专利名称：一种胸腺素α1及其类似物的制备方法
技术领域：
本发明属于多肽固相合成及纯化技术领域,具体而言,涉及到Tricyclic amidelinker resin树脂和C端为Asn的多肽，尤其是胸腺素α I及其类似物的固相合成工艺。
背景技术：
胸腺素a I (Thymosin alphal，T α I)是从胸腺素组分5 (TF5)中分离纯化出的，由28个氨基酸残基组成的酸性多肽，不含蛋氨酸、半胱氨酸和芳香族氨基酸，相对分子质量为3108，pi值为4.2，N末端乙酰化但其对活性影响不显著，其序列为Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1Ie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
胸腺素α I是由胸腺分泌的免疫功能较强的小分子多肽，在体内外试验中，胸腺素α I对细胞因子的分泌、淋巴细胞表面标志及淋巴细胞功能均有影响，在机体免疫应答过程中起着重要的作用，被认为是生物反应调节物，临床上亦已广泛应用于乙型肝炎、丙型肝炎、肿瘤以及免疫功能低下等疾病的治疗。采用化学方法合成的N-乙酰化胸腺素α I已经上市，是1997年由意大利赛生(Sciclone)公司开发的，商品名为“日达仙”，用于治疗病毒性肝炎等，疗效显著。在固相合成法中，2008年I月16日公布的中国专利(CN101104638A)公开了一种固相合成胸腺素α I的工艺，它以Fmoc-Rink Amide MBHA树脂为载体，利用Asp侧链羧基与树脂氨基相连接从而使切割后形成Asn的方法；2008年4月23日公布的中国专利(CN101166761A)公开了以PEG树脂固相合成胸腺素及其类似物的方法；2009年7月5日，BCN肽类股份有限公司的专利申请CN101484467A公开了以假脯氨酸二肽的形式固相合成的胸腺素；在“化学学报”2004年第55卷第2期胸腺素α I的DIC固相化学合成与鉴定’中提到，以Wang树脂为起始载体，通过活化试剂DIC+HOBt将Fmoc-Asn (Trt) -OH与树脂相连接。除了化学合成法，还可以采用生物合成技术，在2010年6月16号公布的中国发明专利(CN101736008A)公开了一种基因工程制备N-乙酰化胸腺素α I的方法。综合参考国内外关于胸腺素α I制备专利以及相关的合成报道文献，发现其在技术上主要存在固相合成收率低，纯度低等缺点，从而不能用于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高收率且有利于实现产业化的胸腺素α I及类似物的制备工艺。为实现上述目的，本发明采取如下技术方案:一种制备胸腺素α I及类似物的固相合成及纯化方法，包括如下步骤:I)以Tricyclic amide linker resin树脂为载体,将该树脂脱去Fmoc保护基；2)用偶联剂将Fmoc-Asp-Y的侧链羧基与上述脱保护的Tricyclic amide linkerresin树脂的氨基连接,并用乙酰化试剂优选Ac2O和DIPEA进行封闭处理,其中Fmoc-Asp-Y中的Y为羧基保护基；3)将步骤2)中所得产物脱Fmoc保护后，加入Fmoc-AA-Y形式的氨基酸和偶联剂进行反应，其中Fmoc-AA-Y中的AA为氨基酸；4)根据目标合成序列重复进行步骤3)以依次偶联氨基酸；5)将步骤4)中所得产物用乙酰化试剂优选Ac2O和DIPEA进行乙酰化处理；6)将步骤5)中所得产物用裂解试剂进行切割得到粗肽；7)用沉淀剂优选乙醚沉淀步骤6)中所得粗肽；8)用HPLC制备分离粗肽得到纯品。在一个实施方案中，步骤I)中所述Fmoc保护基是通过20%哌啶/80% DMF或者2%哌啶/2% DBU/96% DMF处理来除去。在另一个实施方案中，步骤2)中所述羧基保护基Y为OtBu、ODmab或者OAlI。在另一个实施方案中，步骤2)中所述的偶联剂为DIC+A或B+A+有机碱，其中A为HOBt,HOAt 或者 Cl-HOBt ；B 为 HBTU、HATU、HCTU 或者 PyBOP ;有机碱为 NMM、DIPEA 或者 TMP。步骤2)中乙酰化过程为以10 % Ac2O和10 % DIPEA的DMF溶液在室温下反应。在另一个实施方案中，步骤3)中所述Fmoc-AA-Y形式的氨基酸衍生物选自 Fmoc-Asp-Y,其中 Y 为 OtBu、ODmab 或者 OAll ;Fmoc_Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr (tBu) -0H> Fmoc-1le-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
·
在另一个实施方案中，步骤6)中裂解试剂以TFA为主要组分并含有适合的捕获齐 ，裂解切割在室温下反应，用乙醚沉淀粗肽。优选地，所述捕获剂选自水，三甲基硅烷和1，2-乙_■硫醇。在另一个实施方案中，所述偶联和脱保护过程中每一步都经过Kaiser Test检测。在另一个实施方案中，其中所述HPLC为制备型RP-HPLC。与已有的胸腺素α I合成方法相比，本发明胸腺素α I的制备工艺具有以下优
占-
^ \\\.
1.米用了 Ramage，Tricyclic amide linker 类型树脂,(Lit.R.Ramage et al.,Tetrahedron Lett.34,6599,1993)，附图1 为 Ramage，Tricyclic amide linker 结构以及几种此类型的树脂。该树脂的linker中含有二苯并环庚烯结构，非常适合用于以Fmoc策略(E.ATHERTON,R.C.SHEPPARD,Sold Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach.1RL Press, Oxford, 1989)制备酰胺肽末端，尤其是C末端为Phe，Tyr和lie时。切割时采用50% TFA的二氯甲烷或95% TFA均可，适当加入捕获剂。实验证明，利用此类树脂为载体的固相合成工艺，可以有效减少固相合成工艺过程中偶联的困难度，同时增加粗肽收率及纯度。2.采取了侧链锚定策略，以Fmoc-Asp-Y为C末端氨基酸代替Asn末端氨基酸，利用Asp侧链羧基与氨基功能树脂相连有很多优点:(I)把第一个氨基酸通过形成酰胺键的方式连接到树脂上有很高的收率，同时使用的激活剂也可以和以后形成肽键所用的试剂相同。此外，把Asn衍生物连接到Wang树脂上存在着收率低，消旋风险高，如果侧链不保护还有形成β -氰基丙氨酸的可能；(2)侧链锚定策略只涉及到t-Bu等类型的保护基(t-Bu酯可以保护第一个残基的α -羧基，Asp和Asn的ω -羧基以及Ser和Thr的侧链羟基)，这样最后的切割时仅使用简单的捕获剂如H2O即可。然而,如果使用Asn衍生物如Trt、Xan或Tmob等就需要额外的捕获剂；(3)在肽主链中少了一个酰胺键，从而减少了氢键的形成以及分子内肽链聚集的可能；(4)可以改变肽链在树脂上的空间位置，使肽链更具灵活性，从而有利于后面的氨基酸顺利连接。本发明采用Asp的侧链羧基与Tricyclic amide linker resin树脂相连可以使收率大幅度的提高，降低了生产成本，有利于实现规模化、产业化生产。
图1为Ramage’ Tricyclic amide linker结构以及几种此类型的树脂。图2是本发明总的工艺流程图。图3为胸腺素α I粗肽、纯品HPLC图谱，以及质谱图。图4为利用Rink amide MBHA resin合成的胸腺素α I粗肽及纯品图谱，以及质谱图。图5为胸腺素α I类似物粗肽、纯品HPLC图谱，以及质谱图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明:说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列如表I所示: 表I缩略词表
权利要求
1.一种胸腺素α I及其类似物的固相合成及纯化方法，包括以下步骤: 1)以Tricyclicamide linker resin树脂为载体,将该树脂脱去Fmoc保护基； 2)用偶联剂将Fmoc-Asp-Y的侧链羧基与上述脱保护的Tricyclicamide linkerresin树脂的氨基连接,并用乙酰化试剂优选Ac2O和DIPEA进行封闭处理,其中Fmoc-Asp-Y中的Y为羧基保护基； 3)将步骤2)中所得产物脱Fmoc保护后，加入Fmoc-AA-Y形式的氨基酸和偶联剂进行反应,其中Fmoc-AA-Y中的AA为氨基酸； 4)根据目标合成序列重复进行步骤3)以依次偶联氨基酸； 5)将步骤4)中所得产物用乙酰化试剂优选Ac2O和DIPEA进行乙酰化处理； 6)将步骤5)中所得产物用裂解试剂进行切割得到粗肽； 7)用沉淀剂优选乙醚沉淀步骤6)中所得粗肽； 8)用HPLC制备分离粗肽得到纯品。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)中所述Fmoc保护基是通过20%哌啶/80% DMF或者2%哌啶11% DBU/96% DMF处理来除去。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述羧基保护基Y为OtBiuODmab或者OAlI。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述的偶联剂为DIC+A或B+A+有机碱，其中 A 为 H0Bt、H0At 或者 Cl-HOBt ；B 为 HBTU、HATU、HCTU 或者 PyBOP ;有机碱为 NMM、DIPEA 或者 TMP。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)中乙酰化过程为以10%Ac2O和10%DIPEA的DMF溶液在室温下反应。
6.权利要求1所 述的方法，其特征在于:步骤3)中所述Fmoc-AA-Y形式的氨基酸衍生物选自 Fmoc-Asp-Y,其中 Y 为 OtBu、ODmab 或者 OAll ;Fmoc_Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤6)裂解试剂以TFA为主要组分并含有适合的捕获剂，裂解切割在室温下反应，用乙醚沉淀粗肽。
8.权利要求7所述的方法，其中所述捕获剂选自水，三甲基硅烷和1，2_乙二硫醇。
9.权利要求1所述的方法，其特征在于:所述偶联和脱保护过程中每一步都经过Kaiser Test 检测。
10.权利要求1所述的方法，其中所述HPLC为制备型RP-HPLC。
全文摘要
本发明公开一种胸腺素α1及其类似物的固相合成及纯化工艺，适用于工业化生产，属于多肽合成技术领域。工艺包括以下几个步骤1)以Tricyclic amide linker resin树脂为载体；2)将该树脂脱Fmoc保护后，将Fmoc-Asp-Y的侧链羧基与树脂氨基连接；3)采用Fmoc策略依次固相合成剩余氨基酸；4)去掉N末端氨基酸Fmoc保护基后用Ac2O，DIPEA的DMF溶液乙酰化N末端氨基；5)采用裂解试剂切割得到粗肽并用乙醚沉淀粗肽；6)粗肽经HPLC制备分离得到纯品。
文档编号C07K14/575GK103242443SQ20121002536
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者王丽凤, 殷玉和, 李纪龙, 代丽萍 申请人:长春百克生物科技股份公司