专利名称：4-1bb结合分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体，特别是结合人4-1BB的抗体。
背景技术：
4-1BB (也称作CD137，TNFRSF9等)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白质。目前对于4-1BB的了解表明其表达通常是激活依赖性的，并且存在于广泛的免疫细胞亚系包括激活的NK·和NKT细胞、调节性T细胞、树突状细胞(DC)、刺激的肥大细胞、分化中的髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中(Wang, 2009, Immunological Reviews229:192-215)。在肿瘤脉管系统(Broil, 2001, Amer.J Clin.Pathol.115(4):543-549 ；Seaman, 2007, Cancer Cellll: 539-554)及在炎症或动脉粥样硬化内皮部位(Drenkard, 2007FASEB J.21:456-463 ；01ofsson, 2008，Circulationll7:1292-1301)也已经证实4-1BB表达。刺激4-1BB的配体，即4-1BB配体(4-1BBL)，在激活的抗原呈递细胞(APC)、髓样祖细胞(myeloid progenitor)及造血干细胞上表达。人4-1BB 是具有 255 个氨基酸的蛋白质(Accession N0.NM_001561 ；NP_001552)。完整的人4-1BB氨基酸序列在SEQ ID N0:68中示出。所述蛋白质包含信号序列(氨基酸残基1-17)，随后是胞外结构域(169个氨基酸)，跨膜区(27个氨基酸)，及胞内结构域(42个氨基酸)(Cheuk ATC et al.2004Cancer Gene Therapyll: 215-226)。受体在细胞表面以单体和二聚体形式上表达，并且易于与配体三聚体化而信号传导。对鼠和人T细胞进行的众多研究表明4-1BB启动增强的细胞增殖、存活及细胞因子产生(Croft, 2009，Nat Rev Immunol9:271-285)。研究表明一些 4-1BB 激动剂 mAb 在许多模型中增加共刺激分子表达，并且显著增强细胞溶解性T淋巴细胞应答，引起抗肿瘤功效。已经证实4-1BB激动剂mAb在预防和治疗方面的功效。进一步地，4-1BB单一治疗和组合治疗肿瘤模型已经确定持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答(Lynch，2008，ImmunolRev.22:277-286) d-1BB激动剂在许多本领域认可的自身免疫模型中也已经示出抑制自身免疫反应(Vinay，2006，J Mol Med84:726-736)。4-1BB的这种双重活性给予了提供抗肿瘤活性同时减弱可与破坏免疫耐受性的免疫治疗方法相关的自身免疫副作用的潜力。长久以来仍未满足对于结合人4-1BB、增加4-1BB-介导的应答的抗体及从而提供治疗各种疾病和病症包括癌症的潜在治疗方法的需求。发明概述本发明的一方面提供了分离的结合人4-1BB的结合分子，如抗体或其结合片段或其衍生物。本发明另一方面提供了包含结合4-1BB的结合分子的组合物。本发明另一方面提供了使用本发明的一或多种结合分子治疗与4-1BB信号传导(signaling)相关的或由4-1BB信号传导介导的疾病和/或病症的方法。本发明的这些及其它方面在本文更充分描述。在一些方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体。在一特定方面，所述分离的抗体在包含SEQ ID N0:68的115-156位氨基酸残基的表位结合人4-1BB。在一些特定的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 29所示H-⑶Rl氨基酸序列，SEQ ID N0:30所示H-CDR2氨基酸序列及SEQ ID NO:31所示H-CDR3氨基酸序列。在其它特定的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:34所示L-⑶Rl氨基酸序列，SEQID N0:35所示L-CDR2氨基酸序列，以及SEQ ID NO:36所示L-CDR3氨基酸序列。 在另一特定方面，使用本发明所述BIACore测定针对人4-1BB胞外结构域测量，所述分离的抗体结合人4-1BB，Kd为600nM或更低、IOOnM或更低、50nM或更低、IOnM或更低、5nM或更低或者InM或更低。在另一特定方面，所述分离的抗体包含:(a) SEQ ID NO: USEQ ID N0:15或SEQ IDN0:29所示H-CDRl ； (b) SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:16 或SEQ ID NO:30所示H-CDR2 ;以及(c)SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0:17 或 SEQ ID NO: 31 所示 H-CDR3。在另一特定方面，所述分离的抗体包含:(a) SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:20或SEQ IDNO:34 所示 L-CD·Rl ； (b) SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 21 或 SEQ ID NO:35 所示 L-CDR2 ;及(c)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO:36 或 SEQ ID NO: 55 所示 L-CDR3。另一方面，所述分离的抗体包含:(a)SEQ ID NO: USEQ ID N0:15 或 SEQ ID NO: 29所示 H-CDRl ； (b) SEQ ID NO: 2,SEQ ID N0:16 或 SEQ ID NO: 30 所示 H-CDR2 ;及(c) SEQ IDNO: 3,SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO: 31 所示 H-CDR3 ;以及进一步包含:(d) SEQ ID N0:6、SEQID N0:20或SEQ ID N0:34所示L-CDR1 ； (e) SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:21 或SEQ ID N0:35所示L-CDR2 ;及(f)SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:22,SEQ ID N0:36或SEQ ID NO:55所示L-CDR3。在一些进一步的特定方面中，所述分离的抗体选自如下一组:(a)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO:1所示H-CDR1，SEQ ID N0:2所示H-CDR2，及 SEQ ID NO: 3 所示 H-CDR3 ；(b)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO: 15所示H-CDRl，SEQ ID N0:16所示 H-CDR2，及 SEQ ID NO: 17 所示 H-CDR3 ;及(c)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO:29所示H-CDR1，SEQ ID N0:30所示 H-CDR2，及 SEQ ID NO: 31 所示 H-CDR3。在一些进一步的方面中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人4-1BB，其中所述抗体或抗原结合部分选自如下一组:(a)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID N0:6K*L_CDR1，SEQ ID N0:7所示L-CDR2，及 SEQ ID NO:8 所示 L-CDR3 ；(b)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO:20所示L-CDRl，SEQ ID N0:21所示 L-CDR2，及 SEQ ID NO:22 所示 L-CDR3 ；(c)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO:34所示L-CDRl，SEQ ID N0:35所示 L-CDR2，及 SEQ ID NO: 36 所示 L-CDR3 ；以及(d)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO:34所示L-CDRl，SEQ ID N0:35所示 L-CDR2，及 SEQ ID NO:55 所示 L-CDR3。在一些进一步的特定方面中，所述分离的抗体选自如下一组:(a)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO:1所示H-CDR1，SEQ ID N0:2所示H-CDR2，及 SEQ ID NO: 3 所示 H-CDR3 ;SEQ ID NO: 6 所示 L-CDR1，SEQ ID NO: 7 所示 L-CDR2，及 SEQ ID NO:8 所示 L-CDR3 ；(b)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO: 15所示H-CDR1，SEQ ID N0:16所示 H-CDR2，及 SEQ ID NO: 17 所示 H-CDR3 ;SEQ ID NO:20 所示 L-CDR1，SEQ ID NO:21 所示L-CDR2，及 SEQ ID NO:22 所示 L-CDR3 ；(c)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO:29所示H-CDRl，SEQ ID N0:30所示 H-CDR2，及 SEQ ID NO: 31 所示 H-CDR3 ;SEQ ID NO: 34 所示 L-CDR1，SEQ ID NO: 35 所示L-CDR2，及 SEQ ID NO: 36 所示 L-CDR3 ;以及(d)抗体或其抗原结合部分，其包含:SEQ ID NO:29所示H-CDRl，SEQ ID N0:30所示 H-CDR2，及 SEQ ID NO: ·31 所示 H-CDR3 ;SEQ ID NO: 34 所示 L-CDR1，SEQ ID NO: 35 所示L-CDR2，及 SEQ ID NO:55 所示 L-CDR3。在进一步的特定方面中，所述分离的抗体包含SEQ ID NO:4,SEQ ID NO: 18,SEQ IDNO: 32和SEQ ID NO: 43所示Vh链氨基酸序列。在进一步的特定方面中，所述分离的抗体包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:37, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:56, SEQ ID N0:60 或 SEQ ID N0:64 所示
八链氨基酸序列。在进一步的特定方面中，所述分离的抗体包含SEQ ID N0:4、18、32和43任一所示Vh 结构域氨基酸序列，及进一步包含 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:37、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO:60 及 SEQ ID NO:64 任一所示 Vl 结构域
氨基酸序列。在进一步的特定方面中，所述分离的抗体选自如下一组:(a)包含SEQ ID NO:4所示Vh链氨基酸序列及SEQ ID NO:9所示Vlj链氨基酸序列的抗体；(b)包含SEQ ID NO: 18所示Vh链氨基酸序列及SEQ ID NO: 23所示\链氨基酸序列的抗体；(c)包含 SEQ ID NO: 32 所示 Vh 链氨基酸序列及 SEQ ID NO: 37 或 SEQ ID NO: 56所示\链氨基酸序列的抗体；及(d)包含 SEQ ID NO:43所示 Vh链氨基酸序列及 SEQ ID NO:45, SEQ ID N0:51、SEQID N0:60或SEQ ID NO:64所示Vl链氨基酸序列的抗体。在再进一步的特定方面中，本发明提供的分离的抗体包含由如下序列编码的Vh链:(i)包含 SEQ ID NO:1USEQ ID NO:25、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:47 的核酸序列，或者
(ii)在高度严格条件下与 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:25, SEQ ID N0:39 或 SEQ ID NO:47的互补链杂交的核酸序列。在再进一步的特定方面，所述分离的抗体包含由如下序列编码的'链:(i)包含SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:58、SEQ ID N0:62或SEQ ID NO:66的核酸序列，或者(ii)在高度严格条件下与SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO: 66的互补链杂交的核酸序列。在进一步的特定方面中，提供了分离的抗体，其与选自M0R-6032、M0R-7361、M0R-7480.M0R-7480.UM0R-7480.2、M0R7483、M0R-7483.1 或 M0R-7483.2 示例性抗体竞争和/或交叉竞争对人4-1BB的结合。在进一步的定方面中，提供了分离的抗体，其结合人4-1BB上与本文揭示的任何抗体所结合的相同的表位。在一些实施方案中，本发明提供了分离的抗体，其结合人4-1BB上与选自 M0R-6032、MOR-7361、M0R-7480、M0R-7480.1、M0R-7480.2、M0R7483、M0R-7483.1或M0R-7483.2的示例性抗体所结合的相同的表位。在进一步的特定方面中，本发明提供了分离的结合人4-1BB的抗体，其包含是人Vh3-23基因、Vh1-69基因或Vh5基因的产物或衍生自其中的重链可变区。在另一特定方面中，本发明提供了分离的结合人4-1BB的抗体，其包含是人'λ 3或λ 1-13基因的产物或衍生自其中的轻链可变区。在一些实施方案中，本文·描述的分离的抗体具有如下一或多种性质或特性:a)特异性结合人4-1BB ；b)结合人和食蟹猴(cynomolgus) 4-1BB ;c)结合人4-1BB或食蟹猴4-1BB，但不结合大鼠或小鼠4-1BB ；d)是 IgG，如 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 ;及e)是人抗体，或者人源化抗体。在一些其它方面，本发明提供了本发明提供的任何抗体的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合部分是Fab或scFv片段。在一些进一步的方面中，本发明提供了本发明提供的任何抗体的衍生物。在一些其它方面中，本发明提供了分离的核酸，其编码结合人4-1BB的抗体或抗原结合部分的％链，选自如下核酸序列:(i)编码 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 18、SEQ ID N0:32 或 SEQ ID N0:43 所示 Vh 链氨基酸序列的核酸序列；(ii)SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO:47所示核酸序列；
或者(iii)在高度严格条件下与 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:39 或 SEQID NO:47所示核酸序列的互补链杂交的核酸序列。在一些其它方面中，本发明提供了分离的核酸，其编码结合人4-1BB的抗体或其抗原结合部分的\链，其选自如下核酸序列:(i)编码 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:51, SEQ ID NO:56, SEQ ID N0:60或SEQ ID NO:64所示Vl链氨基酸序列的核酸序列；(ii)SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO:62 或 SEQ ID NO:66 所示核酸序列；或者(iii)在高度严格条件下与 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:26, SEQ ID N0:40 或 SEQID NO:48, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:62 或 SEQ ID N0:66 所示核酸序列的互补链杂交的核酸序列。在一些进一步的方面中，本发明提供了包含本发明所述任何核酸的载体。在再进一步的方面中，本发明提供了包含本发明所述任何载体的宿主细胞。这种宿主细胞可以是细菌或哺乳动物。在一些进一步的方面中，本发明提供了药物组合物，其包含任何所述抗体或其抗原结合部分或其衍生物以及药物可接受的载体。本发明进一步提供了治疗需要治疗的对象中异常细胞生长的方法，包括给予该对象有效量的本发明的结合分子或本发明所述药物组合物。本发明进一步提供了降低对象中肿瘤细胞转移的方法，包括给予所述对象有效量的本发明所述结合分子或药物组合物。另一方面，本发明提供了本发明所述任何结合分子或药物组合物在生产治疗对象中异常细胞生长的药物中的应用。另一方面，本发明提供了本发明所述结合分子或药物组合物在治疗对象中异常细胞生长中的应用。再一方面，本发明提供了本发明所述结合分子或药物组合物在治疗对象中肿瘤细胞转移中的应用。再一方面，本发明提供了本发明所述任何结合分子或药物组合物在生产治疗对象中肿瘤细胞转移的药物中的应用。附图简述
图1是四个柱状图，示出与Alexafluor647缀合的指定4-1BB抗体或对照抗体一起温育的来自人(上左)、食蟹猴(cynomolgus)(上右)、犬(下左)和大鼠(下右)未刺激的(黑色)和PHA刺激的(浅灰色)原代PBMC的平均荧光强度。该图证实与用PHA刺激的人和食蟹猴PBMC的结合·。图2是两个线形图，示出已经用不同浓度的4-1BB特异性mAb或同种型对照mAb刺激的表达4-1BB的293T细胞中的萤光素酶受体活性。左侧图证实在表达食蟹猴4-1BB的细胞中的受体活性。右侧图证实在表达人4-1BB的细胞中的活性。数据表示为同种型对照之上的倍数刺激(fold stimulation)。图3(3A和3B)是线形图，示出在用抗-CD3及不同浓度4-1BB抗体刺激人T细胞72小时后细胞培养基中存在的人IL-2的浓度。每个图(A和B)表示各个供体。图4是散点图，示出已经用4-1BB mAb或同种型对照mAb处理的小鼠中人外周血单核细胞的扩增。数据以在研究第24-28天在第O天注射了 6百万人外周血单核细胞及在第9天注射了 lmg/kg4-lBB mAb或者同种型对照mAb的各个NSG小鼠的外周血中表达人⑶45的细胞百分比表示。统计显著性使用双尾Mann-Whitney检验确定，*p〈0.05, **p〈0.005。NoHBPT是指未注射人细胞的动物。图5是两个柱状图，示出在食蟹猴中在给予4-1BB mAb之后多个时间点增殖性CD8中枢记忆T细胞的变化。数据表示为代表各个指示为(剂量水平-动物数)的动物的柱，并且表示为K1-67+细胞数相对于研究前数目的动物内变化{[(在指定研究日的K1-67+细胞数-在给药前(pre-dose)的Ki_67+细胞数)/在给予前的Ki_67+细胞数]*100}。CD8中枢记忆细胞被确定为⑶3+、⑶8+、⑶28+和⑶95+。图6是线形图，示出在第O天皮下注射肿瘤细胞(PC3，左侧；L0V0，右侧)和人外周血单核细胞的肿瘤生长情况。在第O天给小鼠注射10mg/kg的指定4-1BB mAb。图7:左图是散点图，示出在用4-1BB mAb或载剂对照处理4-1BB敲入(knock in)小鼠后对T细胞表面标志物⑶8+阳性并且已经掺入BrdU核苷的PBMC百分比。右图是线形图，示出皮下注射进4-1BB敲入小鼠中及用指定浓度4-1BB mAb处理的鼠黑素瘤肿瘤的生长情况。图8:示出重链可变区和轻链可变区(下划线处为CDR)与相关种系序列的氨基酸序列对比。发明详述A.定义除非特别指出，本文中使用的科学和学术用语应具有本领域技术人员普遍已知的含义。此外，除非由上下文要求，单数用语应包括复数，复数用语应包括单数。通常地，本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学及杂交技术相关的命名法为本领域熟知及通用。如本文所用，如下每个术语具有在这个部分中相关的含义。术语“4-1BB抗体”是指如本文定义的能结合人4-1BB受体的抗体。术语“4-1BB”和“4-1BB受体”在本说明书中可互换使用，包括人4-1BB受体，以及其变体、同种型(isoform)及·物种同系物。因此，如本文定义和揭示的结合分子也可以结合来自除人之外其它物种的4-1BB。在其它情况中，结合分子可以完全特异于人4-1BB，可以不呈现出物种或其它类型交叉反应性。冠词“一个”是指一个或一个以上(即至少一个)该冠词的语法上的宾语。例如，“一个元件”是指一个元件或一个以上的元件。术语“激动剂”是指如本文定义的结合分子，其在结合4-1BB时:(1)刺激或激活4-1BB, (2)增强、增加、促进、诱导或延长4-1BB的活性、功能或存在，或者(3)增强、增加、促进或诱导4-1BB的表达。术语“氨基酸”是指天然发生的及合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其功能与天然发生的氨基酸相似。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸。术语“氨基酸类似物”是指这样的化合物，其具有与天然发生氨基酸相同的基本化学结构，但是C-末端羧基基团、N-末端氨基基团或者侧链官能团已经化学修饰为另一官能团。术语“氨基酸模拟物”是指这样的化学化合物，其具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是其功能与天然发生的氨基酸相似。术语“抗体”是本领域公认的术语，是指抗原结合蛋白(即免疫球蛋白)，其具有基本的四个多肽链结构，由两个相同的重链(H)和两个相同的轻链(L)组成。每个L链与H链通过一个共价二硫键连接，而两个H链根据H链同种型通过一或多个二硫键彼此连接。每个重链在N-末端具有一个可变区(在本文缩写SVh)，随后是一个恒定区。重链恒定区由三个结构域组成，CH1, Ch2和CH3。每个轻链在N-末端具有一个可变区(在本文缩写为，随后是在其另一端的恒定区。轻链恒定区由一个结构域组成，即Q。所述'与Vh排列成对，Q与重链的第一个恒定结构域(CHl)排列成对。成对的Vh与'一起形成一个抗原结合位点。IgM抗体由5个基本异四聚体单位以及称作J链的另一多肽组成，因此含有10个抗原结合位点，分泌的IgA抗体可聚合形成多价装配物，包含2-5个基本的4-链单位以及J链。V1^P \区可进一步再分为高可变区，称作互补决定区(OTR)，点缀着更保守的称作构架区(FR)的区域。所述⑶R区可以使用Kabat或Chothia编号系统确定，这两个系统均为本领域技术人员熟知。见例如Kabat, E.A.，et al.(1991) Sequences of Proteinsof Immunological Interest, Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices, NIH Publication N0.91-3242 ；Chothia and LeskjJ.Mo1.Biol.196:901 -917(1987)。每个Vi^PVl均由三个CDR及四个FR组成，以如下顺序从氨基末端排列至羧基末端:FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。在本说明书中，重链的三个CDR被称作H-CDRl、H-CDR2和H-CDR3。相似地，轻链的三个CDR被称作L-CDRl、L-CDR2和L-CDR3。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(Clq)。在轻链和重链内，可变区与恒定区通过大约12个或更多个氨基酸的“J”区结合，重链也包括大约10个或更多个氨基酸的“D”区。通常见Fundamental ImmunologyCh.7 (Paul, ff., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y.(1989))所述。来自任何脊椎动物物种的L链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以指定为两个明确不同类型之一，称作K和λ。根据其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，抗体可以被指定为不同类别或同种型。抗体有五个类别:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,分别具有称作a (alpha)、δ (delta)、ε (epsilon)、y (gamma)和 μ (mu)的重链。抗体的 IgG 类别分别通过Y重链Y1-Y4可进一步分为四个亚类:IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。术语“抗体衍生物”或者·抗体的“衍生物”是指这样的分子，其能结合所述抗体结合的相同抗原(如4-1BB)并包含与另外的分子实体连接的所述抗体的氨基酸序列。所述抗体衍生物中包含的抗体的氨基酸序列可以是抗体的全长重链，全长轻链，全长重链的任何部分，全长轻链的任何部分，抗体的任何其它片段，或者完整的抗体。另外的分子实体可以是化学或生物学分子。举例的另外的分子实体包括化学基团、氨基酸、肽、蛋白质(如酶，抗体)以及化学化合物。另外的分子实体可具有任何用途，如用作检测剂、标记、标志物、药物或治疗剂。抗体的氨基酸序列可以通过化学结合、遗传融合、非共价联合等方式与另外的分子实体附着或连接。术语“抗体衍生物”也涵盖嵌合抗体、人源化抗体，以及衍生自4-1BB抗体的氨基酸序列修饰的分子，如保守氨基酸取代、添加和插入。术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指抗体的一或多个部分，其保留所述抗体结合抗原的能力(如4-1BB)。示例性抗体的“抗原结合片段”包括(i)Fab片段，由\、VH、Cl和Chi结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’) 2片段，包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VdP Chi结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体一个臂的 Vl 和 Vh 结构域组成；(V) dAb 片段(Ward et al.，Nature341:544-546 (1989)),其由Vh结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。术语“结合分子”涵盖了⑴抗体，(2)抗体的抗原结合片段，及⑶抗体的衍生物，均如本发明定义。术语“结合4-1BB”或者“与4-1BB结合”是指在体外测定如实施例6所述BIAcore测定中本发明定义的结合分子与人4-1BB的结合，亲和性(Kd)为500nM或更低。术语“嵌合抗体”是指包含衍生自不同种动物的氨基酸序列的抗体，如具有衍生自人抗体的可变区及鼠免疫球蛋白恒定区的那些抗体。术语“竞争结合”是指两个抗体在与结合靶位的结合中的相互作用。如果在存在第二种抗体的条件下与不存在第二种抗体的条件下第一种抗体与其关联表位的结合明显降低，则第一种抗体与第二种抗体竞争结合表位。或者，在第二种抗体与其表位的结合在存在第一种抗体的条件下也可检测地降低的情况中也可以是(但不必须是)竞争性结合这种情况。即第一种抗体可抑制第二种抗体与其表位的结合，而不用第二种抗体抑制第一种抗体与其自己的表位的结合。然而，在每种抗体均可检测地抑制其他抗体与其关联表位的结合的情况中，无论程度相同、较大或较低，则称该抗体彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。术语“表位”是指抗原的被抗体(或其抗原结合片段)结合的部分。表位可以由连续的氨基酸组成或者通过蛋白质的三级折叠并列的不连续的氨基酸组成。由连续氨基酸组成的表位在暴露于变性溶剂时典型被保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时典型丧失。表位可包括独有的空间构象中的不同数目的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X-射线晶体学和二维核磁共振。见例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology, Vol.66, G.E.Morris, Ed.(1996)。一旦确定了抗原上希望的表位，可以产生该表位的抗体，例如使用本发明描述的技术。抗体的产生和鉴定也可以解释关于希望的表位的信息。从这个信息中，可以竞争性筛选结合相同表位的抗体。实现其的方法是进行交叉竞争研究，以发现互相竞争性结合的抗体，即与抗原竞争结合的抗体。基于其交叉竞争的“binning”抗体的高产量方法在PCT出版物N0.W003/48731中描述。术语“种系”是指通过生殖细胞从亲代传递到后代的抗体基因和基因节段的核苷酸序列。所述种系序列与在成熟B细胞中编码抗体的核苷酸序列不同，后者已经通过在B细胞成熟期间重组和超变事件被改变。术语“糖基化位点”是指由真核细胞识别为附着糖残基的部位的氨基酸残基。其中附着碳水化合物如寡糖的氨基酸典型·是天冬酰胺(N-连接)，丝氨酸(O-连接)和苏氨酸(O-连接)残基。特异的附着位点典型通过氨基酸序列信号传导，在本发明称作“糖基化位点序列”。所N-连接的糖基化的糖基化位点序列是-Asn-X-Ser-或-Asn-X-Thr-，其中X可以是除了脯氨酸之外的任何常规氨基酸。术语“N-连接的”和“O-连接的”是指作为糖分子与所述氨基酸序列之间附着位点的化学基团。N-连接的糖通过氨基基团附着；0_连接的糖通过轻基基团附着。术语“聚糖占据(glycan occupancy)”是指与糖基化位点连接的碳水化合物组分的存在(即聚糖位点被占据)。在多肽上存在至少两个潜在糖基化位点的情况中，无一位点(O-聚糖位点占据)、一个位点(1-聚糖位点占据)或这两个位点(2-聚糖位点占据)均可以被碳水化合物组分占据。术语“宿主细胞”是指可以工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养的细胞，如衍生自啮齿类动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)如CH0、BHK、NS0, SP2/0、YB2/0的哺乳动物培养细胞；或者人组织或杂交瘤，酵母细胞及昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养的组织内的细胞。术语涵盖不仅是特指的细胞，而且也包含这种细胞的后代。由于突变或环境影响导致某些修饰可以发生在后续的世代中，因此这种后代与亲代细胞可以不同，但是仍包含在术语“宿主细胞”范围内。术语“人抗体”是指其中轻链和重链的全部氨基酸序列均来自人免疫球蛋白基因的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中产生，人抗体可含有鼠碳水化合物链。人抗体可以根据本领域已知的各种方式制备。术语“人源化抗体”是指嵌合抗体，其含有衍生自人抗体序列的氨基酸残基。人源化抗体可含有来自非人动物抗体的一些或全部CDR，而该抗体的构架区和恒定区含有衍生自人抗体序列的氨基酸残基。术语“示例性抗体”是指本发明中描述的任一抗体，称之为M0R-6032、M0R-7361、M0R-7480.M0R-7480.UM0R-7480.2、M0R-7483、M0R_7483.I 和 M0R-7483.2。这些抗体可以是任何类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。因此，上述鉴别的每一抗体涵盖了具有相同八和Vh区氨基酸序列的所有五个类别的抗体。进一步地，IgG类别中的抗体可以是任何亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。因此，在IgG亚类中鉴别的每一抗体涵盖了具有相同'和Vh区氨基酸序列的所有四个亚类中的抗体。本领域已知这五个类别以及四个IgG亚类中人抗体的重链恒定区的氨基酸序列。例如，人IgGl和IgG2恒定区的氨基酸序列分别SEQID NO:69和71所示。文中提供了每一示例性抗体的IgG2亚类的全长重链氨基酸序列。术语“分离的抗体”或“分离的结合分子”是指如本发明定义的抗体或结合分子:
(I)其与在天然状态中伴随的天然相关的成分不关联；(2)没有来自相同物种的其他蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；或者(4)不是天然发生的。示例性分离的抗体包括使用经4-1BB亲和性纯化的4-1BB抗体，通过杂交瘤或其他细胞系在体外产生的4-1BB抗体，以及衍生自转基因动物的4-1BB抗体。术语“分离的核酸”是指基因组、cDNA或合成源或者其组合的核酸分子，其与所述核酸天然来源中存在的其他核酸分子分离。例如，关于基因组DNA，术语“分离的”包括与所述基因组DNA天然相关的染色体分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸没有天然在核酸两侧的序列(即位于感兴趣的核·酸的5’和3’末端的序列)。术语“ka”是指特定的抗体-抗原相互作用的结合速度常数，而术语“kd”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速度常数。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。其得自keka的比率(即kd/ka)，以摩尔浓度(M)表示。Kd用作测量抗体与其结合配体结合的亲和性。较小的Kd表示抗体更紧密的结合，或者抗体与抗原之间较高的亲和性。例如，具有纳摩尔(nM)解离常数的抗体与具有微摩尔(PM)解离常数的抗体相比与特定抗原的结合更紧密。抗体的Kd值可以使用本领域熟知的方法确定。确定抗体Kd值的一种方法是使用表面等离子共振，典型使用生物传感器系统如Biaeore 系统。使用BIACORE 系统(BIAcore测定)的测定程序在本发明的实施例章节中描述。术语“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何动物物种。示例性哺乳动物包括:人；实验室动物如大鼠，小鼠，猿猴和豚鼠；驯养动物如猫，犬，兔，牛，绵羊，山羊，马和猪；及圈养野生动物如狮子，老虎，大象等。术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即包含该群的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇修饰语“单克隆”不是被解释为需要通过任何特殊方法产生抗体。例如，所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生(见例如美国专利N0.4，816，567)。单克隆抗体也可以得自曬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal., Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks et al.，J.Mol.Biol.，222:581-597 (1991)所述技术进行。关于哺乳动物中某些疾病所用术语“预防”是指预防或延缓疾病的发生，或者预防其临床或亚临床症状的出现。术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，如分离自是另一物种免疫球蛋白基因转基因的动物的抗体，使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，分离自重组的组合的抗体文库的抗体，或者通过任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体，包括免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列。如本发明使用，两个多肽序列之间的“序列相同性”表示在序列之间是相同的氨基酸百分比。多肽的氨基酸序列相同性可以常规使用已知的计算机程序确定，如Bestfit，FASTA 或 BLAST (见例如 Pearson, Methods Enzymo1.183:63-98 (1990) ；Pearson, MethodsMol.Biol.132:185-219(2000) ；Altschul et al.，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)；Altschul et al., Nucelic Acids Res.25:3389-3402 (1997))。当使用或任何其他序列对比程序以确定一特定序列与参考氨基酸序列是否例如95%相同时，设定参数由此根据参考氨基酸序列全长计算相同性，允许占参考序列中氨基酸残基全部数目接近5%的同源性缺口。确定多肽之间相同性百分比的前述方法可用于本发明揭示的所有蛋白质、片段或其变体。如本发明定义，在提及结合分子(如抗体)与其结合配体(如抗原)相互作用中所用术语“特异性结合”是指结合分子在指定条件下区别来自动物的感兴趣的抗原与来自不同动物物种直系同源抗原的能力。如果4-1BB结合分子与人4-1BB的结合EC50低于其结合大鼠或小鼠4-1BB的EC50的50%，则称4-1BB结合分子特异性结合人4-1BB，如在体外测定中确定。抗体的结合特异性·可以使用本领域已知方法确定。举例的种种方法包括使用PHA刺激的原代细胞的FACS，Western印迹，ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-检测和肽扫描。在提及如本发明定义的结合分子(如抗体)与其结合配体(如抗原)的相互作用时使用术语“选择性结合”，是指所述结合分子在指定条件下区别来自动物物种的感兴趣的抗原(如人4-1BB)与来自相同动物物种的不同抗原(人CD40)的能力。如果4-1BB结合分子结合人4-1BB的EC50低于其结合人CD40或人CD134的EC50的10%，则称4-1BB结合分子选择性结合人人4-1BB，如在体外测定中确定。在提及哺乳动物中某些疾病时所用术语“治疗”是指在患病哺乳动物中引起希望的或有益的作用。所述希望的或有益的作用可包括减少疾病一或多个症状的频率或严重性(即肿瘤生长和/或转移，或者由免疫细胞的数目或活性介导的其他作用等)，或者阻抑或抑制疾病、病症或失调的进一步发展。在治疗哺乳动物癌症中，希望的或有益的作用可包括抑制癌细胞进一步生长或播散，癌细胞死亡，抑制癌症复发，减少与癌症相关的疼痛，或者改善哺乳动物存活率。所述作用可以是主观或客观的。例如，如果哺乳动物是人，则该人可明显改善体力或生命力或者减少疼痛等主观症状改善或对治疗有反应。或者，临床医生基于健康体检、实验室参数、肿瘤标志物或放射性图示可注意到肿瘤大小或肿瘤负荷(tumor burden)的降低。临床医生可观测到对治疗起反应的一些实验室迹象包括检测的标准化，如白细胞计数，红细胞计数，血小板计数，红细胞沉降率，及各种酶水平。此外，临床医生可观测可检测的肿瘤标志物的降低。或者，可使用其他检测评估客观改善，如声像图(sonograms ),核磁共振及正电子发射检测。术语“载体”是指能转运外源核酸分子的核酸分子。通过重组技术如连接或重组技术连接外源核酸分子与载体核酸分子。这样使得外源核酸分子在宿主细胞或生物体中被倍增，选择，进一步操纵或表达。载体可以是质粒，噬菌体，转座子，粘粒，染色体，病毒或病毒粒。一种类型的载体在导入宿主细胞中时可以整合进宿主细胞基因组中，从而与宿主基因组一起复制(例如非附加型哺乳动物载体)。另一类型载体能在其被导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制源的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。能指导与其可操纵地连接的可表达的外源核酸表达的另一特异类型载体通常称作“表达载体”。表达载体通常具有驱动可表达的外源核酸表达的控制序列。称作“转录载体”的简单载体仅能被转录但不被翻译:其能在靶细胞中复制但不被表达。术语“载体”涵盖了无论其功能的所有类型载体。能指导其可操纵地连接的可表达的核酸的表达的载体通常称作“表达载体”。本发明所述方法和技术特长根据本领域熟知的方法进行，及除非特别说明如在本说明书中引用和论述的各种一般及更特异的参考文献中描述。这种参考包括例如Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, NY (2001), Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, NY(2002), and Harlow and Lane Antibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)。根据厂商指导及本领域常规使用或如本发明描述进行酶反应和纯化技术。本发明中描述与分析化学、合成有机化学及医学和药物化学相关的实验程序和技术使用名称为本领域熟知和常规使用。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和输送及患者的治疗。如本发明使用，二十个常规氨基酸及其缩写根据常规使用。见Immunology—A Synthesis(2nd Edition, E.S.Golub and D.R.Gren,Eds., SinauerAssociates, Sunderland, Mass.(1991))。B.结合人4-1BB的结合分子本说明书提供·了结合人4-1BB的分离的结合分子，包括4-1BB抗体，4-1BB抗体的抗原结合片段，及4-1BB抗体的衍生物。B-1.4-1BB 抗体在一些方面中，本发明提供了在SEQ ID No:68的115-156位氨基酸内的表位结合人4-1BB的分离的抗体。在一些实施方案中，所述分离的抗体包含SEQ ID N0:29所示H-CDRl氨基酸序列，SEQ ID NO: 30所示H-CDR2氨基酸序列，及SEQ ID NO: 31所示H-CDR3氨基酸序列。在一些其它实施方案中，所述分离的抗体包含SEQ ID N0:34所示L-⑶Rl氨基酸序列，SEQ ID NO: 35所示L-CDR2氨基酸序列，及SEQ ID NO: 36所示L-CDR3氨基酸序列。在一些其它实施方案中，上文描述的抗体具有下文描述的一或多种生物学性质。在其它方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体包含:(a) SEQ ID NO: K SEQ ID N0:15 或 SEQ ID NO: 29 所示 H-CDR1 ; (b) SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO: 16 或 SEQ ID NO: 30 所示 H-CDR2 ;及(c) SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO: 31所示 H-CDR3。另一方面，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体包含:(a) SEQID NO: 6、SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO: 34 所示 L-CDR1 ; (b) SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 21 或SEQ ID N0:35 所示 L-CDR2 ;及(c) SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22, SEQ ID N0:36 或 SEQ IDNO:55 所示 L-CDR3。再一方面，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体包含:(a) SEQID N0:USEQ ID NO: 15 或SEQ ID NO: 29所示H-CDR1 ； (b) SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 16 或SEQID N0:30 所示 H-CDR2 ;及(c) SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO: 31 所示 H-CDR3 ；及进一步包含:(d) SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO: 34 所示 L-CDR1 ; (e) SEQ IDNO:7,SEQ ID N0:21 或 SEQ ID NO:35 所示 L-CDR2 ;及(f) SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:22,SEQID NO:36 或 SEQ ID NO:55 所示 L-CDR3。在一些进一步的方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体选自:
(a)包含 SEQ ID NO:1 所示 H_CDR1，SEQ ID NO:2 所示 H-CDR2 及 SEQ ID NO: 3 所示H-CDR3的抗体；(b)包含 SEQ ID NO: 15 所示 H-CDRl，SEQ ID NO: 16 所示 H-CDR2 及 SEQ ID NO: 17所示H-⑶R3的抗体；及(c)包含 SEQ ID NO: 29 所示 H-CDR1，SEQ ID NO: 30 所示 H-CDR2 及 SEQ ID NO: 31所示H-CDR3的抗体。在一些进一步的方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体选自如下一组:(a)包含 SEQ ID NO:6 所示 L_CDR1，SEQ ID NO:7 所示 L-CDR2 及 SEQ ID NO:8 所示L-CDR3的抗体；(b)包含 SEQ ID· NO: 20 所示 L-CDR1，SEQ ID NO: 21 所示 L-CDR2 及 SEQ ID NO: 22所示L-⑶R3的抗体；(c)包含 SEQ ID NO: 34 所示 L-CDR1，SEQ ID NO: 35 所示 L-CDR2 及 SEQ ID NO: 36所示L-⑶R3的抗体；以及(d)包含 SEQ ID NO: 34 所示 L-CDR1，SEQ ID NO: 35 所示 L-CDR2 及 SEQ ID NO: 55所示L-CDR3的抗体。在一些进一步的方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体选自如下一组:(a)包含 SEQ ID NO:1 所示H-CDR1，SEQ ID NO: 2 所示H-CDR2及 SEQ ID NO: 3 所示H-CDR3 ；SEQ ID NO:6 所示 L-CDR1，SEQ ID NO:7 所示 L-CDR2 及 SEQ ID NO:8 所示 L-CDR3的抗体；(b)包含 SEQ ID NO: 15 所示 H-CDR1，SEQ ID NO: 16 所示 H-CDR2 及 SEQ ID NO: 17所示 H-CDR3;SEQ ID NO: 20 所示 L-CDRl，SEQ ID NO: 21 所示 L-CDR2 及 SEQ ID NO: 22 所示L-CDR3的抗体；(c)包含 SEQ ID NO: 29 所示 H-CDR1，SEQ ID NO: 30 所示 H-CDR2 及 SEQ ID NO: 31所示 H-CDR3;SEQ ID NO: 34 所示 L-CDR1，SEQ ID NO: 35 所示 L-CDR2 及 SEQ ID NO: 36 所示L-CDR3的抗体；以及(d)包含 SEQ ID NO: 29 所示 H-CDRl，SEQ ID NO: 30 所示 H-CDR2 及 SEQ ID NO: 31所示 H-CDR3;SEQ ID NO: 34 所示 L-CDR1，SEQ ID NO: 35 所示 L-CDR2 及 SEQ ID NO: 55 所示L-CDR3的抗体。在进一步的方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体包含 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 32 或 SEQ ID NO:43 所示 Vh 链氨基酸序列。在进一步的方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:45,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:64所示Vl链氨基酸序列。在进一步的方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体包含(I)SEQ ID NO:4,SEQ ID NO: 18,SEQ ID N0:32 或 SEQ ID NO:43 所示 Vh 链氨基酸序列，及(2)SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51, SEQ IDNO: 56、SEQ ID NO:60 或 SEQ ID NO:64 所示 Vl 链氨基酸序列。
在进一步的方面中，本发明提供了结合人4-1BB的分离的抗体，其中所述抗体选自如下一组:(a)包含SEQ ID NO:4所示Vh链氨基酸序列及SEQ ID NO:9所示\链氨基酸序列的抗体；(b)包含SEQ ID NO: 18所示Vh链氨基酸序列及SEQ ID NO: 23所示\链氨基酸序列的抗体；(c)包含 SEQ ID NO: 32 所示 Vh 链氨基酸序列及 SEQ ID NO: 37 或 SEQ ID NO: 56所示\链氨基酸序列的抗体；及(d)包含 SEQ ID NO:43所示 Vh链氨基酸序列及 SEQ ID NO:45,SEQ ID N0:51、SEQID N0:60或SEQ ID NO:64所示Vl链氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，上文描述的抗体，包括提及表位结合描述的抗体及提及CDR或可变区的特异性氨基酸序列描述的抗体，具有至少一种如下功能性质:(a)结合人4-1BB, Kd为500nM或更低；(b)对人4-1BB具有激动剂活性；(c)在直至IOOOnM浓度不结合人⑶40受体；(d)在直至IOOOnM浓度不结合人⑶134受体；(e)在直至IOOnM浓度不结合大鼠或小鼠4-lBB;(h)能抑制肿瘤细胞生长；及(i)对癌症具有治疗性作用。在一些进一步的实施方案中，所述抗体特异性结合人4-1B·B，对于人4-1BB胞外结构域的Kd为500nM或更低，IOOnM或更低，50nM或更低，IOnM或更低，5nM或更低，或者InM或更低，根据本发明中描述的BIACore测定测量。在进一步的实施方案中，所述抗体是特异性结合人4-1BB的人抗体或人源化抗体，根据在本发明中描述的BIACore测定测量，其对于人4-1BB胞外结构域的Kd为500nM或更低，IOOnM或更低，50nM或更低，IOnM或更低，5nM或更低，或者InM或更低。在一些进一步的实施方案中，所述抗体是特异性和选择性结合人4-1BB的人抗体。
在其它实施方案中，上文描述的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区，如包含是人Vh1-69基因、VH3-23基因或VH5基因的产物或衍生自其中的重链可变区的抗体。示例性抗体包括M0R-7480.UM0R-7480.2、M0R_7483.1和M0R-7483.2，其均含有衍生自人种系VH5基因的氨基酸。在其它实施方案中，上述抗体包含衍生自人' λ 3基因的轻链可变区。在其它实施方案中，上述抗体包含是人Vh1-69基因、Vh3-23基因或Vh5基因的产物或衍生自其中的重链可变区，及进一步包含是人' λ 3基因的产物或衍生自其中的轻链可变区，其中所述抗体或其一部分特异性结合人4-1ΒΒ。示例性抗体包括M0R-7480.1，M0R-7480.2，M0R-7483.1和M0R-7483.2，其均含有分别衍生自人种系VH5基因和Vl λ 3基因的氨基酸。如本发明使用，如果抗体的可变区得自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，则人抗体包含“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。这种系统包括用感兴趣的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用感兴趣的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。可以如此鉴别“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体，通过对比人抗体与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列，及选择序列与人抗体序列最接近的(即最高％相同性)的人种系免疫球蛋白序列。“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比由于如天然发生体细胞突变或内在导入定向突变而可含有氨基酸差异。然而，选择的人抗体的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列典型至少90%相同，及含有与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(如鼠种系序列)相比将人抗体识别为人的氨基酸残基。在某些情况中，人抗体与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以是至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同的。典型地，衍生自特定人种系序列的人抗体显示出与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸差异。在某些情况中，人抗体可显示出与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个、或者甚至不超过4、3、2或I个氨基酸差异。示例性抗体与相关种系的可变区的氨基酸序列对比在图6中提供。另一方面，本发明提供了分离的抗体，其与本发明任何示例性抗体竞争或交叉竞争结合人 4-1BB，所述示例性抗体如 M0R-6032、MOR-7361、M0R-7480、M0R-7480.1、M0R-7480.2、M0R-7483、M0R-7483.1或M0R-7483.2。在特异的实施方案中，本发明提供了分离的抗体，其与本发明任何示例性抗体竞争或交叉竞争结合人4-1BB上相同表位。抗体与另一抗体竞争或交叉竞争结合的能力可以使用本领域已知的标准结合测定确定，如BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞术。例如，可以使得本发明示例性抗体在饱和条件下结合人4-1BB，然后测量检测抗体结合4-1BB的能力。如果检测抗体能与示例性抗体同时结合4-1BB，则该检测抗体结合与示例性抗体不同的表位。然而，如果检测抗体不能同时结合4-1BB,则该检测抗体结合与示例性抗·体相同的表位、重叠表位或与由示例性抗体结合的表位紧邻的表位。这个试验可以使用各种方法进行，如ELISA、RIA、FACS或表面等离子共振。本发明描述的4-1BB抗体可以是任何类别，如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。优选4-1BB抗体是IgG类别，如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚类，更优选IgG2亚类。4-1BB抗体可以通过使用本领域已知的方法从一个类别或亚类转变为另一类别或亚类。示例性产生希望类别或亚类的抗体的方法包括分离编码4-1BB抗体的重链的核酸及编码4-1BB抗体的轻链的核酸，分离编码％区的序列，连接Vh序列与编码希望类别或亚类的重链恒定区的序列，在细胞中表达轻链基因和重链恒定区，及收集4-1BB抗体的步骤。此外，本发明提供的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。由本发明提供的示例性特异的分离的抗体包括如下示例性抗体:M0R_6032、MOR-7361、M0R-7480、M0R-7480.1、M0R-7480.1、M0R-7480.2、M0R-7483、M0R-7483、M0R-7483.1及M0R-7483.2。这些抗体的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列，IgG2亚类的全长重链、轻链可变区及全长轻链在本发明中提供，这些序列的SEQ ID NO在表I中提供。这些示例性抗体的CDR的氨基酸序列在表2中示出。表1:SEQIDN0 索引
权利要求
1.分离的抗体，或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含:(a)SEQ ID NO: 29 所示的 H-CDRl ；(b)SEQID NO:30 所示的 H-CDR2 ；(c)SEQID NO:31 所示的 H-CDR3 ；(d)SEQID NO:34 所示的 L-CDRl ；(e)SEQID NO:35 所示的 L-CDR2 ;和(f)SEQ ID NO:36 所示的 L-CDR3。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含SEQIDNO:43所示的Vh区氨基酸序列。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含SEQIDNO:45所示的\区氨基酸序列。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQID NO:43所示的Vh区氨基酸序列和SEQ ID NO:45所示的Vl区氨基酸序列。
5.分离的抗体，其中所述抗体包含SEQID N0:44所示的重链氨基酸序列,及还包含SEQID NO: 46所示的轻链氨基酸序列，条件是SEQ IDNO: 44的C-末端赖氨酸残基任选被缺失。
6.权利要求1-5任一项的分离的抗体，其是IgG2。
7.药物组合物，其包含权利要求1-6的抗体、或抗原结合部分，以及药物可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了结合人4-1BB的分离的结合分子，编码所述结合分子氨基酸序列的核酸分子，包含所述核酸分子的载体，含有所述载体的宿主细胞，产生所述结合分子的方法，含有所述结合分子的药物组合物，以及使用所述结合分子或组合物的方法。
文档编号C07K16/28GK103221428SQ201180054004
公开日2013年7月24日 申请日期2011年8月26日 优先权日2010年9月9日
发明者B·阿伦斯, S·M.·巴克西, S·P·贝里奎斯特, R·杜瓦纳斯, R·L·迪菲尔德, M·W·埃利奥特, T·S·费舍尔, R·M·热罗姆, H·L·约内斯, C·坎珀施罗尔, K·拉德切纪-贝斯, V·A·勒弗, T·L·奥利芬特, A·O·厄纳迪普, W·秦, V·拉达克里希南, A·K·罗纳, L·L·夏普, M·特萨, K·E·托马斯, L·A·耶茨, D·M·齐格迈尔, M·祖利 申请人:辉瑞公司