专利名称：百日咳杆菌69kd外膜蛋白的纯化方法
技术领域：
本发明属于蛋白分离纯化领域，涉及一种膜蛋白的工业化大规模分离纯化，具体是百日咳杆菌的69KD外膜蛋白的工业化大规模分离纯化方法。
背景技术：
百日咳是由百日咳杆菌引起的一种儿童急性呼吸道传染病，典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续数月。最严重的并发症是继发感染，癫痫发作，脑病和死亡。百日咳杆菌为革兰氏阴性球杆菌，长O. 5 I. 5 μ m,宽O. 2 O. 5 μ m,多单个分散，培养早期或者培养不适宜可呈链状或者多形态状。新分离的菌有荚膜，无芽孢，I相菌有菌毛。在包姜培养基表面上生长，菌落突起，边缘整齐，半透明，有光泽，色灰白，外观似珍珠状，菌落周围有明显的溶血环(医学生物制品学第二版赵凯章以浩李河民人民卫生出版社)。百日咳杆菌主要感染对象多为6岁以下儿童，I岁以内婴幼儿发病率约占总发病率的50%，未获得免疫力的成年人也可被感染。百日咳在发病初期传染力最强，但不易诊断，所以不易控制传染源，切断传播途径，因此只有预防接种百日咳疫苗，减少易感人群，才能达到控制和消灭百日咳的目的。目前百日咳疫苗主要有WPV和APV，WPV是以百日咳鲍特氏全菌体灭活而成，在使用初期有效的控制了疾病的发展，我国从1978年开始实施WPV计划免疫，到1997年DTP(百白破联合疫苗)覆盖率达到96%，百日咳发病率已经由1978年开展计划免疫前的250. 96/10万，下降到1999年的1/10万以下，下降了 99.6% (中国免疫预防事业的成就与展望王克安中华流行病学杂志1990，20 :325 327)。20世纪30年代 Medson等制成WPV以来，经过不断的改进，至今世界各国已经使用近70年，预防效果是肯定的。但是疫苗接种后会产生一定的副反应，个别人还可能产生较严重的脑神经症状甚至死亡，受到人们的抵制，一些国家甚至停止使用，导致百日咳发病率有上升的趋势。因此需要研制新的有较小副反应的百日咳疫苗。APV去除了大部分的有害物质，只含有一些有效的抗原成分，能够达到相似的免疫效果，但大大的降低了副反应的产生，使一些停止使用DTP的国家自大量使用DTaP之后，有效的降低了百日咳的发病率和死亡率。日本是最先研制出APV的国家，以后美国、中国和其他国家也都有了 APV产品，由于对有效保护抗原的认识不同，加上制备方法不同，因而APV中所含成分种类、含量及对其质量要求也有很大的差别。APV的生产方式有两种共纯化生产方式和分别纯化并按一定比例混合的方式。共纯化生产方式是将百日咳杆菌的各种有效抗原一起纯化出来，并不能对各个组分精确定量。欧美国家已经普遍使用了分别纯化各组分，并按一定比例混合的方式。现阶段我国无细胞百日咳疫苗的生产采用硫酸铵沉淀加蔗糖密度梯度离心的共纯化方式。将培养物上清或者全培养物，以33重量％硫酸铵和50重量％硫酸铵分两段盐析或者两段33重量％硫酸铵盐析。将盐析沉淀物用O. 5 I. OmoI/L NaCl和缓冲液(pH8. O)抽提百日咳菌主要保护性抗原PT和FHA部分(可能含有少量PRN和Agg)。这种纯化方式简便快捷，但不能对无细胞百日咳疫苗的各组分抗原精确定量。为了进一步提高疫苗的质量， 开发分别纯化各种抗原成分，然后按比例混合的百日咳组分疫苗将成为必然，因此摸索适合规模化生产各种有效抗原成分的制备方法是生产组份百日咳疫苗必不可少的步骤。百日咳杆菌抗原物质主要有百日咳毒素(PT)，丝状血凝素(FHA)，69KDa外膜蛋白 (PRN)，凝集原(Agg)，腺苷酸环化酶(AC)，脂多糖内毒素(LPS)，气管细胞毒素(TCT)和不耐热毒素(HLT)等，其中的PT，FHA，Agg，PRN可以作为组分百日咳疫苗的抗原成分。PRN是所有有毒力的百日咳杆菌产生的一种非纤毛性凝集原，存在于菌体外膜上，属于自主转运蛋白。它能产生保护水平的抗体，已经成为百日咳组分疫苗的重要抗原成分。本方法即为适合PRN的规模化生产的方法。康诺特实验室有限公司的公开号为CN1193324的专利申请公开了用下述方法纯化69KD外膜蛋白①发酵培养的菌液中加硫柳汞灭活细菌将灭活的细菌悬浮于含水介质如PBS中，加温45°C 60°C，接着冷却至室温或者4°C如此重复进行提取；③经沉淀作用和过Affi-gel Blue柱收集含PRN的溶液，用高浓度的盐，例如O. 5mol/L氯化镁洗脱；④透析后，将其通过层析聚焦载体。此方法要经过两次层析柱，操作复杂，并且增加了成本，不太实用于大规模生产。日本武田药品工业株式会社公开号为CN1147259的专利申请公开了用下述方法纯化69KD外膜蛋白①发酵培养的百日咳菌液离心获得菌体；②将菌体分散在十分之一体积(相对于培养液量)的含有lmol/L氯化钠的O. 05mol/L磷酸盐缓冲液中；③在60°C的温水中加热90分钟，离心获得上清；④向上清液中加入lmol/L磷酸盐缓冲液，至最终浓度为O. lmol/L，之后加入醋酸钙溶液至最终浓度为I. 6w/V%，室温搅拌I小时；⑤过滤该磷酸钙凝胶溶液，收集滤液和凝胶层。浓缩所得的滤液并使用超滤膜脱盐至电导为200欧姆； 通过一个磺丙基阳离子层析柱，收集洗脱液得到含有PRN的溶液。该方法需要使用电导脱盐，产量小，不适合大规模工业化生产。W091/15505通过层析和超滤，或通过尿素提取、离心，或通过离子交换和凝胶过滤树脂并超滤进行69KD外膜蛋白的提纯。该方法采用的超滤步骤成本高，并且引入尿素，不利于后续天然构象蛋白的获得。US005276142提供了适合商业化纯化69KD外膜蛋白的反复多次提取、然后通过染料配体层析、最后进行色谱聚焦的方法。该方法获得蛋白纯度较高，但步骤繁琐，耗时长，不适合工业化生产。US005101014纯化69KD外膜蛋白的方法包括将菌体热灭活、透析、DEAE-Spharose 柱上以盐梯度洗脱、透析、Affi-Gel Blue柱层析并以4mol/L尿素洗脱。该方法透析步骤耗时长，需要使用特殊层析介质，并且尿素的引入不利于获得天然构象蛋白。上述方法步骤较多，需要使用成本较高的材料，耗时长，不利于获得天然构象的蛋白，不适合大规模工业化制备纯化69KD外膜蛋白。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，发明人经过大量研究，在常规蛋白纯化工艺的基础上发明了一种简单、快速、成本低的纯化69KD外膜蛋白的方法，适合于大规模工业化生产。本发明提供了一种提纯百日咳菌的69KD外膜蛋白的方法，上述方法包括以下步骤b.在含有所述69KD外膜蛋白的菌体裂解物上清中加入硫酸铵使硫酸铵浓度达到 15%重量/体积至25%重量/体积，静置I小时至8小时，离心，收集上清；c.在步骤b收集的上清中加入硫酸铵使硫酸铵浓度达到30%重量/体积至38% 重量/体积，静置I小时至8小时，离心，弃上清，收集沉淀；d.以Tris-HCl缓冲液溶解步骤c中收集的沉淀并透析除去硫酸铵；e.过DEAE sepharose离子交换柱,用线性梯度氯化钠浓度从Omol/L至lmol/L的缓冲液洗脱，收集目的蛋白。在本发明的方法中，步骤b中的硫酸铵浓度为20 % (重量/体积)。 在本发明的方法中，步骤c中的硫酸铵浓度为33 % (重量/体积)。在本发明的方法中，步骤e中的DEAE sepharose离子交换柱为 DEAEsepharoseCL-6B 离子交换柱。在本发明的方法中，步骤e中的洗脱缓冲液的pH为8. 5至9. 0，流速为0. 4ml/分钟至0. 6ml/分钟，所述69KD外膜蛋白的氯化钠洗脱浓度为0. 05mol/L至0. 12mol/L。在本发明的方法中，步骤e中的所述69KD外膜蛋白的氯化钠洗脱浓度为0. 07mol/ L0本发明的方法还包括步骤a a.将百日咳杆菌CS菌体用含lmol/L至2mol/L氯化钠的pH8. 8的缓冲液在40至 60°C浸提30分钟至3小时，离心，收集上清，得到含有所述69KD外膜蛋白的菌体裂解物上清。在本发明的方法中，步骤a中的氯化钠浓度为lmol/L。在本发明的方法中，步骤a中的浸提温度为40至60°C。在本发明的方法中，步骤a中的浸提时间为I小时至3小时。本发明通过将常规蛋白纯化工艺方法进行组合，通过大量研究发明了一种快速、 简便、成本低的纯化天然构象69KD外膜蛋白的方法，从而可用于大规模工业制备天然构象 69KD外膜蛋白，有利于高效地接种预防百日咳。
图I :粗提方法的选择，A :浸提，B :超声破碎，C :匀浆机破碎；D :分子量标准。图2 :浸提盐浓度的选择，A :标准品；B 2mol/L NaCl浸提；C lmol/L NaCl浸提； D 0. 5mol/L NaCl 浸提。图3 :浸提时间的选择，A :浸提I小时；B :浸提2小时；C :浸提3小时；D :标准品。图4 :浸提温度的选择，A :4°C浸提；B :37°C浸提；C :60°C浸提；D :分子量标准。图5 :硫酸铵分级沉淀的选择(具体见实施例)。图6AGB柱层析纯化，A D =PBS洗脱收集样品；E J =Tris-HCl缓冲液洗脱收集样品。图7优化前的DEAE-S印harose CL-6B的色谱图。
图8优化前的DEAE-S印harose CL-6B色谱各峰样品电泳结果。图9 :条件优化的 DEAE-Sepharose CL-6B 色谱图。图10 :DEAE_Sepharose CL-6B 柱层析结果。图11 :本发明方法纯化的目的蛋白的电泳图。图12 :通过蛋白质免疫印迹鉴定本发明方法纯化的PRN目的蛋白。图13-1至图13-9 :分别为通过质反应平行线法计算本发明方法纯化的PRN目的蛋白的保护效价的计算机截屏图(probit =概率单位)。
具体实施例方式本发明中部分技术术语缩写和中文全称如下无细胞百日咳疫苗APV全细胞百日咳疫苗WPV全细胞百白破联合疫苗=DTwP无细胞百白破联合疫苗=DTaP百日咳毒素PT丝状血凝素FHA 百日咳黏着素(69KD外膜蛋白)PRN凝集原Agg本发明的百日咳69KD外膜蛋白的纯化方法包括从发酵的百日咳杆菌中通过前期粗提及离子柱一步精提，即可以得到95重量％以上纯度的百日咳69KD外膜蛋白，此方法较为简便可行，是组份百日咳疫苗生产不可缺少的步骤。本发明人在现有的多种蛋白纯化方法基础上经过大量实验，对分离纯化条件进行优化，最终建立了本发明的百日咳69KD外膜蛋白的纯化方法，本发明方法纯度高、步骤简便、成本低，适合大规模工业化制备。所述方法包括粗提步骤和精提步骤，所述粗提步骤为硫酸铵两段分级沉淀；所述精提步骤为DEAE-Sepharose离子交换色谱，例如DEAE-Sepharose CL-6B离子交换色谱。其中，硫酸铵两段分级沉淀包括低浓度硫酸铵沉淀步骤和高浓度硫酸铵沉淀步骤。低浓度硫酸铵沉淀步骤中的硫酸铵浓度可以为15% (重量/体积)至25% (重量/体积)，优选为18 % (重量/体积)至22 % (重量/体积),最优选为20 % (重量/体积)。所述浓度范围的硫酸铵可以最大限度的沉淀杂质蛋白，硫酸铵浓度低于15% (重量/体积) 时，则杂蛋白较多，硫酸铵浓度高于25% (重量/体积)时，则目的蛋白会部分沉淀。低浓度硫酸铵沉淀步骤的进行时间为I至8小时，优选为2至6小时。高浓度硫酸铵沉淀步骤的硫酸铵浓度可以为30重量％ -38重量％，优选为33重量％。所述浓度范围的硫酸铵可以最大限度的沉淀目的蛋白，硫酸铵浓度低于30 %时，目的蛋白沉淀不完全，硫酸铵浓度高于38重量％时，会将更多的杂蛋白沉淀下来。高浓度硫酸铵沉淀步骤的进行时间为I至8小时，优选为2至6小时。DEAE-Sepharose离子交换色谱可以使用任何型号的DEAE-Sepharose离子交换树脂，优选使用DEAE-S印harose CL-6B离子交换树脂(美国GE公司)。DEAE-Sepharose离子交换色谱洗脱条件为pH8. O至9. 0，优选pH8. 8的洗脱缓冲液；洗脱缓冲液流速为O. 5ml/分钟至2ml/分钟，优选Iml/分钟。洗脱目的蛋白的缓冲液中 NaCl 浓度为 O. 07mol/L。当洗脱缓冲液的pH在所述范围内时，可以更好地将目的蛋白与杂蛋白分离。当洗脱缓冲液流速在所述范围内时，可以使目的蛋白与杂蛋白进一步有效分开。本领域技术人员可知，从发酵细胞中释放目的蛋白的已知方法有很多，这不是本发明的关键点。为了释放目的蛋白，可以采用本领域任何常规方法进行百日咳菌体的收集和破碎。从有利于后续提取的角度出发，本发明方法的从百日咳菌体中释放目的蛋白优选通过浓盐溶液浸提来破碎菌体，并在破碎后离心取上清。所述浓盐溶液优选为O. 5ml/分钟至2mol/L、更优选lmol/L的中性盐如氯化钠溶液。当所述浓盐溶液浓度小于O. 5mol/L时，则不能有效的浸提目的蛋白；当所述浓盐溶液浓度大于2mol/L时，则浪费原材料并且增加蛋白变性的风险。所述浸提温度可以为40至60°C，优选为50至60°C，最优选60°C。当浸提温度小于40°C时，不能有效的浸提目的蛋白；当浸提温度大于60°C时，增加目的蛋白变性的风险。所述浸提时间可以为30分钟以上，优选I至3小时，最优选I小时。浸提时间小于30分钟时，不能充分使目的蛋白释放；浸提时间大于3小时时，不能进一步提高目的蛋白的释放，并且耗费时间。本发明人还尝试了其他方法的粗提取、精提取和释放目的蛋白的方法(见下文实施例)，这些现有技术中均已知的方法对于本发明的目的蛋白效果并不好。因此，本发明人从大量现有的蛋白分离纯化方法中进行选择和条件优化，从而发明了本发明的百日咳69KD 外膜蛋白的纯化方法。通过本发明人建立的这种纯化方法，可以简单、低成本的大规模制备纯度高(95重量％以上)的百日咳69KD外膜蛋白。实施例I.菌体处理方法的选择及条件的优化I. I菌体的获得将CS菌株(CMCC58003，购自ATCC(美国典型微生物保藏中心))在IOL S-S培养基中培养至菌体浓度为220亿个/ml，在8000rpm离心10分钟获取菌体，用含O. 035mol/L氯化钠、lmmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、lmmoI/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的pH 8. 8的O. 025mol/ L的Tris-HCl缓冲液溶散菌体，获得O. 05g/ml的菌悬液，并分别按照以下方法处理。I. 2三种处理菌体的方式A.浓盐溶液浸提取上清将菌体在含O. 5mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液中悬浮， 并60°C水浴I小时，4°C，8500r/分钟离心10分钟，取上清。B.超声破碎取上清将菌悬液置于冰水浴中，超声破碎(12w)，每次破碎10s，间歇 IOs为一个周期，共10个周期。4°C，IOOOOr/分钟离心20分钟，取上清。C.匀浆机破碎取上清将菌悬液倒入匀浆机(丹麦APV2000，型号04010009)，调压力至IOOOBar,破碎两遍(每遍15s),4°C, IOOOOr/分钟离心20分钟,取上清。将三种方法处理的上清液进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，电泳结果见图 1，A泳道为浓盐浸提后得到的上清，B泳道为超声破碎仪破碎得到的上清，C泳道为匀浆机破碎得到的上清，D泳道为低分子量标准。图I中可以看出破碎和浸提均能获得含相当量的目的蛋白样品，但破碎所得样品的杂蛋白较多，目的蛋白没有明显增多，并且破碎较繁琐。 通过AlphaDigiDoc软件分析，三种上清液中的目的蛋白浓度分别为12. 5重量％、8重量％和9. 3重量％。从成本和效率综合考虑，选择浓盐溶液浸提的方法。并对该方法进行下述优化。
I.3浓盐溶液浸提取上清的条件优化将离心分离到的菌体等分，并分别用含O. 5mol/L、0. 75mol/L、lmol/L、I. 25mol/L、
I.5mol/L、2mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液溶解搅拌均匀，各分为三份分别放到4°C、37°C、 60°C中，连续3小时内每隔O. 5小时取样8500rpm离心检测上清(即，浓盐溶液浸提液)。将各样品上清进行SDS-PAGE，图2显示了各种浓度氯化钠在60°C浸提I小时获取的样品上清进行SDS-PAGE (图2仅示例性给出O. 5mol/L、lmol/L和2mol/L条件的样品)。 电泳结果表明lmol/L、I. 25mol/L、l. 5mol/L和2mol/L的各盐溶液浸提效果相差不大，但浸提的总蛋白含量都高于O. 5mol/L和O. 75mol/L盐溶液,浸提效果较好。如表I所不,通过条带扫描影像分析可知lmol/L至2mol/L的各盐溶液浸提到的蛋白溶液中目的蛋白比例相差不大。选择lmol/L的NaCl浓度做为浸提浓度。表I对各浓度氯化钠条带影像扫描分析，各个泳道中目的蛋白纯度
权利要求
1.一种提纯百日咳菌的69KD外膜蛋白的方法，所述方法包括以下步骤b.在含有所述69KD外膜蛋白的菌体裂解物上清中加入硫酸铵使硫酸铵浓度达到15% 重量/体积至25%重量/体积，静置I小时至8小时，离心，收集上清；c.在步骤b收集的上清中加入硫酸铵使硫酸铵浓度达到30%重量/体积至38%重量 /体积，静置I小时至8小时，离心，弃上清，收集沉淀；d.以Tris-HCl缓冲液溶解步骤c中收集的沉淀并透析除去硫酸铵；e.过DEAEsepharose离子交换柱,用线性梯度氯化钠浓度从Omol/L至lmol/L的缓冲液洗脱，收集目的蛋白。
2.如权利要求I所述的方法，其中，步骤b中的硫酸铵浓度为20%(重量/体积)。
3.如权利要求I所述的方法，其中，步骤c中的硫酸铵浓度为33%(重量/体积)。
4.如权利要求I至3中任一项所述的方法,其中，步骤e中的DEAEsepharose离子交换柱为DEAE sepharoseCL-6B离子交换柱。
5.如权利要求I至3中任一项所述的方法，其中，步骤e中的洗脱缓冲液的pH为8.5至9.0，流速为O. 4ml/分钟至O. 6ml/分钟，所述69KD外膜蛋白的氯化钠洗脱浓度为O. 05mol/ L 至 O. 12mol/L。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述69KD外膜蛋白的氯化钠洗脱浓度为O.07mol/L0
7.如权利要求I至3中任一项所述的方法，所述方法还包括步骤aa.将百日咳杆菌CS菌体用含lmol/L至2mol/L氯化钠的pH8. 8的缓冲液在40至60°C 浸提30分钟至3小时，离心，收集上清，得到含有所述69KD外膜蛋白的菌体裂解物上清。
8.如权利要求7所述的方法，其中，步骤a中的氯化钠浓度为lmol/L。
9.如权利要求7所述的方法，其中，步骤a中的浸提温度为40至60°C。
10.如权利要求7所述的方法，其中，步骤a中的浸提时间为I小时至3小时。
全文摘要
本发明属于蛋白分离纯化领域，涉及百日咳杆菌的69KD外膜蛋白的工业化大规模分离纯化方法。所述方法包括a.将百日咳杆菌CS菌体用含1mol/L至2mol/L氯化钠的pH8.8的缓冲液在40至60℃浸提30分钟至3小时，离心，收集上清，得到含有所述69KD外膜蛋白的菌体裂解物上清；b.在含有所述69KD外膜蛋白的菌体裂解物上清中加入硫酸铵使硫酸铵浓度达到15％重量/体积至25％重量/体积，静置1小时至8小时，离心，收集上清；c.在步骤b收集的上清中加入硫酸铵使硫酸铵浓度达到30％重量/体积至38％重量/体积，静置1小时至8小时，离心，弃上清，收集沉淀；d.以Tris-HCl缓冲液溶解步骤c中收集的沉淀并透析除去硫酸铵；e.过DEAE sepharose离子交换柱，用线性梯度氯化钠浓度从0mol/L至1mol/L的缓冲液洗脱，收集目的蛋白。本发明的方法可以快速、简便、低成本纯化天然构象69KD外膜蛋白，从而可用于大规模工业制备天然构象69KD外膜蛋白。
文档编号C07K1/18GK102584958SQ20121002754
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月8日 优先权日2012年2月8日
发明者王玲, 肖詹蓉 申请人:北京天坛生物制品股份有限公司