专利名称：p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法及其在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别涉及P75NTR-ED-FC融合蛋白的制备及应用。
背景技术：
中枢神经系统(Central nervous system, CNS)损伤与修复一直是神经科学研究的热点。发育神经生物学及大量移植修复实验证实成年哺乳动物CNS损伤后不仅可再生而且由神经元固有的特性(Intrinsic properties)和其所处的微环境(Environment cues)决定，与周围神经系统损伤后的成功再生相比，CNS再生失败的主要原因是由于损伤微环境中多种再生抑制分子，如Nogo-A、MAG (Myelin-associated glycoprotein)和 OMgp (Oligodendrocytenyelin glycoprotein)的存在。它们均能独立通过 Nogo-66 受体(Nogo-66 receptor,NgR)及其下游可能的信号通路參与神经再生的抑制作用。NgR是ー 种GPI (Glycosyl phosphatidyl inositol)锚定膜蛋白，本身无信号转导能力，其下游分子的活化需要其协同受体(Co-receptor)的參与。研究表明中枢神经神经元p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)作为NgR的一个协同受体，可通过其细胞外域(Extracellular domain, ED)与NgR碳末端结合介导髓磷脂抑制物对轴突再生的抑制作用。目前虽然P75NTR抑制剂在体外可增强神经元突起的生长，但体内实验却仍未证实其能够促进损伤中枢神经元的轴突再生及功能恢复。研究表明，体外移植p75NTR高表达的雪旺细胞(Schwann cells, SCs)，嗅鞘细胞 (Olfactory enshenthing cells, OECs),神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)等均可促进损伤脊髄的轴突再生和功能改善。尽管其作用机制目前尚不清楚，但它们有ー个共同特点，即均高表达P75NTR。这些细胞表面高表达的P75NTR在移植于损伤脊髓后可能与再生环境中神经元的NgR-配体复合物发生相互作用，拮抗神经元的NgR信号通路，减少再生抑制分子的抑制效应，进而促进轴突的再生。但靠细胞培养移植治疗脊髓损伤，过程相对复杂，培养成本较高，可操作性不强，很难形成大規模生产。目前重组蛋白的表达体系主要有真核表达体系和原核表达体系。真核表达体系最常用的为酵母表达体系和哺乳动物细胞表达体系。尽管真核表达体系可产生具有天然立体结构的分泌型蛋白，但真核表达体系也有其致命的缺点。如酵母表达体系糖链与哺乳动物加工不一致，培养上清中糖浓度较高，部分蛋白产物易降解，表达量不可控；再如哺乳动物细胞表达系统表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高，远不能满足未来药物开发的需要。原核表达体系中最常用的为大肠杆菌coh)，其遗传背景清楚，基因工程操作简便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高，更重要的是其生产成本低、周期短，适合大規模生产。尽管其表达的蛋白很难进行正确折叠，生物活性较低，但PET 原核表达系统通过对载体及宿主的改进，该状况已有较大改观
发明内容
本发明的目的是提供一种p75NTR-ED_Fc融合蛋白的制备方法，以提高 p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表达效率和生物活性。本发明的另一目的是提供p75NTR-ED-Fc融合蛋白的新用途，具体讲是提供 p75NTR-ED-Fc融合蛋白在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用，以促进损伤中枢神经再生与功能恢复。本发明所述p75NTR-ED_Fc融合蛋白的制备方法由以下步骤实现
(1)p75NTR-ED-Fc原核表达载体的构建与鉴定
以真核表达载体pcDNA-p75NTR-ED-Fc质粒为模板，根据Genebank中编号为 NM_002507. I的p75NTR核苷酸序列及编号为XM_002348257. I的IgG的Fe段核苷酸序列分别设计特异的P75NTR正向引物和半特异的p75NTR/Fc反向引物，并在引物两端分别弓I入 Kpn I, Xho I酶切位点及相应的保护碱基，经PCR扩增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下
Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'
Kpn I酶切位点
Reverse primer: 5’ CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3’
Xho I酶切位点
PCR扩增获得的p75NTR-ED-Fc片段，经Kpn I和Xho I双酶切后回收纯化并将其克隆于同样双酶切的pET32a+表达载体中，最终获得含硫氧还蛋白及His标签的 pET-p75NTR-ED-Fc原核表达载体，对获得的pET-p75NTR-ED_Fc重组表达质粒进行PCR、酶切和测序鉴定验证其插入序列的准确性；
(2)Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的诱导表达
将鉴定正确的重组质粒pET-p75NTR-ED-Fc转化至万.coB BL-21 pLys感受态细胞中， 挑选白色克隆于LB培养基中，35 39°C，220 280rpm振荡培养约4 7小时，在OD6tltl达到0. 5 I. 0时加入IPTG至终浓度为0. 8 I. 2mmol/L,继续诱导表达12 20小时，高速冷冻离心机离心收集培养好的菌体后重悬于Tris-HCl缓冲液中，然后用超声破菌，离心， SDS-PAGE电泳初歩检测菌体上清及沉淀中蛋白的表达情况；
(3)Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化
取步骤(2)所得上清，利用His-tag亲和层析柱纯化破菌上清中的目标融合蛋白 Trx-p75NTR-ED-Fc，将该纯化后的目标融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc通过脱盐柱除去溶液中的咪唑和NaCl ；
(4)酶切除去Trx
在纯化后的融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc溶液中加入重组牛肠激酶，酶切除去Trx，获得p75NTR-ED-Fc融合蛋白；
(5)p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化
利用Hi s-tag亲和层析柱对酶切后的融合蛋白p75NTR-ED-Fc进行纯化，得到含有切去融合标签Trx的融合蛋白p75NTR-ED-Fc，利用阴离子交换层析柱对所得融合蛋白 p75NTR-ED-Fc进ー步纯化，并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的融合蛋白采用透析缓冲液透析到保存缓冲液中，获得最終蛋白产品。本发明所述制备方法利用大肠杆菌pET32a+表达体系采用基因工程方法构建外源融合蛋白p75NTR-ED-Fc与原核多肽硫氧还蛋白(Trx)及His标签(Tag)的融合蛋白， 不仅具有上述原核表达体系的优点，而且易于纯化，大大提高了表达蛋白的生物活性。另外，本发明利用人p75NTR-ED-Fc融合蛋白拮抗NgR信号达到促进神经损伤后再生的目的具有明显优势受体-Fe (Fragmentcristallizable)融合蛋白已被证实是除了抗体药物外，清除体内多余配体分子的又一有效手段，且与抗体药物相比，不必进行繁琐的抗体筛选和人源化过程；受体结构域在融合蛋白中执行结合配体的功能，而Fe部分可有多种作用， 如可使用通用的标记ニ抗进行检测，可通过与protein A的结合而使用亲和层析方便地纯化，更重要的是可大大延长药物在体内的半衰期。除上述优势外，P75NTR-ED与Fe结合还可提高P75NTR-ED的浓度并使其固定，从而模拟SCs、OECs等细胞的p75NTR定位，有利于充分提高其生物学功能。为观察重组p75NTR-ED_Fc融合蛋白在中枢神经损伤修复过程中对抗NgR信号对神经再生及功能恢复的影响，分别采用体外和体内实验检测该重组蛋白对神经元突起生长的促进效应及对损伤脊髄的修复作用。
图IA是重组质粒的PCR鉴定结果图，其中M为DNA Marker DL 2000,1、2分别为克隆1、2 ；
图IB是重组质粒pET-p75NTR-ED-Fc酶切鉴定结果图，其中I: pET_32a+ Kpn I+Xho I 双酶切，2:重组 pET-p75NTR-ED-Fc Kpn I+Xho I 双酶切，M: Wide Range DNA Marker (500-15000),3: pET-32a+ Xho I 单酶切，4:重组 pET-p75NTR-ED_Fc Xho I 单酶切;
图2是重组p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表达和纯化的SDS-PAGE结果图，其中M :蛋白质标准，I :未经IPTG诱导的全菌裂解液，2 :经IPTG诱导的全菌裂解液，3 :经IPTG诱导的破菌上清，4 :经IPTG诱导的菌体破菌沉淀，5 6 :破菌上清His-tag柱穿流样(未结合到亲和柱的部分)，7 :破菌上清His-tag柱洗脱样(Trx-p75NTR-ED-Fc蛋白)，8 :酶切除去Trx纯化的重组p75NTR-ED-Fc蛋白；
图3是重组p75NTR-ED-Fc融合蛋白的Western Blot鉴定结果图，其中1_2 :纯化的目标蛋白，3:未诱导的破菌上清；
图4A是重组p75NTR-ED-Fc可中和MAG对神经突起生长的抑制作用，在预先用MAG 处理的培养液中培养大鼠新生鼠背根节神经元(Dorsal root ganglia, DRG),加入 p75NTR-ED-Fc培养24h后与只加MAG组进行比较，标尺100_ ；
图4B是重组p75NTR-ED-Fc可中和MAG对神经突起生长的抑制作用，统计分析各组神经元平均突起长度图，其中数据表示为均数土标准误(与MAG组相比，*#，p〈0. 001)；
图5A是免疫荧光法检测不同处理神经元中NgR的表达，用兔抗NgR抗体免疫荧光检测结果显示图，标尺50_ ；
图5B是免疫荧光法检测不同处理神经元中NgR的表达，NgR表达强度的定量分析结果图(与 MAG 组相比，#，p〈0. 001)。图6A是脊髓半横断模型行为学检测結果，BBB评分结果图(与单纯损伤(SCI)组相比，*，p〈0. 05 ;**, p〈0. 01)；
图6B是脊髓半横断模型行为学检测结果，足迹试验结果图(红色标记大鼠前掌，蓝色标记后掌，d表示后掌中心垂直间距)；
图6C是脊髓半横断模型行为学检测结果，足迹试验结果统计图(与SCI组相比，#， p〈0. 01)；
图6D是脊髓半横断模型的神经电生理学检测结果；
图7A是核黄(Nuclear yellow, NY)逆行示踪标记各组损伤部位头侧(距损伤部位中心上游约5mm处)脊髄冠状切片图，结果显示p75NTR-ED-Fc蛋白可促进脊髓损伤后轴突的再生，标尺80mm ；
图7B是核黄(Nuclear yellow, NY)逆行示踪结果显示p75NTR_ED_Fc蛋白可促进脊髓损伤后轴突的再生。以脊髓损伤部位头侧逆行标记的阳性神经元数目表示轴突的再生情况(与 SCI 组相比，_，p〈0. 0001)；
图8A是免疫荧光法检测损伤脊髓组织中NgR的表达，用兔抗NgR抗体免疫荧光检测结果显示图，标尺80_ ；
图8B是免疫荧光法检测损伤脊髓组织中NgR的表达，NgR表达强度的定量分析结果图 (与 SCI 组相比，***，p〈0. 0001)。
具体实施例方式实施I :p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法由以下步骤实现
(I) p75NTR-ED-Fc表达载体的构建及鉴定
为获得大量天然表达的p75NTR-ED-Fc融合蛋白，本发明以真核表达载体 pcDNA-p75NTR-ED-Fc质粒(本实验室保存)为模板,根据Genebank中编号为NM_002507. I 的p75NTR核苷酸序列及编号为XM_002348257. I的IgG的Fe段核苷酸序列分别设计特异的P75NTR正向引物和半特异的p75NTR/Fc反向引物，并在引物两端分别引入Kpn I.Xho I 酶切位点及相应的保护碱基，经PCR扩增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下
Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'
KpnI酶切位点
Reverse primer: 5’ CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3’
Xho I酶切位点按以下方法进行PCR扩增
PCR反应体系
权利要求
1.P75NTR-ED-FC融合蛋白的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现(1)p75NTR-ED-Fc原核表达载体的构建与鉴定以真核表达载体pcDNA-p75NTR-ED-Fc质粒为模板，根据Genebank中编号为 NM_002507. I的p75NTR核苷酸序列及编号为XM_002348257. I的IgG的Fe段核苷酸序列分别设计特异的P75NTR正向引物和半特异的p75NTR/Fc反向引物，并在引物两端分别弓I入 Kpn I, Xho I酶切位点及相应的保护碱基，经PCR扩增得到p75NTR-ED_Fc片段，引物序列如下Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'Kpn I酶切位点Reverse primer: 5’ CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3’Xho I酶切位点PCR扩增获得的p75NTR-ED-Fc片段，经Kpn I和Xho I双酶切后回收纯化并将其克隆于同样双酶切的pET32a+表达载体中，最终获得含硫氧还蛋白及His标签的 pET-p75NTR-ED-Fc原核表达载体，对获得的pET-p75NTR-ED_Fc重组表达质粒进行PCR、酶切和测序鉴定验证其插入序列的准确性；(2)Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的诱导表达将鉴定正确的重组质粒pET-p75NTR-ED-Fc转化至疋co7i BL-21 pLys感受态细胞中， 挑选白色克隆于LB培养基中，35 39°C，220 280rpm振荡培养约4 7小时，在OD6tltl达到O. 5 I. O时加入IPTG至终浓度为O. 8 I. 2mmol/L,继续诱导表达12 20小时，高速冷冻离心机离心收集培养好的菌体后重悬于Tris-HCl缓冲液中，然后用超声破菌，离心， SDS-PAGE电泳初步检测菌体上清及沉淀中蛋白的表达情况；(3)Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化取步骤(2)所得上清，利用His-tag亲和层析柱纯化破菌上清中的目标融合蛋白 Trx-p75NTR-ED-Fc，将该纯化后的目标融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc通过脱盐柱除去溶液中的咪唑和NaCl ；(4)酶切除去Trx在纯化后的融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc溶液中加入重组牛肠激酶，酶切除去Trx，获得p75NTR-ED-Fc融合蛋白；(5)p75NTR-ED-Fc融合蛋白的纯化利用Hi s-tag亲和层析柱对酶切后的融合蛋白p75NTR-ED-Fc进行纯化，得到含有切去融合标签Trx的融合蛋白p75NTR-ED-Fc，利用阴离子交换层析柱对所得融合蛋白 p75NTR-ED-Fc进一步纯化，并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的融合蛋白采用透析缓冲液透析到保存缓冲液中，获得最终蛋白产品。
2.p75NTR-ED-Fc融合蛋白在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，特别涉及p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备及应用。该p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法能够提高p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表达效率和生物活性，p75NTR-ED-Fc融合蛋白能够用于促进损伤中枢神经再生与功能恢复。
文档编号C07K19/00GK102586313SQ201210053808
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者伍亚民, 朱枫, 王永堂, 鲁秀敏, 黄鹏, 龙在云 申请人:中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所