专利名称：用于治疗hiv的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够特异性结合于趋化因子受体(CXCR)的新抗体，特别是嵌合的和人源化的鼠单克隆抗体，以及编码此抗体的氨基酸和核酸序列。从一方面讲，本发明涉及能够特异性结合于CXCR4并具有对抗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的强活性的新抗体、功能性片段或衍生物。本发明还包括这种抗体、功能性片段或衍生物作为预防和/或治疗性治疗HIV感染的药物的用途。
背景技术：
趋化因子是小的、分泌肽，其控制着(特别是免疫反应期间)白细胞沿配体化学梯度(被称为趋化因子梯度)的迁移(Zlotnick A.等人，2000)。基于其NH2-端半胱氨酸残基的位置、及与G蛋白偶联受体(其两个主要亚家族被命名为CCR和CXCR)的结合，将趋化因子分为两个主要的亚家族，CC和CXC。到目前为止，发现了超过50个人趋化因子和18个趋化因子受体。趋化因子受体 家族的若干成员作为主要受体CD4的共受体发挥作用，使得HIVl型的不同株能够进入细胞，主要的共受体是CCR5和CXCR4。T细胞向性X4HIV-1使用⑶4和CXCR4进入细胞，而巨噬细胞向性R5HIV-1使用⑶4和CCR5。双向性株能使用CXCR4和CCR5作为共受体。其它趋化因子受体中的CCR3、CCR2、CCR8、CXCR6、CXCR7、CX3CR1能作为HIV株更限制亚群的共受体发挥作用。SDF-1 (CXCR4 的天然配体)以及 CCR5 的 CCL3、CCL4、CCL4-L1 和 CCL5 配体能够抑制HIV-1不同株引起的细胞融合和感染。这些发现促进了靶向趋化因子受体的抗HIV治疗的发展，导致CCR5小分子拮抗剂马拉维诺(maraviroc) (CELSENTRI )获准与其它抗HIV-1试剂组合用于CCR5向性HIV-1感染的患者。然而，马拉维诺不能用于被双向性HIV-1感染的患者或者被CXCR4向性HIV-1感染的患者(VIDAL2009)。因此，对于通过鉴定能抑制X4向性HIV复制的CXCR4拮抗剂在X4向性和双向性HIV感染的患者中扩展此类治疗有明确的医学需求。趋化因子受体4 (也被称为融合素、⑶184、LESTR或HUMSTR)以包括352个或360个氣基酸的两种同种型形式存在。残基Asnll是糖基化的，残基Tyr21被加入硫酸盐基团所修饰，而Cysl09和186在受体的细胞外部分以二硫键桥相结合(Juarez J.等人,2004)。不同类型正常组织、初始(na'fve)、非记忆性T细胞、调节性T细胞、B细胞、中性粒细胞、内皮细胞、原代单核细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、CD34+造血干细胞均表达此受体，而且在心脏、结肠、肝、肾和脑中以低水平表达。CXCR4在白细胞运输、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。到目前为止所描述的CXCR4受体的唯一配体是间质细胞衍生因子I (SDF-1)或CXCL12。SDF-1在淋巴结、骨髓、肝、肺中大量分泌，而肾、脑和皮肤分泌程度较少。CXCR4还被拮抗性趋化因子，人单纯疱疹病毒III型所编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II(vMIP-1I)，所识别。
如前面所提及的，CXCR4受体是T细胞向性HIV-1分离株(X4病毒)的主要共受体。干扰此受体将以很有效的方式抑制X4病毒复制。
发明内容
本发明的一个发明性方面是生成抑制HIV复制的小鼠单克隆抗体(Mab)。本发明包括能结合于CXCR4同源二聚体并具有抗HIV感染的强活性的CXCR4Mab515H7(或其片段)。发明还包括能结合于CXCR4同源二聚体并具有抗HIV感染的强活性的CXCR4Mab301aE5(或其片段)。令人吃惊的是，发明人已设法生成单克隆抗体，该抗体能够结合于CXCR4，并且能够诱导CXCR4同源二聚体的构象变化，而且能抑制原代分离株X4-HIV-1在PBMC中的复制。更特别的是，本发明的抗体还能够抑制原代分离株X4/R5-HIV-1在PBMC中的复制。 优选地，CXCR4化合物是选自如下的两个人CXCR4同种型之一:-趋化因子(C-X-C基序)受体4同种型b[人(Homo sapiens)],具有Genbank登录号NP_003458所描述的序列SEQ ID N0.27:MEGISIYTSDNYTEEMGS⑶YDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGN GLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFffAVDAVANWYFGNFLC KAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPA LLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVWFQFQHMVGLILPGIVILSCYCI IISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENT VHKffISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRG GHSSVSTESESSSFHSS ；-趋化因子(C-X-C基序)受体4同种型a[人]，具有Genbank登录号NP_001008540所描述的序列SEQ ID N0.28:MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGS⑶YDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGI VGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGN FLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVff IPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVWFQFQHMVGLILPGIVILSC YCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFE NTVHKffISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGK RGGHSSVSTESESSSFHSS ；-可选的转录剪接变体或其天然变体，其与具有SEQID N0.27或28的这些b或a同种型中的一个具有至少95%的同一性；及-其片段，其能够被其天然配体间质细胞衍生因子I(SDF-1)所特异性识别，并且具有优选至少100、150和200个氨基酸的长度。CXCR2选自如下:-白介素8受体β[人]，具有Genbank登录号NP_001548所描述的序列SEQ IDN0.29:MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIY ALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVN GfflFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFIC LSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFI VPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADT LMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIH GLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL ；-可选的转录剪接变体或其天然变体，与具有SEQID N0.29的这种白介素8受体3具有至少95%的同一性；及-其片段，能够被IL-8所特异性识别，并且具有优选至少100、150和200个氨基酸的长度。发明还包括用于选择具有抗HIV活性的化合物或能用于制备治疗HI V感染的组合物的化合物的方法，特征在于所述方法包括步骤:第一方面中，本发明的主题是用于生成和选择根据本发明的抗体的方法。更特别的是，本发明涉及用于选择能够抑制HIV复制的抗CXCR4抗体或其功能性片段或衍生物之一的方法，包括下列步骤:i)筛选生成的抗体及选择能特异结合于CXCR4的抗体；ii)检验步骤i)所选的抗体，并选择能结合外周血单核细胞(PBMC)的抗体，iii)检验步骤ii)所选的抗体，并选择能结合于CXCR4同源二聚体的抗体，并且随后iv)检验步骤iii)所选的抗体，并选择能抑制原代分离株X4-向性HIV-1在PBMC中复制的抗体。在另一实施方式中，发明涉及用于选择能抑制HIV复制的抗CXCR4抗体或其功能性片段或衍生物之一的方法，包括下列步骤:i)筛选生成的抗体及选择能特异结合于CXCR4的抗体；ii)检验步骤i )所选的抗体，并选择能结合外周血单核细胞(PBMC)的抗体，iii)检验步骤ii)所选的抗体，并选择能结合于CXCR4同源二聚体的抗体，并且随后iv)检验步骤iii)所选的抗体，并选择能抑制原代分离株X4-向性HIV-1在PBMC中复制和/或能抑制原代分离株X4/R5-向性HIV-1在PBMC中复制的抗体。抗体的生成可以通过本领域技术人员所知的任意方法实现，如例如，将骨髓瘤细胞与来自免疫小鼠或与所选骨髓瘤细胞兼容的其它物种的脾细胞相融合[Kohler&Milstein, 1975，Nature, 256:495-497]。免疫动物可包括带有人类免疫球蛋白基因座其之后直接生产人类抗体的转基因小鼠。另一可能的实施方式可以包括使用噬菌体展示技术来筛选文库。筛选步骤i)和ii)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性实例，可以提到ELISA、BIAcore、免疫组化、使用CXCR4表达细胞膜提取物或纯化的CXCR4的蛋白印迹分析、FACS分析及功能筛选。优选的方法包括通过FACS分析在CXCR4转染子上(步骤I)和至少在PBMC上(步骤2)进行筛选以确保生产的抗体也能识别靶标细胞表面的天然CXCR4受体构象。在下列实施例中更精确描述此方法。筛选步骤iii)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性但优选的实例，可以提及的是在来自CXCR4转染细胞或PBMC的膜提取物上使用目标抗体进行的蛋白印迹和/或免疫沉淀技术。筛选步骤iv)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性但优选的实例，可以提及的是包括抗体筛选的方法，通过使用Holl等人所述的规程(J.1mmunol.2004，173，6274-83)筛选有能力抑制 X4 原代 HIV-1 和 / 或 X4/R5 原代 HIV-1分离株在PBMC中复制的抗体。
在本发明方法的筛选步骤iii)的优选实施方式中，所述步骤iii)包括通过BRET分析在表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP的细胞上评估抗体，并且选择能抑制至少40%、优选45%、50%、55%和最优选60%BRET信号的抗体。BRET技术是被称为蛋白质二聚体化的代表技术[Angers等人，PNAS，2000，97:3684-89]。在方法的步骤iii)中所用的BRET技术，为本领域技术人员所熟知，并在下列实施例中有详细描述。更特别的是，BRET (生物荧光共振能量转移)是在生物荧光供体(海肾荧光素酶(Rluc))和荧光受体GFP (绿色荧光蛋白)或YFP (黄色荧光蛋白))突变体间发生的非辐射性能量转移。在本案例中使用EYFP (增强型黄色荧光蛋白)。转移效率取决于供体和受体之间的方向和距离。那么，只有当两个分子靠近(1-1Onm)时才能发生能量转移。此性质被用于生成蛋白质-蛋白质相互作用分析。事实上，为了研究两个配偶体(partner)间的相互作用，一般第一个融合于海肾荧光素酶而第二个融合于GFP的黄色突变体。融合蛋白一般(但不一定)表达于哺乳动物细胞。在其膜渗透性底物(腔肠素(coelenterazine))存在时，Rluc发射蓝光。如果GFP突变体距离Rluc不足10nm，会发生能量转移并能检测到额外的黄色信号。BRET信号被测定为受体所发射的光与供体所发射的光的比例。因此，随着两个融合蛋白被拉近或构象变化使得Rluc和GFP突变体更靠近的时候，BRET信号将会增强。如果在优选实施方式中包括BRET分析，可以使用本领域技术人员所知的任意方法测量CXCR4 二聚体的构象变化。可提及下列技术，不受限制:FRET (荧光共振能量转移)、HTRF (均相时间分辨荧光)、FUM (荧光寿命成像显微镜)或SW-FCCS (单波长荧光交叉相关光谱)。也可使用其它经典技 术，如共免疫沉淀、a筛选、化学交联、双杂交、亲和层析、ELISA或Far蛋白印迹。在根据发明所述方法的具体方面中，步骤iii)包括通过BRET分析在表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP两者的细胞上评估抗体，并且选择能抑制至少40%BRET信号的抗体。在第二方面中，本发明的主题是通过所述方法获得的分离抗体或其功能性片段或衍生物之一。所述抗体或其所述片段或衍生物之一，能够特异性结合人CXCR4，所述抗体也能诱导CXCR4同源二聚体构象变化。从文献中可知CXCR4Mab之类(例如克隆A120)能够抑制HIV-1实验株(X4HIV-1NL4_3)进入 PBMC (Tanaka R.等人，J.Virol.2001，75，11534-11543)。而且，也知道CXCR4Mab能抑制HIV-1X4原代分离株进入表达CXCR4的细胞系。反过来，从未公布过能抑制在其自然环境中的此类病毒(即不只是在实验室病毒或细胞系中)的抗体。无论如何，本发明的新颖且非显而易见的方面是CXCR4Mab能抑制HIV-1X4原代分离株进入PBMC。表达“功能性片段及衍生物”和“抗原结合片段和衍生物”是相似的，且将随后在本说明中详细定义。此处应理解的是本发明不涉及天然形式的抗体，那就是说抗体并不在其天然环境中，但能够通过自天然来源纯化而将其分离或获得，或者另外通过遗传重组、或者通过化学合成获得，并且因此抗体能包含此后所描述的非天然氨基酸。
更特别的是，根据发明的另一方面，要求保护分离的抗体或其功能性片段或衍生物之一，所述抗体特征在于:它们包括至少一个互补决定区CDR,该CDR选自包括如通过IMGT编号系统所定义的氨基酸序列SEQ ID N0.1至6和30至33的⑶R。根据第一方面，本发明涉及分离的抗体、或其功能性片段或衍生物，包括选自根据IMGT编号系统所定义的序列SEQ ID N0.1至6的⑶R的至少一个⑶R，或者其序列与序列SEQ ID N0.1至6进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个 CDR。根据第二方面，本发明涉及分离的抗体、或其功能性片段或衍生物，包括选自根据IMGT编号系统所定义的序列SEQ ID N0.1,2和30至33的⑶R的至少一个⑶R，或者其序列与序列SEQ ID N0.1,2和30至33进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个⑶R。抗体的“功能性片段”或“抗原结合片段”意指，特别是，抗体片段，如片段Fv、scFv(SC=单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv_Fc或双特异抗体、或其半衰期被延长的任意片段。此功能性片段将在随后的 本说明中详细描述。抗体的“衍生化合物”或“衍生物”意指，特别是，为保持其识别CXCR4的活性、由肽支架和原始抗体至少一个CDR构成的结合蛋白质。此衍生化合物，为本领域技术人员所熟知，将在随后的本说明中更详细描述。更优选的是，根据本发明，本发明包括通过遗传重组或化学合成获得的特别是嵌合或人源化的抗体、其衍生化合物或其功能性片段。根据优选的实施方式，根据本发明所述的抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其由单克隆抗体组成。应了解“单克隆抗体”意指来自于几乎同源抗体群的抗体。更特别指，群中的个体抗体(除一些可能以最小比例发现的天然产生的突变以外)是相同的。换句话说，单克隆抗体由来自于单个细胞克隆(例如杂交瘤、转染有编码同源抗体的DNA分子的真核宿主细胞、转染有编码同源抗体的DNA分子的原核宿主细胞等)生长的同源抗体构成，并且一般以一类且仅一类和亚类的重链、及仅一个类型的轻链为特征。单克隆抗体是高度特异的并针对单一抗原。此外，与通常包括针对各种决定簇或表位的各种抗体的多克隆抗体制备物相对比，各单克隆抗体针对单一的抗原表位。更特别的是，根据本发明的第一优选实施方式，抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括含有选自⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的至少一个⑶R的轻链，其中:-CDR-Ll 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.1、-CDR-L2 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.2、-CDR-L3 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.3。根据另一实施方式，发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有序列SEQ ID N0.1、2或3的三个⑶R中至少一个、或与序列SEQ ID N0.1、2或3进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个序列的轻链。发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征还在于其包括含有⑶R-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链，其中CDR-Ll包括氨基酸序列SEQ ID N0.1，CDR-L2包括氨基酸序列SEQ ID N0.2而且CDR-L3包括氨基酸序列SEQ ID N0.3。
在另一实施方式中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.7或与序列SEQ ID N0.7进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个序列的轻链序列。根据发明的第二个优选实施方式，抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括含有选自⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的至少一个⑶R的轻链，其中:-CDR-Ll 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.1，-CDR-L2 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.2，-CDR-L3 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.30。根据另一实施方式，发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于它们包括含有序列SEQ ID N0.1、2或30的三个⑶R中至少一个、或与序列SEQ ID N0.1、2或30进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个序列的轻链。本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征还在于其包括含有⑶R-L1、CDR-L2和CDR-L3 的轻链，其中CDR-Ll包括氨基酸序列SEQ ID N0.1，CDR-L2包括氨基酸序列SEQ ID N0.2且CDR-L3包括氨基酸序列SEQ ID N0.30。在另一实施方式中，发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.34或与序列SEQ ID N0.34进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个序列的轻链序列。更特别的是，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有选自CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的至少一个CDR的重链，其中:-CDR-Hl 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.4，-CDR-H2 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.5，-CDR-H3 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.6。根据另一实施方式，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有序列SEQ ID N0.4、5或6的三个⑶R中至少一个、或与序列SEQ ID N0.4、5或6进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个序列的重链。根据另一具体的实施方式，抗体、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链，其中CDR-Hl包括氨基酸序列SEQ ID N0.4，⑶R-H2包括氨基酸序列SEQ ID N0.5且⑶R-H3包括氨基酸序列SEQ ID N0.6。在另一实施方式中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.8、或与序列SEQ ID N0.8进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个序列的重链序列。更特别的是，本发明的抗体、其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有选自CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的至少一个CDR的重链，其中:-CDR-Hl 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.31，-CDR-H2 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.32， _CDR_H3 包括氣基酸序列 SEQ ID N0.33。根据另一实施方式，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有序列SEQ ID N0.31、32或33三个CDR的至少一个、或与序列SEQ ID N0.31,32或33进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个序列的重链。根据另一具体实施方式
，抗体、其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的重链，其中CDR-Hl包括氨基酸序列SEQ ID N0.31，CDR-H2包括氨基酸序列SEQ ID N0.32且CDR-H3包括氨基酸序列SEQ ID N0.33。在另一实施方式中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.35、或与序列SEQ ID N0.35进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的至少一个序列的重链序列。本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括一条轻链和一条重链，其中该轻链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID N0.1、2和3的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3，该重链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3。最后，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征还在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.7的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID N0.8的重链。本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括一条轻链和一条重链，该轻链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID N0.1、2和30的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，该重链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID N0.31,32和33的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3。最后，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，特征还在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.34的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID N0.35的重链。在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“附着至抗体化合物或其序列的蛋白质”可互换。在此必须理解，本发明不涉及天然形式的抗体，即抗体并不取自其天然环境，但能够通过从天然来源纯化而 将 其分离或获得，或者通过遗传重组或化学合成获得，并且因此抗体能携带下面所描述的非天然氨基酸。在第一个实施方式中，互补决定区或⑶R，意指Kabat等人所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高可变区(Kabat等人，Sequences of proteins of immunologicalinterest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH, 1991,及以后的版本)。有三个重链⑶R和三个轻链⑶R。此处，取决于情况，术语“⑶R”和“⑶Rs”用于指示一个或多个、或甚至全部包含负责其识别的抗原或表位的抗体结合亲和性的大多数氨基酸残基的区域。在第二实施方式中，通过⑶R区域或⑶R( S)，意指如MGT所定义的免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。MGT唯一编号被规定用于比较任何抗原受体、链类型或物种的可变结构域[Lefranc M.-P., Immunology Todayl8,509(1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier,E.,Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.1mmunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT唯一编号中，保守氨基酸总具有同样位点，例如半胱氨酸23 (第一 CYS)、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104 (第二 CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE 或 J-TRP)。IMGT 唯一编号提供了框架区域(FR1-MGT:1 至 26 位，FR2-1MGT:39至 55 位，FR3-1MGT:66 至 104 位和 FR4-1MGT:118 至 128 位)和互补决定区(CDRl-MGT:27至38，CDR2-1MGT:56至65和CDR3-1MGT:105至117)的标准化划界。因为空位代表空置的位置，⑶R-1MGT长度(显示在括号之间并以点分开，例如[8.8.13])成为重要的信息。MGT唯一编号被用于2D图呈现，指定为頂GT Colliers de Perles [Ruiz, M.和Lefranc, M.-P., Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas, Q.和 Lefranc, M.-P., CurrentBioinformatics, 2, 21-30 (2007) ], R IMGT/3D 结构-DB 的 3D 结构中[Kaas, Q.，Ruiz’M.和 Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。存在三个重链⑶R和三个轻链⑶R。根据情况，在此使用的术语⑶R目的在于指示这些区域之一或几个、或甚至这些区域的全部，其包含负责抗体对于其识别的抗原或表位的亲和性结合的大多数氨基酸残基。为了更清晰，应该理解下列说明中及更特别在表2和3中，以MGT编号系统和Kabat编号系统定义CDR。根据如上定义的MGT系统，以MGT编号系统定义⑶R，而根据如上定义的Kabat系统，以Kabat编号系统定义⑶R。更特别的是，关于被称为515H7的抗体，⑶R-Ll由MGT编号系统中的SEQ ID N0.1和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.9构成。关于CDR-L2，其由頂GT编号系统中的SEQ IDN0.2和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.10构成。⑶R-L3由两种编号系统中的每个的SEQID N0.3构成。对于重链，CDR-Hl由MGT编号系统中的SEQ ID N0.4和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.11构成。CDR-H2由MGT编号系统中的SEQ ID N0.5和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.12构成。最后，CDR-H3包括頂GT编号系统中的SEQ ID N0.6，而其由Kabat编号系统中的SEQ ID N0.13构成。然后，关于被称为301aE5的抗体，⑶R-Ll由MGT编号系统中的SEQ ID N0.1和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.9构成。关于CDR-L2，其由頂GT编号系统中的SEQ ID N0.2和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.36构成。CDR-L3由頂GT编号系统中的SEQ ID N0.30和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.37构成。对于重链，⑶R-Hl由MGT编号系统中的SEQID N0.31和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.38构成。CDR-H2由MGT编号系统中的SEQID N0.32和Kabat编号系统中的SEQ ID N0.39构成。最后，CDR-H3包括MGT编号系统中的SEQ ID N0.33，而其由Kabat编号系统中的SEQ ID N0.40构成。在本发明的含义中，两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”意指待比较的两条序列间相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，其在最佳比对后获得，此百分比是纯粹统计上的，两条序列间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列的比较传统上通过在对其最佳比对后比较序列来进行，所述比较能通过节段(segment)或通过使用“对比窗口”来执行。除了手动比较之外，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981) [Ad.App.Math.2:482]、通过 Neddleman 和 Wunsch 的局部同源性算法(1970) [J.Mol.Biol.48:443]、通过 Pearson 和 Lipman 的相似性搜索法(1988) [Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444]或通过使用这些算法的计算机软件(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算组，575Science Dr.，Madison, WI，或通过比较软件 BLAST NR 或 BLASTP)可以进行待比较的序列的最佳比对。通过比较两个最佳比对的序列确定两个核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，其中待比较的核酸或氨基酸序列，相较于用于两条序列间最佳比对的参考序列，可以有添加或删除。通过确定两条序列间(优选两条完整序列间)相同氨基酸核苷酸或残基的位点的数目计算百分比同一性，将相同位点数除以比对窗口的总位点数并将结果乘以100以获得两条序列间的百分比同一性。例如，可以用缺省参数使用(特别是参数“开放空位罚分”:5，和“延伸空位罚分”:2 ;所选矩阵是例如程序提出的“BL0SUM62”矩阵)在网页http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 上可用的 BLAST 程序,“BLAST2 序列，，(Tatusova 等人，“Blast2sequences_anew tool for comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett.174:247 - 250);直接用程序计算待比较的两条序列之间的百分比同一性。对于显示出与参考氨基酸序列有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列，优选的实例包括包含参考序列、某些修饰(特别是删除、插入或取代至少一个氨基酸、截短或延长)的那些。在一个或多个连续或不连续的氨基酸被取代的情况下，优选在取代中所取代的氨基酸被“等价”氨基酸所代替。在此，表达“等价氨基酸”意指可能取代一个结构氨基酸、而不改变相应抗体生物学活性的任意氨基酸，以及下面定义的那些具体实施例的任意氨基酸。可以根据其与它们所取代的氨基酸的结构同源性、或者根据可能生成的各种抗体间生物活性比较检验的结果来确定等价氨基酸。作为非限制性实例，下面表I总结了可能执行而不导致相应修饰的抗体生物活性显著变化的可能取代；在同一条件下自然可以做相反的取代。表I
权利要求
1.一种分离的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中，其包括至少一个互补决定区⑶R，所述互补决定区⑶R选自包括MGT编号系统所定义的氨基酸序列SEQ ID N0.1至6和30至33的CDR0
2.根据权利要求1所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中其包括一条轻链和一条重链，所述轻链包括分别包括氨基酸序列SEQ ID N0.1、2和3的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3 ;所述重链包括分别包括氨基酸序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R-Hl、⑶R-H2和CDR-H3。
3.根据权利要求2所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中其包括包括氨基酸序列SEQ ID N0.7的轻链和包括氨基酸序列SEQ ID N0.8的重链。
4.根据权利要求2所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中其是嵌合抗体，而且其包括选自SEQ ID N0.56,57或58的序列的重链，及序列SEQ ID N0.59的轻链。
5.根据权利要求2所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中，其是人源化抗体，而且其包括由SEQ ID N0.64组成的序列的重链可变区，及选自SEQ ID N0.65、66、82或83的序列的轻链可变区。
6.根据权利要求2所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中，其是人源化抗体，而且其包括人源化抗体、或其衍生的化合物或功能性片段，其包括选自SEQ ID N0.67、68或69的序列的重链，及选自SEQ ID N0.70、71、84或85的序列的轻链。
7.根据权利要求2所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中，所述功能性片段由片段Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv_Fc、双特异性抗体、或通过化学修饰而延长了半衰期的任意片段组成。
8.根据权利要求7所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中，其是包括氨基酸序列 SEQ ID N0.54 的 ScFv0
9.根据权利要求1所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中，其包括一条轻链和一条重链，所述轻链包括分别包括氨基酸序列SEQ ID N0.1、2和30的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;所述重链包括分别包括氨基酸序列SEQ ID N0.31、32和33的⑶R-Hl、⑶R-H2和 CDR-H3。
10.根据权利要求9所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其中，其包括包括氨基酸序列SEQ ID N0.34的轻链和包括氨基酸序列SEQ ID N0.35的重链。
11.一种分离的核酸，其中，其选自下列核酸: a)编码如权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或衍生物的之一的核酸、DNA或RNA ； b)包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQID N0.14至19和41至45组成的CDR序列； c)包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQID N0.20、21、46、47、72、73、74、86和87组成的重链和轻链可变结构域序列； d)包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQID N0.60至63、75至79、88和89组成的重链和轻链序列； e)包括由SEQID N0.55组成的DNA序列的核酸； f)如b)、c)、d)或e)中所限定的核酸的相应RNA核酸；g)如a)、b)、c)、d)和e)中所限定的核酸的互补核酸；及 h)至少18个核苷酸的核酸，其能够在高严谨度条件下与SEQID N0.14至19和41至45序列的⑶R的至少一个杂交。
12.—种载体，其包括如权利要求11所要求的核酸。
13.—种宿主细胞，其包括如权利要求12所要求的载体。
14.一种除人以外的转基因动物，其包括至少一个转化有权利要求12所要求的载体的细胞。
15.一种用于生产如权利要求1至10的任一项所要求的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一的方法，其中所述方法包括下列阶段: a)在基质中及合适的培养条件下培养如权利要求13所要求的细胞；及 b)从培养基质或所述培养细胞中回收由此产生的所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一。
16.一种通过权利要求15所要求的方法可获得的或获得的抗体、或其功能性片段或衍生物之一。
17.作为药物的根据权利要求1至10和16所述的抗体。
18.根据权利要求1 至10或16至17所述的抗体、或其功能性片段或衍生物之一，其中，其抑制HIV-1KON原代分离株在PBMC中的复制，其IC9tl为至少5 u g/ml，优选至少10 u g/ml o
19.一种组合物，其包括通过如权利要求1至10和16至18的任一项所要求的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一组成的化合物作为活性成分。
20.作为药物的如权利要求19所要求的组合物。
21.根据权利要求19和20所要求的组合物，用于预防或用于治疗HIV感染。
22.根据权利要求21所要求的组合物，其中所述HIV感染是X4向性HIV感染。
23.根据权利要求21所要求的组合物，其中所述HIV感染是X4/R5向性HIV感染。
24.根据权利要求19至23所述的组合物，其中，其包括选自能特异性抑制HIV进入和/或复制的化合物至少第二抗HIV化合物。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述至少第二抗HIV化合物选自抗逆转录病毒药物如HIV蛋白酶抑制剂(PI )、核苷/核苷酸HIV逆转录酶抑制剂(NRTI/NtRTI )、非核苷HIV逆转录酶抑制剂(NNRTI )、HIV进入抑制剂、HIV整合酶抑制剂。
26.根据权利要求24或25所述的组合物，其中所述至少第二抗HIV化合物是抗CCR5化合物。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述抗CCR5化合物是马拉维诺。
28.用于筛选和/或鉴定作为CXCR4拮抗剂抗病毒试剂的分子的方法，包括步骤: a)选择表达CXCR4的细胞， b)孵育所述细胞和权利要求1至10或16至18所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，及 c)评估检验的分子抑制抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一与CXCR4之间结合的能力，及 d)选择能够产生所述抑制的分子。
29.根据权利要求1至10和16任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，和/或根据权利要求19至27任一项所述的组合物在制备用于抑制HIV复制的药物中的用途。
30.根据权利要求1至10和16任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，和/或根据权利要求19至27任一项所述的组合物在制备用于HIV疾病的预防或治疗的药物中的用途。
31.一种用于预防或治疗HIV的方法，其中所述方法包括由向有需要的患者施用根据权利要求1至10和16任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，和/或根据权利要求19至27任一项所述的组合物组成的步骤。
32.根据权利要求31所述的方法，其中方法还包括由向所述患者施用抗CCR5化合物组成的步 骤。
全文摘要
本发明涉及能够结合CXCR4、而且还能诱导CXCR4同源二聚体的构象改变，并能够抑制HIV-1原代分离株在PBMC中复制的分离的抗体、或其衍生物或抗原结合片段。更特别地，本发明涉及特异于CXCR4蛋白的515H7和301aE5单克隆抗体，以及其用于治疗HIV感染的用途。本发明还覆盖包含这些抗体的药物组合物以及用于选择这些抗体的方法。
文档编号C07K16/28GK103180342SQ201180052064
公开日2013年6月26日 申请日期2011年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者C·克林格-汉默 申请人:皮埃尔法布雷医药公司