专利名称：通过混合模式层析捕捉抗体的优化方法
通过混合模式层析捕捉抗体的优化方法本文中报告了使用Streamline CST和/或Capto MMC来纯化从经过澄清的细胞培养物上清液直接捕获的抗体的方法，其中尤其能有效除去产物相关(聚集物和片段)和工艺相关杂质(宿主细胞蛋白质、DNA、培养基组分)，从而得到纯度与经典的蛋白A亲和层析相当的制备物。
背景技术：
蛋白A层析由于其高选择性而常规用作产业单克隆抗体纯化工艺的第一捕捉步骤，产生良好的总体产量和纯度。然而，此亲和层析的一个主要缺点是其较高的价格，这尤其在以高剂量需要的治疗性抗体的情况中和/或对于长期施用可以造成相当大的商品成本因素。另外，自亲和基质浸出的蛋白A配体由于其潜在的免疫原性而必须通过进一步的层析步骤除去。在展现离子和疏水性官能度的多元树脂上的混合模式层析可以为经典亲和方法提供有价值的备选。由于疏水性成分的盐可容许性，在大多数情况下，将澄清的细胞培养物上清液在基质上直接加载是有可能的，产生对单克隆抗体的有效捕获。然而，由于树脂的多元性质，配体与特定单克隆抗体的不同类型的相互作用是有可能的，从而需要与传统的离子交换或疏水性相互作用层析不同的独特清洗和洗脱条件。在W02010/080062中，报告了使用单一聚合物相系统的分离方法。在W02008/073620中报告了用于生产在昆虫细胞系中表达的多肽的制备方法。发明概述已经发现了多元弱阳离子交换层析材料可以在直接用粗制细胞培养物培养上清液的柱层析纯化方法中作为第一步使用。
本文中报告的一个方面是用于生成抗IGF-1R抗体的方法，包括下列步骤:a)将粗制哺乳动物细胞培养物培养上清液施加到多元弱阳离子交换层析材料，b)通过将包含乙二醇和无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料来回收所述抗IGF-1R抗体，并且由此生成抗IGF-1R抗体。在一个实施方案中，所述方法在步骤a)前包括以下额外的步骤a-ι):a-1)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料。在一个实施方案中，所述方法在步骤a)后且在步骤b)前包括以下额外的步骤a-b):a-b)将缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。在一个实施方案中，所述步骤a-b)包括两个步骤a-bl)和a_b2):a-bl)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，并a-b2)将包含变性剂的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。在一个实施方案中，所述变性剂选自盐酸胍和尿素。在一个实施方案中，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾和氯化铵。
在一个实施方案中，步骤b)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，1050mM至1350mM氯化钠，和约20%(w/v)乙二醇，pH值为ρΗ7.I至ρΗ7.3。在一个实施方案中，步骤a-1)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，和80mM至120mM氯化钠，pH值为pH7.1至pH7.3。在一个实施方案中，步骤a_bl)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，和80mM至120mM氯化钠，pH值为ρΗ7.I至ρΗ7.3。在一个实施方案中，步骤a-b2)中的缓冲溶液包含110禮至1401111 Tris，80mM至120mM氯化钠，和30mM至40mM精氨酸，pH值为pH7.1至pH7.3。在一个实施方案中，所述多元弱阳离子交换层析材料包含交联琼脂糖，该交联琼脂糖共价附接有含有羧酸、醚、硫醚和芳香族官能团的多元弱阳离子交换配体。发明详述本文中报告了使用Streamline CST和/或Capto MMC来纯化从澄清的细胞培养物上清液捕获的单克隆抗体的方法，包括洗脱和清洗的优化条件。尤其可以有效除去产物相关(聚集物和片段)和工艺相关杂质(宿主蛋白质、培养基成分)，从而得到纯度与经典的亲和层析相当的制备物。如此，凭借本文中报告的方法，可以替换经典的蛋白A亲和层析。在一个实施方案中，所述方法不包括蛋白A亲和层析步骤。通用层析方法及其用途是本领域中技术人员已知的。参见例如Chromatography,第 5 版，A 部分:Fundamentals and Techniques, Heftmann, E.(编),ElsevierScience Publishing Company,New York, (1992);Advanced Chromatographic andElectromigration Methods in Biosciences,Deyl, Z.(编),Elsevier ScienceBV, Amsterdam,The Netherlands, (1998) ;Chromatography Today, Poole,C.F.和Poole,S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991);Scopes, ProteinPurification:Principles and Practice(1982);Sambrook,J.等(编),MolecularCloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.，1989;或 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.等(编)，John ffiley&Sons, Inc., New York (1987)。术语“施加”指纯化方法中使溶液与层析材料接触的部分步骤。这表示a)将溶液添加到含有层析材料的层析装置，或b)将层析材料添加到溶液。在情况a)中，溶液流过装置，从而允许层析材料和溶液中含有的物质相互作用。根据条件如例如pH、电导率、盐浓度、温度和/或流速，溶液中的一些物质可以结合至层析材料，而其它物质可以自层析材料回收。可以在流过物中找到溶液中保留的或从层析材料回收的物质。“流过物”指在流过装置后获得的溶液，其可以是施加的溶液或用于清洗柱或引起与层析材料结合的物质洗脱的缓冲溶液。在一个实施方案中，所述装置是柱或盒。在b)情况中，可以将层析材料例如以固体添加到例如含有待纯化的感兴趣物质的溶液，从而允许层析材料和溶液中物质之间的相互作用。在相互作用后，例如通过过滤取出层析材料，并且与层析材料结合的物质也从溶液中与其一起取出，而没有与层析材料结合的物质保留在溶液中。
术语“结合-和-洗脱模式”指层析步骤的操作模式，其中将含有待纯化的感兴趣物质的溶液施加到层析材料，其中感兴趣的物质结合至层析材料。如此，感兴趣的物质在层析材料上保留，而不感兴趣的物质随流过物或上清液除去。然后，在第二步中用洗脱溶液从层析材料回收感兴趣的物质。在一个实施方案中，如本文中报告的方法以结合-和-洗脱模式操作。术语“缓冲溶液”指通过溶解的缓冲物质调节由于酸性或碱性物质的添加或释放导致的PH变化的溶液。可以使用任何具有这类特性的缓冲物质。一般地，使用药学可接受缓冲物质。在一个实施方案中，所述缓冲溶液选自由磷酸和/或其盐组成的磷酸盐缓冲溶液，或由醋酸和其盐组成的醋酸盐缓冲溶液，或由柠檬酸和/或其盐组成的柠檬酸盐缓冲液，或吗啉缓冲溶液，或2- (N-吗啉代)乙磺酸(ethanesulfonic)缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液，或甘氨酸缓冲溶液，或三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲溶液。在另一个实施方案中，所述缓冲溶液选自Tris缓冲溶液，或柠檬酸盐缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液。所述缓冲溶液可以包含无机盐，如例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化铵、或硫酸铵。术语“连续洗脱”和“连续洗脱方法”，在本申请内可互换使用，指如下的方法，其中连续改变(即提高或降低)引起洗脱(即从层析材料回收结合的化合物)的溶液的电导率，即通过一系列小步骤改变浓度，每个步骤不大于引起洗脱的物质的浓度的2%或1%变化。在此“连续洗脱”中，可以线性或指数性或渐近性改变一种或多种条件，例如pH、离子强度、盐浓度、和/或层析流动。在一个实施方案中，所述改变是线性的。术语“步式洗脱”指如下的方法，其中例如一次性(即从一个数值/水平直接到下一个数值/水平)提高或降低引起洗脱(即从层析材料回收结合的物质)的物质的浓度。在此“步式洗脱”中，可以将一种或多种条件，例如pH、离子强度、盐浓度、和/或层析流动从第一(例如起始)数值至第二(例如最终)数值一次性全部改变。如此，与线性变化形成对比，条件是增量(即逐步)变化的。术语“多元弱阳离子交换层析材料”指固定的高分子量基质，如化学交联的琼脂糖，其携带在离子交换层析中作为固定相使用的、共价结合的、带电荷的取代基。为了总体电荷中性，对其结合非共价结合的反荷离子。“多元弱阳离子交换层析材料”具有用其非共价结合的阳离子反荷离子交换周围溶液的带类似电荷的离子的能力。“多元弱阳离子交换层析材料”包含共价结合的 配体，其能够施加离子相互作用、疏水相互作用、范德华(van-der-ffaals)相互作用以及与周围溶液中包含的分子形成氢键。对于本领域技术人员来说，将氨基酸序列(例如多肽的氨基酸序列)转化成编码此氨基酸序列的相应核酸序列的规程和方法是公知的。因此，核酸以由个别核苷酸组成的其核酸序列以及同样地以由其编码的多肽的氨基酸序列为特征。如本申请内使用的，术语“在适合于结合的条件下”及其语法等同物指感兴趣的物质(例如抗IGF-1R抗体)在与固定相(例如离子交换材料)接触时与其结合。这并不必然表示100%的感兴趣物质与固定相是结合的，而是基本上100%的感兴趣物质是结合的，即至少50%的感兴趣物质是结合的，优选地至少75%的感兴趣物质是结合的，优选地至少85%的感兴趣物质是结合的，更优选地至少95%的感兴趣物质是结合的。术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。天然存在的抗体是具有不同结构的分子。例如，天然IgG抗体是约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链构成。从N到C端，每条重链具有I个可变域(VH)，也称作可变重域或重链可变域，接着是3个或4个恒定域(CHI，CH2, CH3及任选地CH4)。类似地，从N到C端，每条轻链具有可变域(VL)，也称作可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻链(CL)域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列归入两种型，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)之一。人胰岛素样生长因子I受体(16 _11 302.7.112，^221抗原)属于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族(LeRoith, D.等，Endocrin.Rev.16 (1995) 143-163; Adams, Τ.Ε.等，Cell.Mol.Life Sc1.57(2000) 1050-1063)。IGF-1R以高亲和力结合IGF-1，并且在体内启动对此配体的生理学应答。IGF-1R也结合IGF-1I，不过以略低的亲和力结合。IGF-1R过表达促进细胞的新生物转化，并且存在如下的证据，即IGF-1R牵涉细胞的恶性转化，因此它是一种对于开发供治疗癌症用的治疗剂的有用靶物(Adams，T.E.等，Cell.Mol.LifeSc1.57 (2000) 1050-1063)。W02004/087756.W02007/045456 和 W02007/115814 中报告了例示性的抗IGF-1R抗体、其编码序列及生成方法。对于例如通过细胞培养方法生成的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的纯化，一般采用不同层析步骤的组合。通常，蛋白A亲和层析继之以一个至两个额外的分离步骤。在一个实施方案中，所述额外的层析步骤是阳离子和阴离子交换层析步骤或反之亦然。最终的纯化步骤是所谓的“精制步骤”，用于除去痕量的杂质和污染物如聚集的免疫球蛋白、残留的HCP(宿主细胞蛋白质)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒、或内毒素。在一个实施方案中，最终纯化步骤是流过模式的阴离子交换层析。已经发现了，多元弱阳离子交换·层析材料可以在直接用粗制细胞培养物培养上清液的柱层析纯化方法中作为第一步使用，替换通常使用的蛋白A亲和层析。本文中报告的一个方面是用于生成抗IGF-1R抗体的方法，包括下列步骤:a)将粗制哺乳动物细胞培养物培养上清液施加到多元弱阳离子交换层析材料，b)通过将含有乙二醇和无机盐的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料来回收所述抗IGF-1R抗体，并且由此生成抗IGF-1R抗体。对于如本文中报告的方法，不需要粗制培养上清液的预条件化(pre-conditioning)。这是令人惊讶的，因为对于从已经生成不同抗体的培养物获得的培养上清液，至少需要降低电导率以容许从培养物上清液直接捕捉抗体。另外，几乎定量地从粗制细胞培养上清液捕捉抗IGF-1R抗体。由于从阳离子交换层析材料回收多肽的一般可应用条件和通过疏水性相互作用结合至多元弱阳离子交换层析材料的条件指向相反方向，因此需要从多元弱阳离子交换层析材料回收抗体的新条件。在一个实施方案中，所述方法在步骤a)前包括以下额外的步骤a-Ι):a-1)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料。在另一个实施方案中，所述方法在步骤a)后且在步骤b)前包括以下额外的步骤a-b):a-b)将缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。在又一个实施方案中，步骤a-b)包括两个步骤a-bl)和a_b2):a-bl)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，并a-b2)将包含变性剂的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。还在一个实施方案中，所述变性剂选自盐酸胍、尿素和精氨酸。在一个实施方案中，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾和氯化铵。还在一个实施方案中，步骤b)中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris, 1050mM 至 1350mM 氯化钠，和约 20%(w/v)乙二醇，pH 值为 ρΗ7.I至ρΗ7.3。在一个实施方案中，步骤a-1)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，和80mM至120mM氯化钠，pH值为pH7.1至pH7.3。在别的实施方案中，步骤a_bl)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，和80mM至120mM氯化钠，pH值为ρΗ7.I至ρΗ7.3。在另一个实施方案中，步骤a-b2)中的缓冲溶液包含110禮至1401111 Tris，80mM至120mM氯化钠，和30mM至40mM精氨酸，pH值为pH7.1至pH7.3。在又一个实施方案中，所述多元弱阳离子交换层析材料包含交联琼脂糖，该交联琼脂糖共价附接有含有羧酸、醚、硫醚和芳香族官能团的多元弱阳离子交换配体。在一个实施方案中，在步骤a-Ι)中将总体积为5个柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料。在另一个实施方案中，在步骤a-bl)中将总体积为5个柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料。还在一个实施方案中，在步骤a-b2)中将总体积为10个柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料。在又一个实施方案中，在步骤b)中将总体积为10个柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料。已经发现了缓冲溶液的各成分具有下列影响:
权利要求
1.一种用于生成抗IGF-1R抗体的方法，包括下列步骤: a)将粗制哺乳动物细胞培养物培养上清液施加到多元弱阳离子交换层析材料， b)通过将包含乙二醇和无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料来回收所述抗IGF-1R抗体，并且由此生成抗IGF-1R抗体。
2.依照权利要求1的方法，其特征在于所述方法在步骤a)前包括以下额外的步骤a~l): a-1)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料。
3.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述方法在步骤a)后且在步骤b)前包括以下额外的步骤a-b): a-b)将缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。
4.依照权利要求3的方法，其特征在于所述步骤a-b)包括两个步骤a-bl)和a~b2): a-bl)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，并 a-b2)将包含变性剂的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。
5.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述变性剂选自盐酸胍和尿素。
6.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述无机盐选自氯化钠、氯化钾和氯化铵。
7.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤b)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris, 1050mM 至 1350mM 氯化钠，和约 20%(w/v)乙二醇，pH 值为 ρΗ7.I 至 ρΗ7.3。
8.依照权利要求2-7中任一项的方法，其特征在于步骤a-1)中的缓冲溶液包含20mM至 30mM TrisJP 8OmM 至 120mM 氯化钠，pH 值为 ρΗ7.I 至 ρΗ7.3。
9.依照权利要求4-8中任一项的方法，其特征在于步骤a-bl)中的缓冲溶液包含20mM至 30mM TrisJP 8OmM 至 120mM 氯化钠，pH 值为 ρΗ7.I 至 ρΗ7.3。
10.依照权利要求4-9中任一项的方法，其特征在于步骤a-b2)中的缓冲溶液包含IlOmM至 140mM Tris，80mM至 120mM氯化钠，和 30mM至40mM精氨酸，pH值为ρΗ7.I 至ρΗ7.3。
11.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述多元弱阳离子交换层析材料包含交联琼脂糖，该交联琼脂糖共价附接有含有羧酸、醚、硫醚和芳香族官能团的多元弱阳离子交换配体。
全文摘要
本文中报告了使用Streamline CST和/或Capto MMC来纯化从经过澄清的细胞培养物上清液直接捕获的抗体的方法，其中尤其能有效除去产物相关(聚集物和片段)和工艺相关杂质(宿主细胞蛋白质、培养基组分)，从而得到纯度与经典的蛋白A亲和层析相当的制备物。
文档编号C07K16/28GK103201288SQ201180053110
公开日2013年7月10日 申请日期2011年11月2日 优先权日2010年11月5日
发明者山田秀成, R.法尔肯斯坦, T.莱姆, M.斯特拉瑟 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司