专利名称：一种氧化石竹烯、β-法尼烯和石竹烯的分离制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基于高速逆流色谱法从外来入侵植物黄顶菊挥发油中分离制备高纯度单体氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的方法。
背景技术：
黄顶菊\_Flaveria bi dent is (L) Kuntze]是起源于南美洲热带雨林地区的菊科堆心菊族黄菊属iPlaveria) 一年生草本植物，主要分布于美洲中部、北美洲南部及西印度群岛，它是全球许多国家的重要外来入侵植物和恶性杂草之一，因此受到我国社会和科学工作者的高度重视并取得了重要研究进展。黄顶菊于2001年以后相继在我国华北地区的河北省和天津市发生大面积危害， 是一种重要入侵杂草，繁殖能力和适应性极强，多见于农田、荒地和垃圾场等多种生境，与本地植物争夺水肥和生存空间，从而导致农作物减产，造成巨大的经济损失。从目前的防治经验来看，仅依靠传统的人工铲除和简单的化学药剂防治很难达到理想的控制效果，因此以资源化利用为主旨使其变废为宝，进一步研究发掘其潜在的农用、医用及商业经济价值， 不仅能达到了预防控制的目的，更能实现资源的最大化利用，为人类生活服务。研究表明，黄顶菊含有生物活性物质,如黄酮类、噻吩类、倍半萜类和留体类物质等。本发明主要从黄顶菊中提取倍半萜类弱极性化合物，其中氧化石竹烯具有抗真菌和杀细菌特性，尤其是它对皮肤癣菌有特效抑制作用。目前对氧化石竹烯的研究多集中于定性分析，而关于色谱法制备性分离还鲜于报道。β -法尼烯是蚜虫的报警信息素，极具发展潜力，具有驱散蚜虫的特点。β -法尼烯主要采用有机合成的方法获得，因工艺复杂故而价格昂贵。石竹烯多用于调配丁香、胡椒、肉豆蘧、柑橘、药草等食用香精，它的制备方法是将除去丁香酚之后的丁香油经真空分馏获得，但并不能获得极高纯度的单体。而通过高速逆流色谱法可以从黄顶菊挥发油中一次性分离制备出以上三种高纯度的单体物质。高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography, HSCCC)是一种不需要任何固体支撑物的液-液色谱分离技术，避免了固态载体带来的一系列问题——样品易被吸附、损耗和变性，它具有高效、快速、连续、高回收率和大制备量分离等优点。大量粗提样品或合成混合物可以直接进样至高速逆流色谱仪中实现分离，由于HSCCC与传统的分离纯化方法相比具有明显的优点，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、 天然产物化学、有机合成、环境分析等领域。
发明内容
本发明的目的是通过水蒸气蒸馏法从外来入侵植物黄顶菊中获得挥发油物质，然后通过高速逆流色谱法对挥发油分离纯化，获得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯，纯度分别为91%、98%和97%以上。本发明的方案是通过水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油粗品经高速逆流色谱法分离制备高纯度弱极性化合物氧化石竹烯、β_法尼烯和石竹烯。选择两相非水性溶剂体系，有三个组分构成，A组分是正构烷烃，B组分是乙腈或脂肪醇，C组分是乙醇或二氯甲烷。 上相作为固定相，下相作为流动相，调节A:B:C三组分的体积比为5:3-4:1-4，经过一次逆流实现氧化石竹烯、β-法尼烯和石竹烯的快速分离。首先在分液漏斗中按适当的比例配制上述逆流溶剂体系，摇匀后静置分层。采用分析型或半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，六通阀及体积为2mL、5mL和8mL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为40mL、230 mL和500mL，EMC-UVC紫外检测器,Yokogawa 3057便携式记录仪。将挥发油溶于适量流动相中待用，进样前先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为800-1500rpm，以O. 5-3. OmL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在主机中建立动态平衡后不再会有固定相被推出，然后通过六通阀进样，根据记录仪中的紫外谱图收集目标馏分并进行HPLC分析检测。通过本方法获得的氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达91%、98%和 97%以上。适用于采用各种型号的高速逆流色谱仪从黄顶菊挥发油中分离制备氧化石竹烯、 β -法尼烯和石竹烯单体，粗提样品可直接进样。
具体实施例方式实施例I
选择正己烷-乙腈-乙醇(5:4:3，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用半制备型高速逆流色谱仪GSlOA进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中， 以上相作为固定相、下相作为流动相，称取112. 6mg挥发油粗品溶于3mL流动相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及5mL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为230 mL, EMC-UVC紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为800rpm，以I. 5mL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC检测。通过 HPLC检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达92. 6%, 99. 2%和98. 3%。实施例2
选择正戊烷-乙腈-乙醇(5:3:4，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用半制备型高速逆流色谱仪GSlOA进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中， 以上相作为固定相、下相作为流动相，称取161.2mg挥发油粗品溶于3mL流动相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及5mL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为230 mL, EMC-UVC紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为850rpm，以2. OmL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC检测。通过 HPLC检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达91. 8%,98. 9%和98. 1%。实施例3
选择正庚烷-正丁醇-乙醇(5:4:2，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用半制备型高速逆流色谱仪EMC-500A进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中，以上相作为固定相、下相作为流动相，称取200. 6mg挥发油粗品溶于5mL流动相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及SmL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为500 mL，EMC-UVC紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。 首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为lOOOrpm，以3. OmL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC检测。通过HPLC检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达91. 3%,98. 6%和97. 4%。实施例4
选择正己烷-乙腈-二氯甲烷(5:4:1，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用半制备型高速逆流色谱仪EMC-500A进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中，以上相作为固定相、下相作为流动相，称取197. 5mg挥发油粗品溶于5mL流动相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及SmL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为500 mL, EMC-UVC紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为lOOOrpm，以2. OmL/ min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC 检测。通过HPLC检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达92. 1%、99. 3%和 98. 7%。实施例5
选择正己烷-正丁醇-乙醇(5:4:1，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用半制备型高速逆流色谱仪GSlOA进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中，以上相作为固定相、下相作为流动相，称取118. 8mg挥发油粗品溶于3mL流动相中待用。 采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及5mL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为230 mL, EMC-UVC紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为850rpm，以I. 5mL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC检测。通过HPLC检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达92. 5%,99. 3%和98. 5%。实施例6
选择正己烷-乙腈-乙醇(5:4:3，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用分析型高速逆流色谱仪GS20进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中，以上相作为固定相、下相作为流动相，称取22. Img挥发油粗品溶于ImL流动相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及2mL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为40 mL,EMC-UVC紫外检测器,Yokogawa 3057便携式记录仪。首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为1500rpm，以O. 5mL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC检测。通过HPLC 检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达92. 7%, 99. 4%和98. 6%。实施例7
选择正己烷-乙腈-乙醇(5:4:4，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用半制备型高速逆流色谱仪EMC-500A进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中，以上相作为固定相、下相作为流动相，称取207. 9mg挥发油粗品溶于5mL流动相中待用。 采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及SmL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为500 mL, EMC-UVC紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为lOOOrpm，以2. OmL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC检测。通过HPLC检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达92. 6%, 99. 6%和99. 1%。实施例8
选择正己烷-乙腈-乙醇(5:3:1，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用半制备型高速逆流色谱仪GSlOA进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中， 以上相作为固定相、下相作为流动相，称取108. 2mg挥发油粗品溶于3mL流动相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及5mL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为230 mL, EMC-UVC紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为800rpm，以2. OmL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC检测。通过 HPLC检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达91. 7%,98. 6%和97. 8%。实施例9
选择正己烷-乙腈-二氯甲烷(5:3. 5:1. 5，ν/ν)溶剂体系，以水蒸气蒸馏法获得的黄顶菊挥发油样品用半制备型高速逆流色谱仪GSlOA进行分离纯化实验。按上述各组分比例在分液漏斗中配置该溶剂体系，摇匀后静置分层，待静止平衡后将上、下相分别盛于不同的容器中，以上相作为固定相、下相作为流动相，称取131. 4mg挥发油粗品溶于3mL流动相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，包括有NS-1007泵，六通阀及5mL聚四氟乙烯材料制作而成的进样环，主机柱容积为230 mL, EMC-UVC紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。首先用固定相充满整个逆流色谱仪管路，调节逆流主机转速为800rpm,以I. OmL/min的流速将流动相泵入管路，当固定相和流动相在逆流主机中实现动态平衡后，将配置好的样品通过六通阀进样。然后根据记录仪中画出的色谱图分别接受目标馏分并进行HPLC检测。 通过HPLC检测得氧化石竹烯、β -法尼烯和石竹烯的纯度分别高达92. 8%, 99. 6%和99. 0%。
权利要求
1.一种高速逆流色谱法从黄顶菊中分离制备氧化石竹烯、β-法尼烯和石竹烯单体的方法，其特征是以外来入侵植物黄顶菊为原料，通过水蒸气蒸馏法进行样品前处理，采用正构烷烃、乙腈或脂肪醇和乙醇或二氯甲烷溶剂体系的高速逆流色谱法制备分离、减压蒸干后获得高纯度氧化石竹烯、β-法尼烯和石竹烯单体。
2.根据权利要求I所述样品的前处理方法，其特征是用水蒸气蒸馏法从黄顶菊中提取挥发油样品。
3.根据权利要求I所述从黄顶菊挥发油样品中分离制备氧化石竹烯、β_法尼烯和石竹烯单体的方法，其特征是应用的分离方法为高速逆流色谱法。
4.根据权利要求I所述从黄顶菊挥发油样品中分离制备氧化石竹烯、β_法尼烯和石竹烯单体的方法，其特征是所使用的设备是高速逆流色谱仪。
5.根据权利要求I和4所述的分离设备高速逆流色谱仪，其特征是可根据分离目标量选择分析型或半制备型高速逆流色谱仪。
6.根据权利要求I所述的逆流色谱法所用两相溶剂体系，其特征是溶剂体系由正构烷烃、乙腈或脂肪醇和乙醇或二氯甲烷构成，体积比依次为5:3-4:1-4。
全文摘要
本发明公开了一种基于高速逆流色谱法从黄顶菊中分离制备高纯度单体氧化石竹烯、β-法尼烯和石竹烯的方法，属天然产物单体的分离方法。本发明以外来入侵植物黄顶菊为原料，通过水蒸气蒸馏法获得挥发油样品，采用高速逆流色谱法进行分离纯化。溶剂体系由正构烷烃、乙腈或脂肪醇和乙醇或二氯甲烷构成，其体积比为53-41-4，适用于各种型号的高速逆流色谱仪，单次实验能够直接进大量挥发油粗品，并可分离获得单体氧化石竹烯、β-法尼烯和石竹烯，纯度分别高达91%、98%和97%以上。本方法可控性强、操作简捷、分离效果好和制备量大，具有规模化制备前景。
文档编号C07C7/12GK102603458SQ20121003502
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者杜继林, 魏芸 申请人:北京化工大学