专利名称：梅花鹿igf-1多肽及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体说是梅花鹿IGF-I多肽及其制备方法。
背景技术：
鹿茸是鹿的第二性征，是在鹿额骨部长出的骨质性组织。由于每年周期性地生长，它的生长发育可能受特殊的分子机理调控。即鹿茸的独特之处就在于它的每年更新， 这在哺乳动物中绝无仅有，因而其成为理想的研究组织器官再生的生物模型。鹿茸生长速度之快也是其它任何哺乳动物组织无法比拟的，可达每天l-2cm。因此人们推测其中可能存在特殊的促进骨组织生长的活性物质，能刺激鹿茸的快速生长。胰岛素样生长因子 (insulin-like growthfactor, IGF)是一种多功能细胞增殖调控因子，因其化学结构与胰岛素原类似而得名。其中IGF-I是由70个氨基酸残基组成，具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链多肽，血液中的IGF-I主要由肝细胞合成和释放。IGF-I在细胞正常生长、胚胎发育、神经生长及能量代谢的方面起着十分重要的作用，其中比较明确的生物学效应主要有两大类，即促进有丝分裂作用和类胰岛素作用。IGF-I是动物生长轴的中心环节，在动物生长调控中起重要作用。Suttie等的研究发现IGF-I与鹿茸的生长率高度相关，生长因子在生茸期鹿血浆中升高，这意味着IGF-I很可能刺激鹿茸生长。Elliott等研究表明，在鹿茸的顶部有大量IGF-I受体，进一步间接证明IGF-I参与了鹿茸生长发育调节的可能性。目前，已从人和许多动物体组织中分离得到IGF-1，如在人、猪、鸡上关于IGF-I促进生长的研究较多。但是，类似东北梅花鹿IGF-I成熟肽的表达与活性研究在国内外比较少。目前，人IGF-l(hlGF-l)在临床上已用于治疗糖尿病、胰岛素抵综合征、侏儒症及神经系统疾病等多种疾病，并取得了良好的效果。国内外已有通过哺乳动物细胞及大肠杆菌表达获得hIGF-Ι的报道，但存在表达量较低和纯化较困难等问题。本发明人根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGFl基因特异引物并克隆 IGFl基因，将梅花鹿IGFl基因DNA序列已递交GenBank，并利用相对荧光定量Real-time PCR法检测IGFl在鹿茸顶端不同部位组织的转录表达丰度。成功获得了梅花鹿鹿茸组织 IGFI基因全长编码区cDNA (GenBank登录号为HQ890468)，该基因长465bp，编码154aa长度的多肽，与马鹿、牛、羊、马、猪、人和小鼠IGFl基因进行同源性分析显示，IGFl基因与马鹿、牛和羊同源性最高，核苷酸序列分别为99. 78%,98. 28%和97. 85% ;氨基酸序列分别为99. 35 %、98· 05%和97. 40 %。相对荧光定量PCR差异分析发现，IGFl基因在鹿茸顶端不同部位组织均有表达。其中，在前软骨和软骨组织的表达水平明显高于真皮和间充质组织(见《东北林业大学学报》2011第39卷第11期，梅花鹿IGFl全长cDNA克隆及在鹿茸组织的表达)。pET系列载体是目前原核表达中，应用较为广泛的表达系统。pET系列载体中连有 T7噬菌体转录系统，其mRNA的合成速度是大肠杆菌的5倍，进而实现目的蛋白的高效表达。 其中，pET-32a载体含有一个硫氧还蛋白的碱基序列，连接目的片段后，以融合蛋白的方式与目的蛋白一同表达，不但可以促进目的蛋白二硫键的形成，使目的蛋白恢复正确的三维结构，而且还可以保护目的蛋白免受大肠杆菌细胞内蛋白酶的降解。此外，该载体中还含有组氨酸标签，能够特异地与钴或镍等金属离子结合，提高蛋白纯化效率。尽管pET_32a表达产物中含有肠激酶和凝血酶的特异切割位点，但是酶试剂价格昂贵，不利于工业化生产，而且切割后目的蛋白上游会带有十几个到几十个额外的氨基酸序列，对于小分子量蛋白的复性影响很大，直接影响蛋白活性。
发明内容
本发明的目的是，提供一种梅花鹿IGF-I成熟肽的基因、成熟肽及其梅花IGF-I成熟肽制备方法。梅花鹿IGF-I成熟肽的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示；梅花鹿IGF-I成熟肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。梅花IGF-I成熟肽的制备方法，该方法包括I)用引物PI:TTCGAATTCAACGGACCCGAGACCCTCTGP2 CGCAAGCTTCTAGGCCGCCTTGGTGG ；提取梅花鹿鹿茸组织的总RNA，反转录成双链cDNA，为模板扩增；2)扩增产物插入表达载体pET_32a中，获得表达载体pET-32a-IGF_l，将其转染大肠杆菌Rosetta感受态细胞中；IPTG诱导表达；收集纯化融合蛋白；3)用羟胺裂解液裂解融合蛋白，蛋白复性液复性，去杂，得梅花IGF-I成熟肽；所述的IPTG诱导表达为浓度为O. 6mmol/L的IPTG诱导，表达4小时；所述的羟胺裂解液为2mol/L 羟胺，200mmol/L CHES，8mol/L 尿素，pH9. 5 ；所述的蛋白复性液为O. 5mmol/L NaCl, Immol /T, EDTA, 20mmol/L Tris-HCl, I % Gly,lmmol/LGSH,3mmol/L GSSG, pH 8.0。本发明提供了一种梅花鹿IGF-I成熟肽的基因，并在上游引物5端添加EcoRI酶切位点和编码Asn的碱基序列，下游引物5’端添加Hind III酶切位点和终止密码子序列， 克隆了表达梅花鹿IGF-I成熟肽的碱基序列234bp基因，构建了表达载体pET-32a-IGF-l， 在大肠杆菌Rosetta中诱导表达，获得了梅花鹿IGF-I成熟肽。引入EcoRI、Hind III酶切位点，利用梅花鹿IGF-I第一个氨基酸为Gly的特点，在天然的IGF-I前面添加一个Asn，形成一个羟胺的特异裂解部位(Asn-Gly肽键)，降低了蛋白切割成本，减少额外氨基酸序列对蛋白复性的影响，保持蛋白在天然条件下的状态；采用pET-32a作表达载体在大肠杆菌 Rosetta中表达，蛋白含量可达菌体可溶蛋白的50%以上，通过MTT法检测显示，随着IGF-I 浓度的增加，NIH3T3细胞增殖速度呈递增趋势，在Ong/ml 200ng/ml之间呈现浓度依赖性，通过流式细胞仪对细胞周期分析发现，与未经IGF-I处理的细胞比较，Gtl期和G1期细胞数有所减少，S期细胞数有所增加，证明梅花鹿IGF-I对鹿茸的快速生长具有重要的作用， IGFl与鹿茸的再生存在密切的关系。
图I 为 IGF-I 基因 PCR 扩增产物的检测，I. DNA Marker (DL2000) ;2，3. PCR 产物。图2pET32a-IGF-l 表达产物的 SDS-PAGE 电泳分析，1-6.分别为 O. 1,0. 2,0. 4,O. 6,0. 8,1.0mmol/L IPTG诱导的表达产物；7.未诱导的pET32a_IGF_l ；8.蛋白质相对分子
量标准。图3pET32a-IGF_l裂解及纯化产物的SDS-PAGE电泳分析，I.蛋白质相对分子量标准；2.羟胺裂解产物；3.纯化产物。图4IGF-1处理48h后NIH3T3细胞周期变化分析。图5未经IGF-I处理的NIH3T3细胞周期变化分析。
具体实施例方式实施例I梅花鹿IGF-I成熟肽基因的克隆提取梅花鹿(来自吉林农业大学试验鹿场)鹿茸组织的总RNA，反转录成双链 cDNA,根据GenBank数据库中梅花鹿IGF-I基因序列(登录号HQ890468)，设计IGF-I成熟肽引物。上游引物TTCGAATTCAACGGACCCGAGACCCTCTG,在5端添加EcoRI酶切位点和编码Asn的碱基序列；下游引物CGCAAGCTTCTAGGCCGCCTTGGTGG,在5端添加Hind III酶切位点和终止密码子序列；以梅花鹿鹿茸组织的cDNA为模板进行PCR扩增；PCR反应条件为 94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将回收片段连接到pMD_18T载体上，转入大肠杆菌DH5a中，涂板并于37°C培养。挑取转化菌落，接种于LB液体培养基，37°C振荡培养过夜，采用碱裂解法小量提取质粒并将鉴定正确的重组质粒送TaKaRa公司测序。IGF-I成熟肽基因PCR扩增产物经电泳得到234bp左右的一条特异条带，与预期结果相符(图I)。提取重组质粒，用EcoRI和Hind III双酶切质粒pMD-18T-IGF_l，可获得与目的带大小相符的电泳条带234bp，表明克隆成功。经BLAST分析显示，IGF-I成熟肽基因测序正确。实施例2重组表达载体的构建与鉴定用EcoRI和Hind III双酶切pET_32a载体和测序正确的pMD_IGF_I质粒，分别回收后，用T4DNA连接酶于16°C连接过夜，获得重组质粒，将其转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞中后涂布于LB平板，37°C培养过夜。挑选阳性克隆进行双酶切鉴定，鉴定正确后送 TaKaRa公司测序，测序正确的克隆命名为pET-32a-IGF_l。用EcoR I和Hind III双酶切原核表达载体pET-32a_IGF_l，获得大小约为234bp 特异性条带，与预期大小一致。结果显示，梅花鹿IGF-I基因成功插入pET-32a载体，原核表达载体pET32a-IGF-l构建成功。实施例2重组子的诱导表达及融合蛋白的纯化将鉴定正确的pET-32a-IGF_l重组子接种于LB培养基中，37°C培养至0D600为 O. 4 O. 6 后，37°C下用不同 IPTG 浓度(终浓度分别为 O. I、O. 2、O. 4、O. 6、O. 8、I. OmmoI/L) 进行诱导表达,4h后收集菌液，进行SDS-PAGE电泳检测，未诱导的重组Rosetta为对照，确定最佳IPTG浓度。将重组表达菌接种于LB培养基中，37°C振荡培养至0D600为O. 4 O. 6后，用确定的最佳浓度IPTG诱导4h。12000g、4°C离心lmin，收集菌体，加入适量的细菌裂解液，超声波破碎 2min,沉淀用 Tris-HCl (20mmol/L)，咪唑(IOmmoI/L)，NaCl (O. 5mol/L)溶液冲洗2次，12000g离心20min后所得沉淀即为包涵体。将包涵体溶于Tris-HCl (20mmol/L)，尿素(8mol/L)，咪唑(5mmol/L)，NaCl (O. 5mol/L)溶液，于冰水浴中溶解包涵体lh，IOOOOg 离心20min,取上清液用O. 45 μ m滤膜过滤。再经平衡后的Ni-Agarose柱亲和层析后,用 Tris-HCl (20mmol/L)，尿素(8mol/L)，咪唑(O. 5mol/L)，NaCl (O. 5mol/L)溶液洗脱，根据 280nm紫外吸收值收集洗脱峰。用pET32a_IGF_l质粒转化大肠杆菌Rosetta表达菌株,诱导表达后经SDS-PAGE 电泳检测结果显示，在约28kDa处有特异蛋白带出现，与预测融合蛋白分子质量大小相符 (图2);同时当IPTG终浓度为O. 6mmol/L时，蛋白表达量最高。重组蛋白纯化后SDS-PAGE 电泳检测显示，在约28kDa处有I条蛋白条带，与融合蛋白pET32a-IGF-l分子质量一致，目标蛋白含量均可达到菌体可溶蛋白的50 %以上，且纯度较高。Western blotting 杂交分析将待检测样品SDS-PAGE电泳后，60V、0. 5h电转移至PVDF膜上，以5%的脱脂奶粉进行封闭2h。TBST洗涤干净后，使用兔抗人IGF-I —抗(I 200稀释)，37°C孕育I. 5h， TBST洗涤3次；HRP标记的羊抗兔IgG为二抗(I 500稀释)，37°C孕育lh，最后用TBST 洗漆干净，DAB显色后分析结果。Western blotting检测结果,在约28kDa处可检测到特异蛋白条带，与表达结果相符，说明表达的融合蛋白序列正确且具有IGF-I的抗原活性。实施例3融合蛋白的切割、纯化与蛋白复性用羟胺裂解液(2mol/L羟胺，200mmol/LCHES，8mol/L尿素，pH9. 5)将上述获得的融合蛋白稀释到浓度为I. 0mg/ml，45°C反应5h以裂解融合蛋白。用HCl将溶液调节至 pH8. O终止反应,再经Ni-Agarose柱亲和层析后,根据280nm紫外吸收值收集流出液。将收集的流出液缓慢加入到复性液(O. 5mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA, 20mmol/L Tris-HCI, I % Gly, lmmol/L GSH,3mmol/L GSSG, pH 8.0)中，使重组蛋白浓度为 0. 15mg/ml，4°C复性 12h 后透析，去除其它杂质。羟胺裂解液切割后的重组蛋白pET32a-IGF-l经SDS-PAGE电泳显示在约7. 5kDa处可检测到特异蛋白条带；重新经亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测显示，纯化产物在约7. 5kDa处有I条蛋白带，与表达结果相符，纯度近100% (图3)。实施例4重组蛋白的生物学活性检测用含10%小牛血清的DMEM培养基培养复苏后的NIH3T3细胞，待生长到80%后， 传于6孔板中，继续培养24h。用含2%小牛血清的DMEM培养基饥饿培养NIH3T3细胞24h 后，加入IGF-I重组蛋白，使其终浓度分别为0、100、200、400ng/ml。继续培养24h，48h，72h 后，MTT法检测细胞的增殖情况。根据MTT结果选择重组蛋白最佳作用时间和浓度，利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。经MTT法检测分析显示加入不同浓度IGF-I后，NIH3T3细胞增殖速度有所增加。 且随着IGF-I浓度的递增，增殖程度越明显(表I)。流式细胞仪检测细胞周期结果表明 IGF-I (浓度为200ng/ml)处理NIH3T3细胞48h后，与未经IGF-I处理的对照组比较，G1和 Gtl期细胞百分比由76. O %减少至45. 4% (P < O. 05)，而S期细胞百分比由16. 1%增加至 31. 9% (P < O. 05)(图 4 和图 5)。表IMTT法检测IGF-I对NIH3T3细胞增殖的影响Tablel The influence of cell proliferation by IGF-1Ong/mllOOng/ml增殖率200ng/ml增殖率400ng/ml增殖率24h0 25±0 0I3O 278±0 025*11 0%0 299±0 019**19 6%0 301±0 017**19 8%48hO 387+0 022041710013*7 6%0 439+0 017**13 2%0 445±0 018**14 7%72h0 431±0 0250 454±0 012*5 4%0 46710 018*8 3%O 469±0 020*8 9%注*P < O 05，**P <001。
权利要求
1.梅花鹿IGF-I成熟肽的基因，其核苷酸序列如序列表SEQID NO. I所示。
2.梅花鹿IGF-I成熟肽，其氨基酸序列如序列表SEQID NO. 2所示。
3.梅花IGF-I成熟肽的制备方法，该方法包括1)用引物PITTCGAATTCAACGGACCCGAGACCCTCTG P2 CGCAAGCTTCTAGGCCGCCTTGGTGG ；以梅花鹿鹿茸组织的总RNA，反转录成双链cDNA，为模板扩增；2)扩增产物插入表达载体pET-32a中，获得表达载体pET-32a-IGF_l，将其转染大肠杆菌Rosetta感受态细胞中；IPTG诱导表达；收集纯化融合蛋白；3)用羟胺裂解液裂解融合蛋白，蛋白复性液复性，去杂，得梅花IGF-I成熟肽。
4.根据权利要求3所述的梅花IGF-I成熟肽的制备方法，其特征在于所述的IPTG诱导表达为浓度为O. 6mmol/L的IPTG诱导，表达4小时。
5.根据权利要求4所述的梅花IGF-I成熟肽的制备方法，其特征在于所述的羟胺裂解液为 2mol/L 羟胺，200mmol/L CHES，8mol/L 尿素，pH9. 5。
6.根据权利要求3、4或5所述的梅花IGF-I成熟肽的制备方法，其特征在于所述的蛋白复性液为 O. 5mmol/L NaCKlmmol/L EDTA、20mmol/L Tris_HCl、l% Gly、lmmol/L GSH、 3mmol/L GSSG、pH 8. 0o
全文摘要
本发明公开了一种梅花鹿IGF-1成熟肽的基因，并在上游引物5端添加EcoR I酶切位点和编码Asn的碱基序列，下游引物5端添加Hind III酶切位点和终止密码子序列，克隆了表达梅花鹿IGF-1成熟肽的碱基序列234bp基因，构建了表达载体pET-32a-IGF-1，在大肠杆菌Rosetta中诱导表达，获得了梅花鹿IGF-1成熟肽。引入EcoR I、Hind III酶切位点，在天然的IGF-1前面添加一个Asn，形成一个羟胺的特异裂解部位，降低了蛋白切割成本，减少额外氨基酸序列对蛋白复性的影响，保持蛋白在天然条件下的状态；采用pET-32a作表达载体在大肠杆菌Rosetta中表达，蛋白含量可达菌体可溶蛋白的50％以上，通过MTT法检测，能提高NIH3T3细胞增殖速度。
文档编号C07K14/475GK102586257SQ20121001800
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者刘宁, 孟星宇, 李婷, 李沐, 李雨婷, 王健, 田玉华, 胡薇, 胡锐 申请人:吉林农业大学