TRM21确认了这一点，敲低逆转了 IgG的中和。(E)TRIM21结合血清IgM。IgM与TRM21的结合测定为荧光各向异性的改变，并拟合至标准二次表达式(Materials&Methods)以给出16.8 μ M± 1.5 μ M的亲和性。(F)TRIM21也能够使用血清IgM抗体来中和病毒。TRM21的敲低(KD)逆转了该作用，而IFNa增强了它。从一式三份的实验中计算所有组(panel)中的误差棒。(G) TRM21还可以使用IgA抗体来中和病毒。使用siRNA (siTRM21)的TRM21的敲低逆转了该作用，而IFNa增加了它。对照siRNA (Si对照)没有作用。
图3:TRIM21的中和机制。(A) TRIM21 (黑色)、IgG (浅灰)以及TRIM21与IgG的复合体(深灰)的SEC MALS色谱。连续轨迹代表RI信号(左侧轴)，并且是蛋白浓度的指示。短的水平线代表在每个峰值内在每个取样间隔(Is)处的计算质量(右侧轴)。分析表明TRIM21是质量为107kDa的二聚物，IgG具有154kDa的质量，以及TRM21 =IgG复合体产生这样一个峰值，其对应着游离IgG和质量为 280kDa的1:1复合体。(B&C)用全长TRM21(左侧)和Λ RING-Λ BOX TRIM21 (右侧)的IgG稳定状态的荧光滴定。滴定拟合至标准二次表达式(Materials&Met hods)得出全长TRM21对抗体的亲和性为0.6±0.1nM (B)以及对于Δ RING- Δ BOX TRM21而言亲和性为0.9±0.2nM (C)。(D)蛋白酶体抑制剂MG132逆转了 TRM21的中和，但自噬抑制剂3-MA不能。从一式三份的实验计算误差棒。(E)MG132浓度和TRIM21中和逆转之间的直接相关性。MG132仅逆转抗体存在时的中和。(F)蛋白酶体的降解，TRIM21和抗体在相同的病毒中和途径中是必要的因子。例如，TRIM21的敲低避免了 MG132的作用。
图4:TRIM21E3泛素连接酶功能对于病毒中和是重要的。(A)重组全长TRM21中和病毒，但缺少RING和B盒结构域的TRM21不能。(B) TRIM21是活性E3连接酶，但RING和B盒结构域的缺失防止了自身泛素化。(C)感染期间，TRIM21不直接将六邻体或其相关抗体泛素化。(D)共聚焦显微镜Z投影表明HeLa细胞感染有抗体包被的腺病毒。TRM21共定位(co-localised)的病毒颗粒对于泛素是阳性的。(E)感染后I 一 6小时,六邻体、抗体和TRM21蛋白水平的Western印迹。腺病毒六邻体蛋白和抗体以TRM21依赖的方式快速降解。MG132的添加部分地缓和了降解。降解不显著影响TRM21的细胞池(pool)。
图5:细胞内抗体包被的珠召集TRM21，且是泛素化的。链霉亲和素缀合的乳胶珠包被有抗链霉亲和素抗体并转染到细胞内。细胞内珠被TRIM21识别，并与泛素共定位。缩放框中的比例尺代表10 μ m和5 μ m。
具体实施方式
除了另有说明，文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本发明的实践或测试中可以使用任何相似于或等同于文中描述的方法或材料。现在描述适合于该用途的方法、装置和材料。所有文中引用的出版物以其整体并入文中做参考，目的在于描述和公开可能与本发明联合使用的出版物中报道的方法学、试剂和工具。
除非另外指明，本发明的实践采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的传统方法。这些技术在文献中已有充分的解释。参见，例如 Gennaro, A.R.，编辑(1990) Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 18版，Mack Publishing C0.； Hardman, J.G., Limbird, L.E.,和Gilman, A.G.,编辑(2001) ThePharmacological Basis of Therapeutics,第 10 版，McGraw-Hill C0.;Colowick, S 等人编辑，Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.;ffeir, D.M.,和 Blackwell, C.C.编辑(1986)Handbook of Experimental Immunology, Vols.1-1V, Blackwell ScientificPublications ；Maniatis, T.等人编辑(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Vols.1-1II, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Ausubel, F.M.等人编辑(1999) Short Protocols in Molecular Biology,第 4 版，John Wiley&Sons ;Ream 等人编辑.(1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, AcademicPress ；Newton, C.R.,和 Graham, A.，编辑(1997)PCR(Introduction to BiotechniquesSeries),第 2 版 Springer Verlag0
在本发明的上下文中，根据将被施用的试剂(reagent)、化合物或基因构建体，通过细胞培养的标准技术进行施用。例如，可以通过加入到细胞培养基、通过磷酸钙沉淀、通过电穿孔、通过病毒转导或通过其它方法导入细胞内进行施用。如果本发明的方法采用非人哺乳动物作为测试系统，哺乳动物可以是转基因的，并在其内源性细胞中表达必要的试剂。
在本发明的上下文中，抗原是能够被配体识别的分子，其具有病原体特异的表位。典型地，抗原是病原体如病毒或细菌的抗原决定簇，在生理条件下其暴露以被配体如抗体结合。优选的抗原包括被已知的病原体特异的中和抗体或疫苗靶向的表位。
病原体可以是任何异源体，如生物体，例如细菌或原生动物、或病毒，其能够感染受试者。有利地，病 原体是病毒。病毒可以是有包膜的或无包膜的。在一个实施方式中，病原体是无包膜的病毒。
直接结合抗原的配体是在生理条件下能够特异地结合抗原的配体。如文中所述，术语“配体”可以指特异性结合对的两部分的任一个；例如，其可以指抗体一抗原对中的抗体或抗原。抗体是优选的配体，且可以是本领域已知的完整抗体或抗体片段，包括例如IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、dAb、VHH、IgNAR、修饰的 TCR、和其多价组合物。配体还可以是基于可选的非免疫球蛋白支架、肽适体、核酸适体、在非肽骨架上衬(subtend)有多肽环的结构多肽、天然受体或其结构域的结合分子。
间接结合抗原的配体是通过第二配体结合抗原的配体。例如，它是结合抗体的配体。配体以非依赖抗体结合特异性的方式结合抗体；例如，其能够结合Fe区。在一个实施方式中，配体选自蛋白G、蛋白A、蛋白L、TRIM21的PRYSPRY结构域、抗免疫球蛋白抗体、以及特异识别抗体的肽，例如在Fe区域中。
TRIM21的PRYSPRY结构域由PRY和SPRY区组成，其分别位于如SEQ ID N0.1所示的人TRM21氨基酸序列的286-337和339-465位置。
RING结构域是如SEQ ID N0.1所示的人TRM21氨基酸序列的氨基酸15和58之间的人TRM21。
BBOX结构域是如SEQ ID N0.1所示的人TRM21氨基酸序列的氨基酸91和128之间的人TRM21。
卷曲螺旋结构域是如SEQ ID N0.1所示的人TRM21氨基酸序列的氨基酸128和238之间的人TRM21。
术语“免疫球蛋白”指保留抗体分子免疫球蛋白折叠特性的多肽家族，其含有两个β片层，以及通常地，一个保守的二硫键。免疫球蛋白超家族成员涉及体内细胞和非细胞相互作用的许多方面，包括免疫系统中普遍的作用(例如，抗体、T细胞受体分子等)、涉及细胞粘附(例如ICAM分子)和细胞内信号传导(例如，受体分子、例如TOGF受体)。本发明可适用于所有的具有结合结构域的免疫球蛋白超家族分子。优选，本发明涉及抗体。
如果在生理条件下靶向抗原导致基本上排它的靶向病原体，则抗原是病原体特异的。
免疫球蛋白的重链和轻链的可变结构域，以及在其它蛋白中的等同物，例如T细胞受体的α和β链，负责决定抗原结合特异性。Vh和'结构域能够独立地结合抗原，如在Vh和\ dAbs中。Vh和\结 构域的参考包括Vh和\结构域的修饰版本，无论是合成的或是天然发生的。例如，天然发生的Vh变体包括骆驼科(camelid) Vhh结构域，以及软骨鱼的重链免疫球蛋白IgNAR。
TR頂多肽是蛋白的三重基序(TRM)家族的成员，其包括人基因组中70个成员，包括TRM21(Ro52)。TR頂蛋白参与多种细胞过程，包括细胞增殖、分化、发展、瘤形成和凋亡。TRM蛋白是多结构域的，如此称谓是由于它们保守的N端RBCC结构域:编码E3泛素连接酶活性的RING指、B盒以及介导低聚化的卷曲螺旋结构域。C端PRYSPRY或B30.2结构域通常通过作为靶向模块发挥作用来决定不同TRM多肽的功能。参见Nisole等人NatureReviews Microbiology3, 799-808 (2005 年 10 月)。RING 结构域定义为配位(coordinate)两个锌原子的半胱氨酸和组氨酸的有规律的排列，且见于大量蛋白中。其特征在于结构C-X2-C-X (9-39) -C-X (1-3) -H-X (2-3) - (N/C/H) -X2-C-X (4-48) C-X2-C，并与 TRIM 多肽中的 B 盒结构域相关。参见 Freemont, Curr Biol.2000Jan27; 10 (2): R84-7。
结构域是折叠蛋白结构，其保留了独立于蛋白剩余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的不连续的功能特性，在许多情况下可以添加、去除或转移至其它蛋白而不损失蛋白和/或结构域的其余功能。TRIM多肽的RING、B盒、卷曲螺旋和PRYSPRY结构域是其实例。通过抗体可变结构域指含有抗体可变结构域特征的序列的折叠多肽结构域。因而，其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环被如下取代:不是抗体可变结构域特征的序列、或被截短的或包含N或C端延伸的抗体可变结构域，以及保留全长结构域的至少部分结合活性和特异性的可变结构域折叠片段。
TRM表达的诱导子是增加所需TRM多肽细胞内水平的试剂。优选地，多肽是TRM21。TRIM21表达的诱导子中的I型干扰素。
如参照本文，共同施用是两个试剂的同时的、同时的独立的或相继的施用，从而其在目标位点同时有效。因而，在抗体和TRIM21多肽的共同施用的上下文中，应当施用两个试剂，从而使抗体在被细胞内化之前被TRM21多肽结合。因此，可以在施用前，混合抗体和TRIM21多肽，或独立地施用，从而其同时存在在循环中。
在它们感染细胞之前抗体靶向病原体。我们在此处表明通过感染，这些抗体保持结合病原体，并指导每个细胞内存在的细胞内免疫反应。我们证明每个细胞具有细胞溶质IgG受体，TRM21，其比任何人体中的其它IgG受体以更高的亲和性结合抗体。这使得TRM21能够快速召集至细胞内结合抗体的病毒，并通过其E3泛素连接酶活性在蛋白酶体内靶向病毒使其降解。在生理的抗体浓度下，TRM21完全中和病毒感染。这些发现代表广谱免疫的前所未有的系统，揭示了抗体介导的保护并没有终止于细胞膜，而是在细胞内继续提供抗感染的最后防线。
TRIM21的PRYSPRY结构域负责抗体结合，在该意义上TRM21看似在TRM多肽家族当中是独特的。但是，负责蛋白酶体靶向的TRIM结构域，RING结构域是TRIM21非特异的；当然，这对包括TRIM家族的蛋白是常见的。
细胞中TRM21表达的诱导依赖于干扰素，其受病毒机制的延迟和干扰。因而，本发明提供了融合至RING结构域的抗原特异性配体，从而当病原体被细胞内化时，结合病原体的配体立刻引导其至蛋白酶体以降解。这有效地允许细胞治愈其自身的病原体感染。
1.配体
任何在生理条件下能结合病原体相关抗原并被细胞内化的配体，适合用于本发明。天然免疫系统使用抗体作为病原体的配体，抗体或抗体片段用于本发明是理想的。其它可能性包括来自其它受体的结合结构域，以及工程化的肽和核酸。
Ia.抗体
文中提及的抗原或病原体特异的抗体、抗原或病原体结合的抗体以及特异于抗原或病原体的抗体是几乎一致的(coterminous),并且指抗体、或源自抗体的结合片段，其以特异的方式结合存在于病原体上的抗原，且基本上与循环中或组织中存在的其它分子没有交叉反应。
文中应用的“抗体”包括但不局限于多克隆、单克隆、重组的、嵌合的、接枝(grafted)互补决定区(⑶R)、单链的、双特异的、Fab片段和由Fab表达库产生的片段。这些片段包括保留其对目标抗原结合活性的完整抗体的片段、Fv、F(ab’)、F(ab’)2片段和F(v)或Vh抗体片段以及融合蛋白和其它含有抗体的抗原结合位点的合成蛋白。而且，抗体及其片段可以是人或人源化的抗体，如下面进一步详述的。
抗体和片段还包括抗体变体和其片段。变体包括含有一个或多个氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽和多肽，其与抗原特异性抗体或其片段具有相同的或基本上相同的表位结合亲和性和特异性。
氨基酸残基的缺失、插入或取代可以产生沉默的改变而获得功能上等同的物质。可以根据残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性的性质相似性产生经考虑的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似的亲水值的带有不带电头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表生成保守取代。在第二列相同格中的以及优选在第三列相同行中的氨基酸可以互相取代:
权利要求
1.一种化合物,其包括: Ca)直接或间接地，特异地结合病原体抗原的配体，只要所述配体不是TRIM21的PRYSPRY结构域；和 (b) RING结构域和/或TRM21表达的诱导子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述配体直接地结合抗原，并选自免疫球蛋白分子的至少部分、肽和/或核酸适体、以及结构多肽配体。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中免疫球蛋白分子选自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、F (ab’) 2、Fab、Fv、scFv、dAb、Vhh, IgNAR、修饰的 TCR 和其多价组合。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中免疫球蛋白分子包括Vh结构域和\结构域的至少一个。
5.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中抗原对病毒是特异的。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中配体间接地结合抗原，且选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗免疫球蛋白肽和抗免疫球蛋白抗体。
7.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中RING结构域具有E3连接酶活性。
8.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中RING结构域源自TRIM多肽。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中TR頂多肽选自TRM5a、TRIM19,TRIM21和TR 頂 28。
10.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其具有两个或多个RING结构域。
11.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其进一步包括TRIM多肽B盒结构域和/或TRIM多肽卷曲螺旋结构域。
12.根据权利要求11所述的化合物，其包括TRIM多肽，其中B30.2结构域被Vh结构域和\结构域的至少一个所替代。
13.根据权利要求1至12任一项所述的化合物，其中TRM21表达的诱导子是干扰素或干扰素诱导子。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中干扰素诱导子选自病毒或细菌抗原、多聚阴离子、TLR激动剂和小分子干扰素诱导子。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的化合物，其中干扰素或干扰素诱导子通过不稳定接头结合至化合物。
16.一种治疗病原体 感染的方法，其包括向受试者施用根据上述权利要求任一项所述的化合物。
17.根据权利要求1至15任一项所述的化合物用于治疗病原体感染的用途。
18.一种用于治疗受试者中感染的方法，其包括向受试者联合施用特异于引起所述感染的病原体抗原的抗体，以及包括结合至所述抗体的配体的多肽，和RING结构域。
19.特异于在受试者中引起感染的病原体抗原的抗体、和包括结合至所述抗体的配体的多肽和RING结构域用于治疗所述感染的用途。
20.一种用于在遭受感染的受试者中治疗这种感染的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的多肽，该多肽包括包含间接结合病原体抗原的配体的多肽，和RING结构域。
21.包括包含间接结合病原体抗原的配体的多肽和RING结构域的多肽用于在受试者中治疗感染性疾病的用途。
22.根据权利要求18或20所述的方法，或根据权利要求19或21所述的用途，其中配体选自TRIM21PRYSPRY结构域、蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗免疫球蛋白肽和抗免疫球蛋白抗体。
23.根据权利要求18至22任一项所述的方法或用途，其中多肽进一步包括TRM多肽卷曲螺旋结构域和/或TRIM多肽B盒结构域。
24.根据权利要求23所述的方法或用途，其中多肽是人TRIM21。
全文摘要
一种含有配体和RING结构域和/或TRIM21表达的诱导子的化合物，如果所述配体不是TRIM21的PRYSPRY结构域，所述配体直接或间接地特异地结合病原体抗原。
文档编号C07K16/08GK103180340SQ201180045428
公开日2013年6月26日 申请日期2011年7月25日 优先权日2010年7月23日
发明者L·C·詹姆士, D·L·马勒里, W·A·迈克伊万, S·R·彼得古德 申请人:医疗研究局