新颖抗原结合多肽和其用途的制作方法

专利名称：新颖抗原结合多肽和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含至少一种非天然编码氨基酸的新颖抗原结合多肽。本发明一般涉及使用化学和重组DNA通过分子生物学方法产生和选择抗原结合多肽的领域。
背景技术：
天然产生的抗体(Ab)是由两个相同免疫球蛋白(Ig)重链和两个相同轻链组成的四聚结构。Ab的重链和轻链由不同域组成。各轻链具有一个可变域(VL)和一个恒定域(CL)，而各重链具有一个可变域(VH)和三或四个恒定域(CH)。由约110个氨基酸残基组成的各功能域折叠成由两个β片层相互包装所形成的特征性β三明治结构，称为免疫球蛋白折叠。VL域各具有三个互补决定区(⑶R1-3)，而VH域各具有多达四个互补决定区 (CDR1-4)，互补决定区为在功能域的一端连接β链的环或转角。轻链和重链的可变区通常有助于抗原特异性，而尽管个别链对特异性的贡献并非必需相等。通过随机CDR环，抗体分子已发展成结合于许多分子。可以通过蛋白水解和通过重组方法制备Ab的功能子结构。这些功能子结构包括 Fab片段、Fv片段和Fe部分，其中Fab片段包含通过一个链内二硫键连接的重链VH-CHl域和轻链VL-CLl域，Fv片段仅包含VH和VL域，并且Fe部分包含分子的非抗原结合区。在一些情况下，单一 VH域保留与抗原的显著亲和力(Ward等人，1989,Nature 341, 554-546)。也已经显示某些单聚K轻链应特异地结合于其抗原。(L. Masat等人，1994，PNAS 91 :893-896)。 已经发现分离的轻链或重链有时也保留一些抗原结合活性(Ward等人，1989, Nature 341, 554-546)。另一功能子结构为单链Fv(scFv),其包含通过肽连接子共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区(S-z Hu等人，1996，Cancer Research，56，3055-3061)。这些小 (Mr25, 000)蛋白通常保留与单多肽内抗原的特异性和亲和力，并且可以提供对大、抗原特异性分子的便利构件单元(building block)。循环中scFV的短半衰期限制其在许多情况中的治疗效用。用部分Ig VH域作为模板设计称为“微型抗体(minibody) ”的小蛋白骨架(Pessi 等人，1993，Nature 362，367-369)。通过使对应于VH的CDRl和CDR2的环随机化并接着使用噬菌体展示法选择突变体来鉴别与白细胞介素-6具有高亲合力(解离常数(Kd)为约 I(T7M)的微型抗体(Martin 等人，1994，EMBO J. 13，5303-5309)。当分析骆驼血清的IgG样物质时，发现骆驼通常缺乏可变轻链域，表明足够的抗体特异性和亲和力可能仅来源于VH域(三或四个CDR环)。已经制出具有高亲和力的“骆驼化” VH域，并且可以仅通过使⑶R3随机化来产生高特异性。“微型抗体”的一个替代是“微型双功能抗体(diabody)”。微型双功能抗体是具有两个抗原结合位点的小、二价、双特异性抗体片段。所述片段包含在同一多肽链(Vh-VJ上与轻链可变域(VJ相连接的重链可变域(Vh)。微型双功能抗体大小与Fab片段相似。通过使用过短而不能使同一链上的两个功能域之间配对的连接子，使得功能域与另一条链上的互补功能域配对并产生两个抗原结合位点。这些二聚抗体片段或“微型双功能抗体”是二价的且具有双特异性。参看，P. Holliger等人，PNAS90 =6444-6448 (1993)。已经制得CDR 妝和有机 CDR 模拟物(Dougall 等人，1994, Trends Biotechnol. 12, 372-379)。CDR肽是对应抗体CDR环的氨基酸序列的短肽(通常为环状)。CDR环负责抗体-抗原互作。⑶R肽和有机⑶R模拟物已经显示保留了一些结合亲和力(Smyth &von Itzstein，1994，J. Am. Chem. Soc. 116,2725-2733)。已经将小鼠 CDR 移植到人类 Ig 框架而不丧失亲和力(Jones 等人，1986, Nature 321, 522-525 ;Riechmann 等人，1988)。在身体内，选择特异性Ab并从大文库扩增(亲和力成熟)。可以使用重组文库技术活体外复制所述过程。在细菌噬菌体表面上成功地展示Ab片段已经使产生并筛选许多CDR 突变体成为可能(McCafferty 等人，1990, Nature 348, 552-554 ；Barbas 等人，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88，7978-7982 ；ffinter 等人，1994，Annu. Rev. Immunol. 12，433-455)。 通过此技术产生越来越多的Fab和Fv(及其衍生物)。重组技术可以与Ab模拟物结合。可能充当蛋白骨架的许多蛋白域已经表现为与噬菌体衣壳蛋白的融合体。参看 Clackson & Wells, Trends Biotechnol. 12 :173-184 (1994)。已经将这些蛋白域中的数种用作骨架以展示随机肽序列，包括牛胰腺胰岛素抑制剂(Roberts等人，PNAS 89 :2429-2433(1992))、人类生长激素(Lowman 等人，Biochemistry 30 10832-10838(1991), Venturini et al., Protein Peptide Letters I :70-75(1994))和链球菌(Streptococcus) IgG 结合域(C' Neil 等人，Techniques in Protein Chemistry
V(Crabb, L,编辑)第 517-524 页，Academic Press, San Diego (1994))。这些折叠已展不出单一随机环或区。已经将淀粉酶抑肽(tendamistat)用作丝状噬菌体M13上的呈递骨架 (presentation scaffold)(McConnell 和 Hoess, 1995, J. MoI. Biol. 250 :460-470)。ErbB家族的受体酪氨酸激酶在细胞生长和分化中起至关重要的作用。这些受体的异常活化与人类癌症相关。二聚化(受体配对)是所有ErbB受体信号转导活性所必需的。 已经显示，阻断ErbB2 二聚活性直接抑制ErbB2与其它ErbB2受体蛋白二聚化的能力。抑制受体二聚化阻止ErbB信号转导途径的激活。下调ErbB信号转导的拮抗分子可以充当抗肿瘤剂。目前，ErbB信号转导网络是开发抗肿瘤药物的主要目标。ErbB-I是EGF的特异性受体，而ErbB-2具有未知的天然配体。ErbB2在添加EGF时能够与ErbB-I形成异源二聚体。ErbB2还充当激酶死亡(kinase-dead)ErbB-3和ErbB-4的首选二聚化伴侣,所述两者均为神经调节素(neuregulin)的受体。也可以在信号转导期间通过细胞因子和G偶联蛋白受体的配体以间接方式激活ErbB信号转导网络，表明其在许多不同细胞类型的生长控制中起重要作用。原癌基因c-erbB-Ι编码表皮生长因子受体。其名字起源于从禽类成红细胞增多症病毒(avian erythroblastosis virus, AEV)分离出来的病毒同源v-erbB,其作为缺乏氨基末端配体结合域的鸡c-ErbB-Ι基因的片段包含于该病毒中。在包括各种位点鳞状癌和腺癌的许多肿瘤中发生erbB-Ι基因的过度表达。人类c-erbB-Ι基因位于染色体区7pl4 和7pl2中。ErbB-2原癌基因(又称为Neu、EGFR_2或HER-2)是跨膜受体酪氨酸激酶家族的成员，其也包括EGF受体和EGFR-3 (HER-3或ErbB_3)。ErbB-2编码具有内在酪氨酸激酶活性的185kDa跨膜受体样糖蛋白。尽管ErbB-2并不具有任何已知高亲和力配体，但是可以通过过度表达或与ErbB家族受体的其它成员异质结合而在无配体的情况下激活其激酶活性。 已经在将近40%原发性人类乳癌中发现ErbB-2基因的扩增和其产物的过度表达。ErbB-2 过度表达也在卵巢癌、胃癌和非小细胞肺癌中被发现。通过与神经调节素受体ErbB-3和 ErbB-4形成异源二聚体的神经调节素来活化ErbB-2。人源化抗ErbB-2单克隆抗体贺赛汀 (Here印tin)(来自单克隆4D5)已经得到FDA批准而用于治疗过度表达ErbB-2的癌症。正在开发的另一种抗ErbB-2抗体是帕妥珠单抗(Pertuzumab)(来自单克隆2C4) 0ErbB-I (EGF 受体)的酪氨酸激酶活性的特异性抑制剂也正在进行临床试验。抗ErbB2抗体在所属技术领域中是已知的，且包括(但不限于)美国专利第 4，753，894 号、第 5，169，774 号、第 5，677，171 号、第 5，720，937 号、第 5，720，954 号、第 5，725，856 号、第 5，770，195 号、第 5，772，997 号、第 5，783，186 号、第 6，054，561 号、第 6，165，464 号、第 6，333，169 号、第 6，015，567 号、第 6，387，371 号、第 6，399，063 号、第 6，441, 143号、第6, 458, 356号、第6, 627, 196号，各专利文献均以引用的方式并入本文。共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(简称为PEG)是一种增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长许多生物活性分子(包括蛋白、肽和特定疏水性分子)循环时间的方法。PEG已经广泛用于医药品、人工移植体和其它应用中，在这些应用中生物相容性、缺乏毒性和缺乏免疫原性是重要的。为了将PEG的所需特性最大化，连接于生物活性分子的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以能够赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加水溶性和增加循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。PEG衍生物通常经例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N端和碳水化合物部分的反应性化学官能团与生物活性分子相连接。蛋白与其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。最适合于经聚合物连接而进行修饰的位点通常在受体结合中起重要作用，且是要保留分子的生物活性所必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上这些反应性位点的不加选择的连接通常导致经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R. Clark 等人，(1996), T. Biol. Chem. ,271 :21969_21977。为了形成具有足以对靶分子赋予所需优势的聚合物分子量的结合物，先前技术方法通常涉及许多聚合物臂与分子的随机连接，进而增加母体分子生物活性降低或甚至完全丧失的风险。形成用于PEG衍生物与蛋白连接的基因座的反应性位点由蛋白结构决定。包括酶在内的蛋白由各种α氨基酸序列组成，其具有一般结构H2N--CHR—C00H。一个氨基酸的α氨基部分(H2N-)结合邻近氨基酸的羧基部分(一C00H)以形成酰胺键，可由一(NH--CHR--CO)n-表示，其中下标“η”可以等于数百或数千。由R所示的片段可以含有用于蛋白生物活性和用于PEG衍生物连接的反应性位点。举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位存在一NH2部分。ε 位一NH2部分对于在碱性pH条件下的反应而言是游离的。大部分用PEG进行蛋白衍生化的领域的技术已经针对于开发PEG衍生物来用于连接存在于蛋白中的赖氨酸残基的ε 位一NH2 部分。"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation;/ , Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003,第 1-17 页。所有这些 PEG 衍生物均具有一般限制，然而它们不能够被选择性地安置于蛋白表面上所存在的许多赖氨酸残基中。在赖氨酸残基对于蛋白活性是重要的情况下，例如存在于酶活性位点中，或者在赖氨酸残基对介导蛋白与其它生物分子互作起作用的情况下，如在受体结合位点的情况下，这会是一个显著限制。现有蛋白PEG化方法的第二个且等同重要的复杂因素在于PEG衍生物还会与所需残基之外的残基发生不良副反应。组氨酸含有由结构一N(H)--所示的反应性亚氨基部分， 但是许多与ε位一NH2反应的化学反应性物质也可与一N(H)--反应。同样，氨基酸半胱氨酸的侧链具有由结构-SH所示的游离巯基。在一些情况下，针对赖氨酸ε--ΝΗ2基团的PEG 衍生物也可与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这会产生PEG衍生的生物活性分子的复杂的、异源混合物，以及破坏靶生物分子活性的风险。需要开发允许化学官能团引入蛋白内的单个位点的PEG衍生物，从而能够使一个或一个以上PEG聚合物与蛋白表面上明确定义并且可预测的特异性位点处的生物活性分子选择性偶联。除了赖氨酸残基之外，所属领域中的大量工作是针对于开发靶向其它氨基酸侧链 (包括半胱氨酸、组氨酸和N端)的活性PEG试剂。参看，例如美国专利第6，610，281号 (其以引用的方式并入本文)和"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" ,Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003,第 1-17 页。可以使用定点突变和所属领域中其它已知技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白结构中，且所得游离巯基部分可以与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，所述方法的复杂之处在于引入游离巯基会使所得蛋白的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有将化学官能团引入生物活性分子中的方法，以便能够使一个或一个以上PEG聚合物与蛋白选择性偶合，而同时与巯基和其它通常发现于蛋白中的化学官能团相容(即，不与其发生不良副反应)。如所属领域中的取样结果可见，已经证实，所开发出的用于与蛋白的侧链连接，尤其是与赖氨酸侧链上的一NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分连接的这些衍生物中的许多在其合成与使用中存在问题。一些与遭受水解的蛋白形成不稳定键，并因而分解、降解或者在水环境中不稳定，例如在血流中。一些形成更稳定的键，但在形成键之前遭受水解，意味着PEG衍生物上的反应性基团可能在蛋白被连接之前就失活了。一些具有少许毒性，并因此较不适合在活体内使用。一些反应太慢而实际上不可用。一些因为连接于负责蛋白活性的位点而导致蛋白活性丧失。一些对其所连接的位点不具有特异性，这也可能导致所要活性丧失和结果的再现性缺乏。为了克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白相关的难题，已经开发出更为稳定的PEG衍生物(例如美国专利6，602，498，其以引用的方式并入本文)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应的PEG衍生物(例如美国专利6，610，281，其以引用的方式并入本文)。所属领域明确地需要在生理环境中呈化学惰性直至指定选择性反应以形成稳定化学键的PEG衍生物。最近，已经报导一种蛋白科学中完全新型技术，其允诺克服许多与蛋白位点特异性修饰相关的限制。明确来说，已经将新组分添加于原核生物大肠杆菌(Escherichia coli) (E. coli)(例如 L. Wang 等人，(2001)，Science 292 :498-500)和真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae) (S. cerevisiae)(例如 J. Chin 等人，Science 301 964-7 (2003))的蛋白生物合成机构中，使得能够将非遗传编码氨基酸活体内并入蛋白中。 已经使用此方法有效且高保真地将许多具有新颖化学、物理或生物性质的新氨基酸(包括光亲和力标记和光异构化氨基酸、酮氨基酸和糖基化氨基酸)并入响应于琥珀密码子TAG 的大肠杆菌和酵母蛋白中。参看，例如J. W. Chin等人，(2002), Tournal of the American Chemical Society 124 :9026-9027 ；J. ff. Chin, & P.G. Schultz, (2002)，ChemBioChemll 1135-1137 ；J. ff. Chin等人，(2002) ,PNAS United States of America 99 :11020-11024 ;和 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm. , l~10o这些研究已经证实，能够选择性地且常规地引入在蛋白中所未发现的、对在20个普通的遗传编码的氨基酸中的所有官能团呈化学惰性的且可用于有效地和选择性地反应以形成稳定共价键的化学官能团，例如酮基、 炔基和叠氮部分。将非遗传编码氨基酸并入蛋白中的能力允许引入能够有价值地替换天然发生官能团的化学官能团，所述天然发生官能团为例如赖氨酸的-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等等。已知某些化学官能团对发现于20个普通的、遗传编码氨基酸中的官能团呈惰性，但可明确地且有效地反应以形成稳定键。举例来说，所属领域已知叠氮基和乙炔基在存在催化量铜的情况下在水条件中遭受Huisgen[3+2]环化加成反应。参看，例如 Tornoe 等人，(2002) OrR. Chem. 67 :3057-3064 ；和 Rostovtsev 等人，(2002) Angew1 Chem. Int. Ed. 41 :2596-2599。举例来说，通过将叠氮部分引入蛋白结构中，能够引入对发现于蛋白中的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性、但可与乙炔部分平稳且有效地反应以形成环化加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮保留化学惰性和在存在其它蛋白侧链情况下和在生理条件下的非反应性。本发明尤其致力于解决与抗原结合多肽及其片段的活性和产生相关的问题，同时也致力于具有改进生物性质或药理学性质(例如改进治疗半衰期)的抗原结合多肽的产生。

发明内容
本发明提供包含一种或一种以上非天然编码氨基酸的抗原结合多肽(ABP)。在一些实施例中，ABP包含完整抗体重链。在一些实施例中，ABP包含完整抗体轻链。在一些实施例中，ABP包含抗体轻链的可变区。在一些实施例中，ABP包含抗体重链的可变区。在一些实施例中，ABP包含抗体轻链的至少一个CDR。在一些实施例中，ABP包含抗体重链的至少一个⑶R。在一些实施例中，ABP包含轻链的至少一个⑶R和重链的至少一个⑶R。在一些实施例中，ABP包含Fab。在一些实施例中，ABP包含两个或两个以上Fab。在一些实施例中，ABP包含scFv。在一些实施例中，ABP包含两个或两个以上scFv。在一些实施例中，ABP 包含微型抗体。在一些实施例中，ABP包含两个或两个以上微型抗体。在一些实施例中，ABP包含微型双功能抗体。在一些实施例中，ABP包含两个或两个以上微型双功能抗体。在一些实施例中，ABP包含轻链可变区和重链可变区。在一些实施例中，ABP包含完整轻链和完整重链。在一些实施例中，ABP包含一个或一个以上Fe域或其部分。在一些实施例中，ABP 包含任何上述实施例的组合。在一些实施例中，ABP包含任何上述实施例的同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。在一些实施例中，ABP包含与结合伴侣结合的多肽， 其中结合伴侣包含抗原、多肽、核酸分子、聚合物或其它分子或物质。在一些实施例中，ABP 与非抗体骨架分子或物质相关。在一些实施例中，ABP包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，ABP与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，ABP与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它ABP连接。在一些实施例中，ABP连接于并非ABP的多肽。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽连接于一个或一个以上也可包含非天然编码氨基酸的其它抗原结合多肽。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为双官能聚合物。 在一些实施例中，双官能聚合物连接于第二多肽。在一些实施例中，第二多肽为抗原结合多肽。在一些实施例中，抗原结合多肽包含至少两个连接于包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸为非天然编码氨基酸。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的亲和力相比时，调节抗原结合多肽对抗原的亲和力的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的稳定性相比时，增加抗原结合多肽稳定性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的免疫原性相比时，调节抗原结合多肽免疫原性的替换、 添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的血清半衰期或循环时间相比时，调节抗原结合多肽血清半衰期或循环时间的替换、 添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的水溶性相比时，增加抗原结合多肽水溶性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的溶解性相比时，增加宿主细胞中所产生的抗原结合多肽溶解性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的表达相比时，增加宿主细胞中或活体外所合成的抗原结合多肽表达的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的蛋白酶抗性相比时，增加抗原结合多肽蛋白酶抗性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，可以用天然发生或非天然发生氨基酸进行ABP中的氨基酸替换，其限制条件在于至少一个替换是用非天然编码氨基酸进行。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基服基、置氣基或块基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构其中η为0-10 为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。 在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编
码氨基酸具有以下结构
(CH2)nR1X(CH2)mN3 R2HN COR3其中η为0-10 为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；Χ为0、N、S或不存在；m为0-10 ；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基
酸具有以下结构
(CH2)nR1X(CH2)mCCH R2HN COR3其中η为0-10 为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；Χ为0、N、S或不存在； m为0-10 ；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，多肽是抗原至少一种活性的激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中,激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码氨基酸和一种或一种以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。本发明还提供包含编码抗原结合多肽的多聚核苷酸的经分离核酸，其中多聚核苷酸包含至少一个选择密码子，其包括(但不限于)SEQ ID NO : 18，20，22，25，27，29。在一些实施例中，选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。本发明还提供制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的经分离抗原结合多肽与包含与非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸对水溶性聚合物具反应性，而所述水溶性聚合物对任何20个普通氨基酸不具反应性。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸对连接子、聚合物或生物活性分子具反应性，而所述连接子、聚合物或生物活性分子对任何20个普通氨基酸不具反应性。在一些实施例中，通过使包含含羰基氨基酸的抗原结合多肽与包含氨氧基、肼基、 酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽。 在一些实施例中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含含有氨氧基、肼基、 酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽。在一些实施例中，通过使包含含炔氨基酸的抗原结合多肽与包含叠氮部分的聚 (乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。在一些实施例中，通过使包含含叠氮氨基酸的抗原结合多肽与包含炔部分的聚 (乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有约O. IkDa与约IOOkDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有约O. IkDa与约50kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为支链聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)支链聚合物的各分枝具有IkD与IOOkDa之间或IkDa与50kDa之间的分子量。在一些实施例中，连接于抗原结合多肽的水溶性聚合物包含聚烷撑二醇部分。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入ABP中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，且水溶性聚合物包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分，且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，且水溶性聚合物包含炔部分。本发明还提供包含含有非天然编码氨基酸的抗原结合多肽和医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。本发明还提供包含编码抗原结合多肽的且含有选择密码子的多聚核苷酸的细胞。 在一些实施例中，所述细胞包含用以将非天然编码氨基酸替换进抗原结合多肽中的正交 RNA合成酶和/或正交tRNA。本发明还提供制造包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许抗原结合多肽表达的条件下培养包含编码抗原结合多肽的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；和从细胞和/或培养基纯化抗原结合多肽。本发明还提供增加抗原结合多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。 本发明还提供调节抗原结合多肽免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸替换天然发生抗原结合多肽中的任何一种或一种以上氨基酸，和/或将抗原结合多肽连接于连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。本发明还提供用有效量的本发明抗原结合多肽治疗需要此治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含对患者投与治疗有效量的包含含有非天然编码氨基酸的抗原结合多肽和医药学上可接受的载剂的医药组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。本发明还提供包含SEQ ID NO : 19，21，23，24，26，28，30，31中所示序列及其片段或
任何其它抗原结合多肽序列的抗原结合多肽，但条件是至少一个氨基酸由非天然编码氨基酸替换。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、 餅基、酸餅基、氣基服基、置氣基或块基。本发明还提供包含医药学上可接受的载剂和抗原结合多肽的医药组合物，所述抗原结合多肽包含SEQ ID NO : 19，21，23，24，26，28，30，31中所示序列及其片段或任何其它抗原结合多肽序列，其中至少一个氨基酸由非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物经由糖部分连接于多肽。在一些实施例中，连接子、聚合物或生物活性分子经由糖部分连接于抗原结合多肽。本发明还提供包含经共价键连接于抗原结合多肽的单一氨基酸处的水溶性聚合物的抗原结合多肽。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，共价连接于水溶性聚合物的氨基酸为存在于多肽中的非天然编码氨基酸。本发明提供包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的抗原结合多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团连接于多肽。在一些实施例中，多肽被单PEG化。本发明还提供包含连接于一个或一个以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子的ABP多肽，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体并入多肽中的预选位点处。在另一实施例中，由于用于与非天然氨基酸结合的独特化学反应，因此包含一个或一个以上非天然发生氨基酸的抗原结合多肽与另一分子(包括，但不限于，PEG)的结合提供实质上纯的抗原结合多肽。可以执行包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的抗原结合多肽与另一分子(例如PEG)的结合，而同时在结合步骤之前或之后实施其它纯化技术， 以提供实质上纯的抗原结合多肽。


图I是抗体分子(IgG)及其抗原结合部分的一般结构图。抗原识别位点内含CDR。图2显示用于scFv-108周质(图2，A)和细胞质(图2，B)表达/抑制的构建体。 指示琥珀终止密码子的位置。显示用于Fab-108片段(图2，C)表达/抑制的双顺反子级联。显示用于scFv-4D5片段周质表达/抑制的构建体(图2，D和E)。显示用于Fab_4D5 片段表达/抑制的的顺反子(图2，F)。图3显示GlySer连接子(S131Am)内第二丝氨酸中琥珀突变的抑制(图3，A)和相应含PAcF的scFv的IMAC纯化分析(图3，B)。图4显示scFv细胞质表达期间VL链(L156)中的琥珀突变抑制。图5,A显示pAcF-scFv-108片段的PEG化和二聚化。分别用单箭头和双箭头指示单PEG化scFv和二聚体的位置。图5，B显示pAcF-scFv-108片段-(S136)的PEG化。图 5，C显示未观察到WT scFv片段的PEG化。图6是显示在scFv-108同源二聚体纯化期间所收集的洗脱份的凝胶。图7，A-C显示含有pAcF或pAcF-PEG的scFv蛋白与表达EGF受体的A431细胞的结合。图8，A是显示mAb 108的含有pAcF或pAcF-PEG的Fab片段的凝胶。图8，B_D显示mAb108的Fab片段与表达EGF受体的A431细胞的结合。图9显示本发明的异源双官能ABP的实例。图10是显示C端(图10，A)或N端scFv_4D5 (图10，B)片段的GlySer连接子的第二丝氨酸中琥珀突变抑制的凝胶。图11显示在还原和非还原条件下pAcF-Fab-4D5_(K139)和Fab-4D5_cys (图11， A)的SDS-PAGE分析。图11,B显示使用抗His抗体的图11, A中所示样品的Western印迹。图12显示连接于肽T20的HIV-I中和人Fab 4E10。图13是显示二聚化过程的图示。图14显示scFv 二聚体形成的非还原(图14，A)和还原(图14，B) SDS-PAGE分析。图15显示经纯化scFv 二聚体的SDS-PAGE分析。
具体实施例方式定义应了解，本发明并不限于本文所述的特定方法、实验方案、细胞系、构建体和试剂， 且因此可以变化。也应了解，本文所用术语仅是用于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明的保护范围，本发明的保护范围仅由所附的权利要求书限定。除非本文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个” 和“所述”包括复数形式。因此，例如提及“抗原结合多肽”或“ABP”是指一个或一个以上的所述蛋白，并且包括所属领域技术人员所已知的它的均等物，等等。除非另外定义，否则本文所用的所有科技术语均具有与本方面所属领域技术人员所一般理解的相同含义。尽管在本发明的实施或检验中可以使用任何与本文所述相似或等同的方法、装置和材料，但是现在描述优选方法、装置和材料。本文所提及的所有公开案和专利均引入本文用作参考，以用于描述和公开(例如)公开案中所述的可能与本发明相关使用的构建体和方法。仅提供本文所讨论的公开案在本申请案申请日之前的公开内容。本文决不应解释为准许本发明者无权借助先前发明或为任何其它原因提前本发明。术语“实质上纯的”是指实质上或基本上不含通常伴随于天然发生环境中发现的蛋白或与所述蛋白互作的组分(即，在重组产生ABP的情况下为天然细胞或宿主细胞)的 ABP。可以实质上不含细胞物质的ABP包括具有少于约30%、少于约25%、少于约20%、少于约15%、少于约10%、少于约5%、少于约4%、少于约3%、少于约2%或少于约1% (以干重量计)污染蛋白的蛋白制剂。当通过宿主细胞重组产生ABP或其变体时，此污染蛋白可以约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或更少的细胞干重存在。当通过宿主细胞重组产生ABP或其变体时，培养基中可存在约5g/L、约 4g/L、约 3g/L、约 2g/L、约 lg/L、约 750mg/L、约 500mg/L、约 250mg/L、约 100mg/L、约 50mg/ L、约10mg/L或约lmg/L或更少的细胞干重的污染蛋白。因此，如通过例如SDS/PAGE分析、 RP-HPLC, SEC和毛细管电泳的适当方法测定，由本发明的方法所产生的“实质上纯的”ABP 可以具有至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、 至少约60 %、至少约65 %、至少约70 %的纯度，尤其是至少约75 %、80 %、85 %的纯度，且更具体来说至少约90%的纯度，至少约95%的纯度，至少约99%或更高的纯度。“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指无论使用何种插入方法(例如，直接摄取、转导、f配合(f-mating)或所属领域已知用于建立重组宿主细胞的其它技术)而包括外源多聚核苷酸的细胞。外源多聚核苷酸可以维持为非整合载体(例如质粒)，或者可整合至宿主基因组中。如本文所用术语“介质”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或可支撑或含有任何宿主细胞的刚性支撑物，所述任何宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞或大肠杆菌和细胞内容物。因此，所述术语可以涵盖宿主细胞所生长的介质，例如ABP所分泌于其中的介质，包括增殖步骤之前或之后的介质。所述术语也涵盖含有宿主细胞溶解液的缓冲液或试剂，例如在ABP于细胞内产生和宿主细胞被溶解或破坏而释放出ABP的情况下。如本文关于蛋白重新折叠(protein refolding)所用的“还原剂”定义为维持还原状态的巯基并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。合适的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、2_巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺 (2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。所属领域技术人员轻易地了解许多还原剂适用于本发明的方法和组合物中。如本文关于蛋白重新折叠所用的“氧化剂”定义为能够从被氧化的化合物移除电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、 氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤苏糖醇(erythreitol)和氧气。所属领域技术人员轻易地了解许多氧化剂适用于本发明的方法中。如本文所用“变性剂(denaturing agent或denaturant) ”定义为可引起蛋白可逆打开的任何化合物或物质。可以通过特定变性剂的性质和浓度来确定变性剂的强度。 合适的变性剂可以是离液剂、去污剂、有机溶剂、与水混溶的溶剂、磷脂或两种或两种以上这些试剂的组合。合适的离液剂包括(但不限于)尿素、胍和硫氰酸钠。可用的去污剂可以包括(但不限于)强去污剂，例如十二烷基硫酸钠和聚氧乙烯醚类(例如Tween或 Triton去污剂)，N-十二烧基肌氨酸钠(Sarkosyl);温和非离子去污剂(例如洋地黄阜式 (digitonin));温和阳离子去污剂，例如N-> 2，3-( 二油酰氧基)-丙基-N，N, N-三甲基铵；温和离子去污剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子去污剂，包括(但不限于)含磺基甜菜碱类(sulfobetaine) (Zwittergent)、3_ (3_胆酰胺丙基丙基)二甲基胺-I-丙硫酸盐(3-(3-chlolamidopropyl) dimethylammonio-l-propane sulfate, CHAPS)和 3-(3-胆酰胺丙基丙基)二甲基胺-2-轻基-I-丙磺酸盐(3-(3-chlolamidopropyl) dimethylammo nio-2-hydroxy-l-propane sulfonate, CHAPS0)。可以将与水混溶的有机溶剂,例如乙腈、 较低碳数烷醇(尤其是C2-C4烷醇，例如乙醇或异丙醇)或较低碳数烷二醇(尤其是C2-C4烷二醇，例如乙二醇)用作变性剂。可用于本发明的磷脂可以是天然发生磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇或合成磷脂衍生物或变体，例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。如本文所用“重新折叠(refolding) ”描述将含有二硫键的多肽从不恰当折叠状态或打开状态转化成关于二硫键的天然或恰当折叠构象的任何过程、反应或方法。如本文所用“共折叠”具体是指采用至少两个相互作用的多肽且导致打开或不恰当折叠多肽转化成天然、恰当折叠多肽的重新折叠过程、反应或方法。抗体是指对特异性抗原展示结合特异性的蛋白。天然抗体通常为约150，000道尔顿的异源四聚糖蛋白，其由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链组成。各轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。各重链在一端具有可变域(Vh)，接种是许多恒定域。各轻链在一段具有可变域而在另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，而轻链可变域与重链可变域对齐。人们认为，特定氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。术语“可变”事实上是指不同抗体之间可变域的某些部分的序列广泛不同，并且负责各特定抗体与其特定抗原的结合特异性。然而，可变性并非在抗体的可变域中均匀分布。 其集中在轻链和重链可变区域中三个称为互补决定区(CDR)的节段内。更为高度保守的可变域部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各包含四个大部分采用β片层构型的由三个或四个⑶R连接的FR区，其形成环接，且在一些情况下形成部分β片层结构。各链中的CDR由FR区紧密地固持在一起，与其它链的CDR —起促使形成抗体的抗原结合位点 (参看 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定域并不直接涉及抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子功能。视重链恒定区的氨基酸序列而定，可以将抗体或免疫球蛋白指派为不同类别。存在五类主要免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有几类可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgGl、 IgG2、IgG3和IgG4 ;IgAl和IgA2。对应不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、 ε、Y和μ。在各种人类免疫球蛋白类别中，仅已知人IgGl、IgG2、IgG3和IgM激活补体。抗体活体内亲和力成熟受较高亲和力抗体变体的抗原选择所驱动，所述较高亲和力抗体变体主要是通过体细胞超突变(somatic hypermutagenesis)而制得。“组成部分转变(r印ertoire shift) ”也通常发生，其中发现再次应答或第三次应答的主要胚系基因 (germline gene)不同于初次或再次应答的那些。可以通过活体外向抗体基因中引入突变且使用亲和选择法分离具有改进亲和力的突变体来复制免疫系统的亲和力成熟过程。所述突变体抗体可以展示在丝状细菌噬菌体或微生物(例如酵母)的表面上，并且可以通过抗体与抗原的亲和力或通过抗体与抗原解离的动力学(解离速率(off-rate))来选择抗体。Hawkins等人，J. Mol. Biol. 226 889-896(1992)。已经采用Q)R步移突变(walking mutagenesis)来使结合人免疫缺陷病毒I型(HIV-I)的人包膜糖蛋白gpl20的人抗体(Barbas III等人，PNAS(USA)91 3809-3813 (1994)；和 Yang 等人，J. Mol. Biol. 254 :392-403 (1995))和抗 c-erbB-2 单链 Fv片段(Schier等人，J. Mol. Biol. 263 :551567(1996))亲和力成熟。已经采用抗体链改组(clain shuffling)和⑶R突变来使针对HIV第三超变环的高亲和力人抗体亲和力成熟(Thompson 等人 J. Mol. Biol. 256 :77-88 (1996))。Balint 和 Larrick Gene 137 109-118(1993)描述计算机辅助的寡脱氧核苷酸扫描突变，进而同时且彻底地搜索可变区基因的所有CDR的改进变体。使用起始有限突变使ανβ 3特异性人源化抗体亲和力成熟， 其中所有六个CDR的每个位置均突变，接着表达并筛选包括最高亲和力突变体的重组文库(Wu 等人 PNAS (USA) 95 :6037-6-42(1998))。在 Chiswell 和 McCafferty TIBTECH 10: 80-84(1992);和 Rader 和Barbas III Current Opinion in Biotech. 8 :503-508 (1997)中评述了噬菌体展示抗体。在上述参考文献报导与亲代抗体相比具有改进亲和力的突变体抗体的各情况下，突变体抗体在CDR中具有氨基酸替换。本文“亲和力成熟”是指增强抗体与其抗原亲和力的过程。亲和力成熟方法包括 (但不限于)计算筛选法和实验法。本文“抗体”是指由一个或一个以上实质上由所有或部分抗体基因编码的多肽组成的蛋白。免疫球蛋白基因包括(但不限于)K、λ、α、Y (IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、 ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。本文抗体是指包括全长抗体和抗体片段，且包括天然存在于任何生物体中或经遗传工程操作(例如变体)的抗体。“抗体片段”是指除全长形式之外的任何形式抗体。本文抗体片段包括存在于全长抗体内的较小组分的抗体，和经过遗传工程操作的抗体。抗体片段包括(但不限于)Fv、Fe、Fab和(Fab1)2、单链Fv(scFv)、微型双功能抗体、微型三功能抗体、微型四功能抗体、双功能杂交抗体、⑶RU⑶R2、⑶R3、⑶R的组合、可变区、框架区、恒定区等等 (Maynard & Georgiou,2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2 :339-76 ；Hudson,1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9 :395-402)。本文“计算筛选法”是指在蛋白中涉及一个或一个以上突变的任何方法，其中所述方法采用计算机来评价潜在氨基酸侧链替换之间相互作用和/或与蛋白剩余部分相互作用的能量。本文“Fe”是指包含免疫球蛋白域C Y 2和C Y 3 (C Y 2和C Y 3)的抗体部分。Fe也可以包括存在于C Y 2与C Y I (C Y I)之间N端铰链内的任何残基。Fe可以指分离的所述区，或者在抗体或抗体片段内容中的所述区。Fe也可以包括任何经修饰形式的Fe，其包括 (但不限于)天然单体、天然二聚体(经二硫键连接)、经修饰二聚体(经二硫键和/或非共价键连接)和经修饰单体(即，衍生物)。本文“全长抗体”是指构成抗体H和/或L链的天然生物形式的结构。在包括人和小鼠的大部分哺乳动物中，所述形式为四聚体，且由两对相同的两个免疫球蛋白链组成， 各对具有一条轻链和一条重链，各轻链包含免疫球蛋白域 '和Q，且各重链包含免疫球蛋白域Vh、Cy1、Cy2和Cy3。在各对中，轻链可变区与重链可变区(Vi^PVh) —起负责结合抗原，且恒定区((^、(^1、(^2和(^3，尤其是(^2和(^3)负责抗体效应子功能。在例如骆驼(camel)和美洲驼(llama)的一些哺乳动物中，全长抗体可以仅由两条重链组成，各重链包含免疫球蛋白域VH、C Y 2和C Y 3。本文“免疫球蛋白(Ig) ”是指由一个或一个以上实质上由免疫球蛋白基因所编码的多肽组成的蛋白。免疫球蛋白包括(但不限于)抗体。免疫球蛋白可以具有许多结构形式，其包括(但不限于)全长抗体、抗体片段和个别免疫球蛋白域，包括(但不限于)VH、Cy I、C Y 2、C Y 3、Vl 和 CL。本文“免疫球蛋白(Ig)域”是指由实质上由免疫球蛋白基因所编码的多肽组成的蛋白域。如图I所示，Ig域包括(但不限于)VH、C Y I、C Y 2、Cy 3、\和Cp本文所用“变体蛋白序列”是指具有一个或一个以上与另一相似蛋白序列在氨基酸一致性上有所不同的蛋白序列。所述相似蛋白序列可以是天然野生型蛋白序列，或者是野生型序列的另一个变体。一般来说，起始序列称为“亲代”序列，并且可以是野生型或变体序列。举例来说，本发明的优选实施例采用人源化亲代序列，已对所述人源化亲代序列进行计算分析以产生变体。本文抗体的“可变区”是指包含Vh免疫球蛋白域、' 免疫球蛋白域或Vh和\免疫球蛋白域的多肽(包括变体)，如图I所示。可变区可以指分离形式的所述多肽，如Fv片段、如scFv片段、如较大抗体片段内容中的此区，或如全长抗体或替代的、非抗体骨架分子的内容中的此区。本发明也可以用于从许多来源获得的抗体。抗体可以实质上由来自任何生物体的抗体基因所编码，所述生物体包括(但不限于)人、小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼、单峰骆驼、猴，尤其是哺乳动物，尤其是人，并且尤其是小鼠和大鼠。在一个实施例中，所述抗体可以是全人抗体，例如通过使用转基因小鼠或其它动物(Bruggemann & Taussig, 1997,Curr. Opin. Biotechnol. 8 :455-458)或人抗体文库结合选择法(Griffiths & Duncan, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9 :102-108)从患者或受检者中所获得的。抗体可以来自任何来源，包括人工或天然发生。举例来说，本发明采用包括(但不限于)嵌合抗体和人源化抗体(Clark，2000，Immunol. Today 21 :397-402)的经遗传工程操作的抗体，或来源于重组文库。此外，经最优化的抗体可以是实质上由一个或一个以上天然抗体基因所编码的抗体的经遗传工程操作的变体。举例来说，在一个实施例中，经最优化的抗体可以是已经通过亲和力成熟所鉴别的抗体。就本发明的ABP而言，术语“抗原特异性”或“特异性结合”是指结合抗原或所感兴趣的结合伴侣的一个或一个以上抗原决定基，但实质上不识别且结合含有混合抗原群体的样品中的其它分子的ABP。本文所用术语“双特异性ABP”或“多特异性ABP”是指包含两个或两个以上抗原结合位点或结合伴侣结合位点的ABP，第一结合位点具有与第一抗原或抗原决定基的亲和力， 且第二结合位点具有与第一个不同的与第二抗原或抗原决定基的亲和力。如本文所用术语“抗原决定基”是指抗原或结合伴侣上由ABP所识别的位点。如果抗原包含多肽，则抗原决定基可以是线性或构象形成序列或外形的氨基酸。抗原决定基也可以是ABP所结合的任何类型抗原上的任何位置。如本文所用“抗原结合多肽”或“ABP”应包括具有至少特异性结合特定结合伴侣 (如抗原)的生物活性的多肽和蛋白，以及ABP类似物、ABP异构形式、ABP模拟物、ABP片段、杂交ABP蛋白、融合蛋白、寡聚体和多聚体、同源物、糖基化型变体和突变型蛋白，而无论其生物活性如何，且进一步无论其合成或制造方法如何，所述方法包括(但不限于)重组 (无论是否产自cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式核酸)、活体外、活体内、通过微注射核酸分子、合成、转基因和基因活化方法。ABP的具体实例包括(但不限于)抗体分子、重链、轻链、可变区、001 、？&13、8(^1替代性骨架非抗体分子、配体、受体、肽和结合抗原的任何氨基酸序列。术语“ABP”或“抗原结合多肽”是指上述ABP，以及保留天然发生抗体的至少一种生物活性(包括(但不限于)除抗原结合外的活性)的多肽。除抗原结合外的活性包括 (但不限于)任何一种或一种以上与Fe相关的活性。抗原结合多肽包括天然发生人ABP的医药学上可接受的盐和前药、和盐的前药、 多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体以及天然发生人类 ABP的激动剂、模拟物和拮抗剂变体及其多肽融合体。术语“抗原结合多肽”涵盖在氨基端、 羧基端或两者处均包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)例如，甲硫氨酰基ABP (其中蛋氨酸连接于由重组表达得到的ABP的N端)、用于纯化目的的融合体(包括(但不限于)多聚组氨酸或亲和力抗原决定基)、用于将ABP连接于生物活性分子目的的融合体、与血清白蛋白结合肽的融合体，和与血清蛋白(血清白蛋白)的融合体。术语“抗原”或“结合伴侣”是指由ABP所表现的结合活性的目标的物质。事实上任何物质都可以是ABP的抗原或结合伴侣。抗原或结合伴侣的实例包括(但不限于)α -I 抗胰蛋白酶、血管抑素(Angiostatin)、抗溶血因子(Antihemolytic factor)、抗体、载脂蛋白(Apolipoprotein)、脱辅基蛋白(Apoprotein)、心房利钠因子(Atrial natriuretic factor)、心房利钠多妝(Atrial natriuretic polypeptide)、心房妝(Atrial peptide)、 C-X-C 趋化因子(C-X-C chemokine)(例如 T39765、NAP-2、ENA-78, Gro_a、Gro_b、Gro_c、 IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-U PF4、MIG)、降钙素(Calcitonin)、CC 趋化因子(例如单核细胞趋化蛋白-I、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-I α、 单核细胞炎性蛋白-I β、RANTESU309, R83915、R91733、HCCU Τ58847、D31065、Τ64262)、 0)40配体、C-kit配体、胶原质、集落刺激因子(Colony stimulating factor, CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体I、细胞因子(例如上皮中性粒细胞激活肽-78、GR0/MGSA、 GRO、GRO、MIP-U MIP-U MCP-1)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(Erythropoietin， “EP0”)、脱落毒素(Exfoliating toxin)A 和 B、因子 IX、因子 VII、因子 VIII、因子 X、 成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor, FGF)、血纤蛋白原(Fibrinogen)、 粘连蛋白(Fibronectin)、G-CSF> GM-CSF> 葡糖脑苷脂酶(Glucocerebrosidase)、促性腺素(Gonadotropin)、生长因子、刺猬蛋白(Hedgehog protein)(例如 Sonic、Indian、 Desert)、血红蛋白(Hemoglobin)、肝细胞生长因子受体(Hepatocyte Growth Factor, HGF)、水蛭素(Hirudin)、人血清白蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)、干扰素(例如 IFN- α、IFN- β、IFN- Y )、白细胞间素(例如 IL-1、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12 等等)、角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor, KGF)、乳铁蛋白(Lactoferrin)、白血病抑制因子、突光素酶(Luciferase)、神经营养因子(Neurturin)、嗜中性粒细胞抑制因子(Neutrophil inhibitory factor, NIF)、抑瘤素 M (oncostatin Μ)、成骨蛋白(Osteogenic protein) > 甲状旁腺激素、PD-ECSF, TOGF、肽激素(例如人生长激素)、调理素(Pleiotropin)、蛋白质A、蛋白质G、热原性外毒素A、B和C、松弛素(Relaxin)、肾素(Renin)、SCF、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM I、可溶性白细胞介素受体(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、 14、15)、可溶性TNF受体、生长介素(Somatomedin)、生长抑素(Somatostatin)、生长激素(Somatotropin)、链激酶(Streptokinase)、超抗原(Superantigen),即，葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SECl、SEC2、SEC3、SED、SEE)、超氧化物歧化酶、毒性休克综合征毒素(Toxic shock syndrome toxin, TSST-l)、胸腺素α I、组织纤维蛋白酶原激活剂、肿瘤坏死因子 β (TNF-β )、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子a (TNF-α )、血管内皮生长因子 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGEF)、尿激酶以及其它。这些蛋白中许多是市售的(参看例如Sigma BioSciences 2002目录和价格单)， 并且对应蛋白序列和基因和其通常的许多变体是众所周知的(参看例如Genbank)。其它抗原或结合伴侣包括(但不限于)转录和表达激活剂。转录和表达激活剂实例包括调节细胞生长、分化、调控等等的基因和蛋白。表达和转录激活剂发现于提供广泛治疗靶标的原核生物、病毒和真核生物中，包括真菌、植物和动物，包括哺乳动物。应了解表达和转录激活剂通过许多机制调节转录，例如通过结合受体、刺激信号转导级联、调控转录因子的表达、结合启动子和增强子、结合与启动子和增强子结合的蛋白、解链DNA、剪接pre-mRNA、聚腺苷化RNA和降解RNA。抗原或结合伴侣包括(但不限于)表达激活剂， 例如细胞因子、炎性分子、生长因子、其受体和致癌基因产物，例如白细胞介素(例如IL-1、 EL-2、IL-8 等等)、干扰素、FGF、IGF-I、IGF-I I, FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、 KGF, SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、I CAM-1/LFA-I 和 hyalurin/CD44 ;信号转导分子和对应致癌基因产物，例如Mos、Ras、Raf和Met ;和转录激活剂和抑制剂，例如p53、 Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel和类固醇激素受体，例如雌激素、黄体激素、睾丸激素、醛固酮 (aldosterone)、LDL受体配体和皮质酮的类固醇激素受体。疫苗蛋白可以是抗原或结合伴侣，其包括(但不限于)来自传染性真菌的蛋白，例如曲霉(Aspergillus)、念珠菌(Candida)属；来自细菌的蛋白，尤其是充当病原细菌模型的大肠杆菌以及医药学上重要的细菌，例如葡萄球菌(Staphylococci)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococci aureus))或链球菌(Streptococci)(例如肺炎鏈球菌(Streptococci pneumoniae));来自原生动物的蛋白，例如孢子虫(sporozoa)(例如痕原虫(Plasmodia))、根足虫(rhizopod)(例如内阿米巴(Entamoeba))和鞭毛虫 (flagellate)(维虫(Trypanosoma)、利什曼虫(Leishmania)、毛滴虫(Trichomonas)、 贾第鞭毛虫(Giardia)等等)；来自病毒的蛋白，例如⑴RNA病毒(实例包括痘病毒 (Poxviruses),例如牛痘(vaccinia);微小核糖核酸病素(Picornaviruses),例如脊髓灰质炎(polio);披衣病毒(Togaviruses),例如风疫(rubella);黄病毒(Flaviviruses),例如 HCV ;和冠病毒(Coronaviruses)、(-)RNA 病毒(例如棒状病毒(Rhabdoviruses)JSl^PI VSV ;副粘病毒(Paramyxovimses)JfI^P RSV ;正粘病毒(Orthomyxovimses),例如流行性感冒病毒(influenza);本杨病毒(Bunyavirus);和砂粒病毒(Arenaviruses) )、dsDNA 病毒 (例如呼肠孤病毒(Reovirus))、RNA至DNA病毒，即逆转录酶病毒(Retro virus)，例如HIV 和HTLV，和某些DNA至RNA病毒，例如乙型肝炎病毒。抗原或结合伴侣可以是酶，其包括(但不限于)酰胺酶、氨基酸消旋酶、酰基转移酶、脱卤素酶、加双氧酶、二芳基丙烷过氧化物酶、差向异构酶、环氧化物水解酶、酯酶、异构酶、激酶、葡萄糖异构酶、糖苷酶、糖基转移酶、卤素过氧化物酶、单加氧酶(例如p450s)、 脂肪酶、木质素过氧化物酶、腈水合酶、腈水解酶、蛋白酶、磷酸酯酶、枯草杆菌蛋白酶 (subtilisin)、转氨酶和核酸酶。农业相关性蛋白，例如抗昆虫蛋白(例如Cry蛋白)、产生淀粉和脂质的酶、植物和昆虫毒素、抗毒素蛋白、霉菌菌素(Mycotoxin)解毒蛋白、植物生长酶(例如核酮糖1，5_ 二憐酸羧化酶/加氧酶，Ribulose I, 5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase,“RUBISC0”)、 脂加氧酶(lipoxygenase, LOX)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)羧化酶也可以是抗原或结合伴侣。举例来说，抗原或结合伴侣也可以是疾病相关性分子，例如肿瘤表面抗原，例如B 细胞个体基因型、恶性B细胞上的⑶20、白血病胚细胞上的⑶33和乳癌上的HER2/neu。或者，抗原或结合伴侣也可以是生长因子受体。生长因子的实例包括(但不限于)表皮生长因子受体(EGF)、转铁蛋白(transferrin)、胰岛素样生长因子、转化生长因子(TGF)、白细胞介素-I和白细胞介素_2。举例来说，已经在多种人类上皮原发性肿瘤中发现EGF受体的高表达。已经发现TGF-α介导癌细胞中自分泌刺激途径。已经证明一些鼠科动物单克隆抗体能够结合EGF受体，阻断配体与EGF受体的结合且抑制培养物和异种移植体模型中多种人癌细胞系的增殖。Mendelsohn 和 Baselga(1995)Antibodies to growth factors and receptors,Biologic Therapy of Cancer,第 2 版，JB Lippincott, Philadelphia,第 607-623页。因此，本发明的ABP可以用于治疗多种癌症。抗原或结合伴侣也可以是与冠状动脉疾病相关的细胞表面蛋白或受体(例如血小板糖蛋白Iib/IIIa受体)、与自体免疫疾病相关的细胞表面蛋白或受体(例如CD4、 CAMPATH-1和格兰(gram)阴性细菌脂多糖的脂质A区)。已经在治疗患有蕈样肉芽肿 (Mycosis fungoides)、泛发性胺疱型银屑病(generalized postular psoriasis)、严重牛皮癣和类风湿性关节炎的患者的临床试验中测试抗CD4的人源化抗体。已经在脓毒性休克 (septic shock)的治疗中临床测试了抗格兰阴性细菌脂多糖的脂质A区的抗体。也已经在难愈性类风湿性关节炎的治疗中临床测试了抗CAMPATH-1的抗体。因此，本发明的ABP可以用于治疗多种自体免疫疾病。Vaswani 等人(1998) " Humanized antibodies as potential therapeutic drugs" Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105-115。抗原或结合伴侣也可以是与人类过敏疾病相关的蛋白或肽，例如炎性介导蛋白， 例如白细胞介素-I (IL-I)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞三烯受体及5-脂加氧酶，和粘附分子，例如V-CAM/VLA-4。此外，因为IgE在例如哮喘的I型立即超敏变态反应中起至关重要的作用，所以IgE也可以充当抗原或结合伴侣。研究表明，总血清IgE的含量趋向于与疾病 (尤其是在哮喘中)的严重程度相关。Burrows等人(1989) " Association of asthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens" New Engl. L. Med. 320 271-277。因此，在治疗过敏疾病中针对IgE所选择的ABP可以用于降低IgE含量或阻断 IgE与肥大细胞和嗜碱细胞的结合，而不实质地影响正常免疫功能。抗原或结合伴侣也可以是能够充当引发宿主免疫应答的抗原的病毒表面或核心蛋白。这些病毒蛋白的实例包括(但不限于)糖蛋白(或表面抗原，例如GP120和GP41) 和衣壳蛋白(或结构蛋白，例如P24蛋白)；表面抗原或甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒的核心蛋白(例如乙型肝炎病毒的小乙型肝炎表面抗原(small hepatitis B surface antigen, SHBsAg)和丙型肝炎病毒的核心蛋白，NS3、NS4和NS5抗原)；呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus, RSV)的糖蛋白(G蛋白)或融合蛋白(F蛋白)；单纯疱疫病毒HSV-I和HSV-2的表面和核心蛋白(例如来自HSV-2的糖蛋白D)。抗原或结合伴侣也可以是丧失其肿瘤抑制功能且能够使细胞对癌症更为易感的突变肿瘤抑制剂基因产物。肿瘤抑制剂基因是抑制细胞生长和分裂周期并因此阻止新生瘤发育的基因。肿瘤抑制剂基因中的突变引起细胞忽视抑制信号网络中的一个或一个以上组分，从而克服细胞周期检查点并导致较高的受控细胞生长(癌症)速率。肿瘤抑制剂基因的实例包括(但不限于)DPC-4、NF-I、NF-2、RB、p53、WTl、BRCAl 和 BRCA2。DPC-4涉及胰腺癌并且参与抑制细胞分裂的细胞质途径。NF-I编码抑制Ras的蛋白-一种细胞质抑制蛋白。NF-I涉及神经系统和骨髓白血病的纤维神经瘤(neurofibroma) 和嗜铬细胞瘤(pheochromocytomas)。NF-2编码涉及神经系统的脑膜瘤(meningioma)、雪旺氏瘤(schwanoma)和室管膜瘤(ependymoma)中的核蛋白。RB编码pRB蛋白，pRB蛋白是细胞周期主要抑制剂的核蛋白。RB涉及视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)以及骨癌、膀胱癌、小细胞肺癌和乳癌。P53编码调控细胞分裂且可以诱导细胞凋亡的p53蛋白。在许多癌症中发现P53的突变和/或不活动。WTl涉及肾脏的肾母细胞瘤(Wilms tumor)。BRCAl 涉及乳癌和卵巢癌，而BRCA2涉及乳癌。因此，ABP可以用于阻断基因产物与肿瘤发生和发展途径中其它蛋白和生物化学物质的互作。抗原或结合伴侣可以是⑶分子，其包括(但不限于)⑶IaXDlb、⑶IcXDld、⑶2、 CD3 Y , CD3 δ、CD3 ε、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8 α、CD8 β、CD9、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、 CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、 CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、 CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45R、CD46、CD47、CD48、CD49a、 CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、 CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、 CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79 a、 CD79 β、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、 CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、 CD107a、CD107b、CDw108, CDw109, CD110-113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、 CD120a、CD 120b, CD121a、CD121b、CD122、CD123、CDw 124, CD125、CD126、CDwl27、CDw 128a, CDwl28b、CD129、CDwl30、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CDwl37、CD138、CD139、 CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDwl45、CD146、CD147、CD148、CDwl49、CD150、 CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD 158b, CD161、CD162、CD163、 CD164、CD165、CD166 和 TCR ζ。抗原或结合伴侣可以是 VEGF、VEGF 受体、EGFR、Her2、TNFa、 TNFRI 受体、GPIIb/IIla、IL-2Ra 链、ILU 链、RSV F 蛋白、a 4 整合素、IgE、IgE 受体、 地高辛(dioxin)、锯鳞蜂蛇毒(carpet viper venom)、补体C5、0PGL、CA-125肿瘤抗原、葡萄球菌蛋白、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)蛋白、金黄色葡萄球菌蛋白、葡萄球菌感染相关蛋白(包括(但不限于)金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)、IL-6受体、 CTLA-4、RSV、IL-2受体Tac亚单位、IL-5和EpCam。抗原或结合伴侣可以是分子片段。双特异性ABP的实例包括(但不限于)其中一个ABP针对肿瘤细胞抗原而另一个ABP针对细胞毒性引发分子的双特异性ABP，例如抗Fe Y RI/抗CD 15、抗pl85HEK2/ Fe Y RIII (CD 16)、抗 CD3/ 抗恶性 B 细胞(1D10)、抗 CD3/ 抗p 185臓、抗 CD3/ 抗 p97、抗 CD3/ 抗肾细胞癌、抗⑶3/抗0VCAR-3、抗⑶3/L-D1 (抗结肠癌)、抗⑶3/抗黑素细胞刺激素类似物、抗EGF受体/抗⑶3、抗⑶3/抗CAMAl、抗⑶3/抗⑶19、抗⑶3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(folate binding protein, FBP) / 抗 CD3、抗泛癌相关抗原(pan carcinoma associated antigen, AM0C-31) / 抗CD3 ;—个ABP特异性结合肿瘤抗原而另一个ABP结合毒素的双特异性ABP，例如抗肥皂草毒素(saporin) /抗Id-I、抗⑶22/抗肥皂草毒素、抗⑶7/抗肥皂草毒素、抗⑶38/抗肥皂草毒素、抗CEA/抗蓖麻毒素A链、抗干扰素-α (IFN- α ) /抗杂交瘤个体基因型、抗CEA/ 抗长春花属生物碱(vinca alkaloid);用于转化酶活化前药的双特异性ABP，例如抗⑶30/ 抗碱性磷酸酶(催化磷酸丝裂霉素(mitomycin phosphate)前药转化成丝裂霉素醇)；可以用作纤溶剂(fibrinolytic agent)的双特异性ABP,例如抗纤维蛋白/抗组织纤维蛋白酶原激活剂(tPA)、抗纤维蛋白/抗尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA);用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的双特异性ABP，例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fe受体(例如FcyRI、 Fe Y RII或Fe Y RIII);用于治疗传染疾病的双特异性ABP，例如抗⑶3/抗单纯疱疹病毒 (HSV)、抗T-细胞受体CD3复合物/抗流行性感冒病毒、抗Fe Y R/抗HrV ;用于活体外或活体内肿瘤检测的双特异性ABP，例如抗CEA/抗E0TUBE、抗CEA/抗DPTA、抗pl85HEK2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的双特异性ABP (参看Fanger, Mff等人，Crit Rev Immunol. 1992 ； 12(3-4) : 101-24，其以引用的方式并入本文)；和作为诊断工具的双特异性ABP，例如抗兔 IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP) /抗激素、抗生长抑素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、 抗CEA/抗 β-半乳糖苷酶(参看Nolan,O et R. O' Kennedy,Biochim Biophys Acta. 1990 年8月I日；1040 (I) : 1-11，其以引用的方式并入本文)。三特异性ABP的实例包括抗⑶3/ 抗 CD4/ 抗 CD37、抗 CD3/ 抗 CD5/ 抗 CD37 和抗 CD3/ 抗 CD8/ 抗 CD37。各种参考文献公开了通过聚合物结合或糖基化进行多肽修饰。术语“ABP”或“抗原结合多肽”包括(但不限于)与例如PEG等聚合物结合的多肽，且可以包含半胱氨酸、赖氨酸、N或C端氨基酸或其它残基的一种或一种以上其它衍生作用。此外，ABP可以包含连接子、聚合物或生物活性分子，其中连接子、聚合物或生物活性分子所结合的氨基酸可以是根据本发明的非天然发生氨基酸，或者可以采用例如与赖氨酸或半胱氨酸偶联等所属领域中已知的技术而与天然编码氨基酸结合。美国专利第4，904，584号中公开了耗尽PEG 化赖氨酸的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已经缺失或者用任何其它氨基酸残基替换。WO 99/67291公开了一种将蛋白与PEG结合的方法，其中蛋白上的至少一个氨基酸缺失，且所述蛋白在足以达到与蛋白结合的条件下接触PEG。WO 99/03887公开了属于生长激素超家族的多肽的PEG化变体，其中半胱氨酸残基由位于多肽指定区域的非必需氨基酸残基替换。WO 00/26354公开一种制造与包含至少一个其它糖基化位点的对应母体多肽相比，具有低致敏性的糖基化多肽变体的方法。术语“抗原结合多肽”也包括糖基化ABP，例如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、经N连接或O连接糖基化形式的多肽。含有单核苷酸改变的变体也被认为是ABP的生物活性变体。此外，也包括剪接变体。术语“抗原结合多肽”也包括任何一个或一个以上ABP的ABP异源二聚体、同源二聚体、异源多聚体或同源多聚体或任何其它多肽、 蛋白、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配体或其它任何类型的生物活性分子(通过化学方法连接或表达为融合蛋白)，以及含有(例如)特定缺失或其它修饰但仍保留生物活性的多肽类似物。在一些实施例中，抗原结合多肽进一步包含调节ABP生物活性的添加、替换或缺失。举例来说，添加、替换或缺失可以调节ABP的一种或一种以上特性或活性(包括(但不限于)调节与抗原的亲和力)；调节(包括(但不限于)增加或降低)抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；稳定抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；诱导或引起抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；调节循环半衰期；调节治疗半衰期；调节多肽稳定性；调节剂量；调节释放或生物可用性；促进纯化；或改进或改变特定投药途径。同样，抗原结合多肽可以包含蛋白酶裂解序列、反应基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或 poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等等)或改进多肽的缺失(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特性的连接分子(包括(但不限于)生物素)。术语“抗原结合多肽”也涵盖经连接的ABP同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体，包括(但不限于)直接经非天然编码氨基酸侧链连接于相同或不同非天然编码氨基酸侧链或连接于天然编码氨基酸侧链作为融合体或间接经连接子连接的那些。示范性连接子包括(但不限于)小有机化合物、多种长度的水溶性聚合物，例如聚乙二醇或聚葡萄糖(polydextran),或各种长度的多肽。所属领域技术人员应了解可以在抗原结合多肽或相关抗原结合多肽等的片段中轻易地鉴别出对应特定抗原结合多肽序列中位置的氨基酸位置。举例来说，可以使用例如 BLAST的序列比对程序比对并鉴别蛋白中符合相关序列中位置的特定位置。术语“抗原结合多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸替换、添加或缺失的抗原结合多肽。本发明的抗原结合多肽可以包含用一个或一个以上天然氨基酸的修饰以及一个或一个以上非天然氨基酸修饰。已经描述天然发生ABP多肽中多种氨基酸位置中的示范性替换，其包括(但不限于)调节抗原结合多肽中一种或一种以上生物活性的替换，例如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转化成拮抗剂等等，并且由术语“ABP”所涵盖。“非天然编码氨基酸”是指并非20种常见氨基酸或焦赖氨酸(pyrolysine)或硒半胱氨酸(selenocysteine)中之一种的氨基酸。其它可以与术语“非天然编码氨基酸”同义地使用的术语是“非天然氨基酸(non-natural amino acid) ”、“非天然氨基酸(unnatural amino acid) ”、“非天然发生氨基酸”和其各种带有连字符和不带连字符的形式。术语“非天然编码氨基酸”也包括(但不限于)通过修饰(例如，翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或焦赖氨酸和硒半胱氨酸)但自身并非通过翻译复合体天然并入生长中多肽链中所发生的氨基酸。所述非天然发生氨基酸的实例包括(但不限于) N-乙酰氨基葡萄糖基-L-丝氨酸(N-acetylglucosaminyl-L-serine)、N_乙酰氨基葡萄糖基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。“氨基端修饰基”是指可以连接于多肽氨基端的任何分子。“羧基端修饰基”相似地是指可以连接于多肽羧基端的任何分子。末端修饰基包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白(例如血清白蛋白)或其它增加肽的血清半衰期的部分。术语“官能团”、“活性部分”、“活性基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应基” 和“化学反应部分”用于所属技术领域和本文中，是指分子独特的、可定义的部分或单位。所述术语在化学领域有时是同义的，且在本文中用来表示执行一些功能或活性并且具有与其它分子的反应性的分子部分。
本文所用术语“键(linkage) ”或“连接子(linker) ”是指由于化学反应而通常所形成的并且通常为共价键的基团或键(bond)。水解稳定键是指键在水中实质上稳定，且在可用PH值下不与水反应，其包括(但不限于)在生理条件下的长反应时间，可能甚至是无限的。水解不稳定或可降解键是指所述键在水或水溶液中(例如血液)可降解。酶不稳定或可降解的键是指所述键可以由一种或一种以上酶降解。如所属技术领域所了解，PEG和相关性聚合物可以在聚合物骨架或连接子基团中在聚合物骨架与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间包括可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活性PEG羧酸与生物活性剂上醇基团之间反应所形成的酯键通常在生理条件下水解以释放所述试剂。其它水解可降解键包括(但不限于)羧酸酯键；由胺与醛反应所生成的亚胺键；醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键；为酰肼与醛反应产物的腙键；为醛与醇反应产物的缩醛键；为甲酸酯与醇反应产物的原酸酯键；由胺基(包括(但不限于)在例如PEG的聚合物的末端)与肽的羧基所形成的肽键；和由亚磷酰胺基(包括(但不限于)在聚合物的末端)与寡核苷酸5' 羟基所形成的寡核苷酸键。支链连接子可用于本发明的抗原结合多肽中。本文所用术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”是指能够影响生物系统、途径、分子或涉及生物体(包括(但不限于)病毒、细菌、细菌噬菌体、转座子、 朊病毒(prion)、昆虫、真菌、植物、动物和人类)的互作的任何物理或生物化学性质的任何物质。具体来说，如本文所用生物活性分子包括(但不限于)用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物体内疾病或者另外增强人类或动物体身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白、酶、小分子药物、硬药物(hard drug)、软药物(soft drug)、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒 (microparticle)和微胞(micell)。适于结合本发明使用的生物活性剂种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显象剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、抗炎性剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物衍生毒素等等。在某些实施例中，本发明的ABP分子可以用于将生物活性分子或可检测标记针对肿瘤位点。这有助于肿瘤杀死、检测和/或定位或其它作用。诊断探针或成像探针也可以连接于本发明的ABP分子。在某些特别优选的实施例中，ABP的生物活性分子组分是“不透射线(rediopaque) ”标记,例如能够使用(例如)x光轻易显现的标记。不透射线物质为所属领域技术人员所熟知。最常用的不透射线物质包括碘化物、溴化物或钡盐。其它不透射线物质也是已知的，包括(但不限于)有机铋衍生物(参看，例如美国专利第5，939，045 号)、不透射线多尿烧(multiurethane)(参看,例如美国专利第5，346，981号)、有机秘络合物(参看，例如美国专利第5，256，334号)、不透射线钡多聚体络合物(参看，例如美国专利第4，866，132号)等等。本发明的ABP可以直接与不透射线部分偶联，或者其可以连接于载运或含有不透射线物质的“包装(package) ” (例如螯合剂、脂质体、多聚体微珠等等)。除不透射线标记之外，其它标记也适用于本发明。适合用作本发明ABP的生物活性分子组分的可检测标记包括任何可以由电镜、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学或化学方法检测的成分。可用于本发明中的标记包括磁珠(例如Dynabeads )、荧光染料(例如异硫氰酸突光素、德州红(texas red)、若丹明(rhodamine)、绿色突光蛋白等等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它通常用于ELISA中的酶)和比色标记，例如胶状金或着色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯 (multistyrene)、聚丙烯(multipropylene)、乳胶等等)珠。各种优选放射性标记包括(但不限于)99Tc、2°3Pb、67Ga、68Ga、72AS、mIn、113mIn、97RU、 62Cu,64ICu,52Fe,52mMn,51Cr,186Re,188Re,77As,90Y,67Cu,169Er,121Sn,127Te,142Pr,143Pr,198Au,199Au, 161Tb、109PcU 165Dy、149Pm、151Pm, 153Sm, 157GcU 159GcU 166Ho、172Tm' 169Yb、175Yb、175Yb、177Lu' 105Rh 和 111Ag。检测所述标记的方法为所属领域技术人员所熟知。因此，例如，可以用照相胶片、 闪烁检测器等等检测放射性标记。可以用光检测器检测发光来检测荧光标记。通常通过对底物提供酶并且检测由酶作用于底物上所产生的反应产物来检测酶标记，并且通过简单视觉观察着色标记来检测比色标记。在一些具体实施例中，本发明预期免疫结合物(嵌合部分)用于检测肿瘤和/或其它癌细胞的用途。因此，举例来说，本发明的双特异性抗体可以与Y发光放射性同位素(例如 Na-22、Cr-51、Co-60, Tc_99、1-125、1-131、Cs-137、Ga_67、Mo-99)结合以用 y 相机检测；与正电子发光同位素(例如C-ll、N-13、0-15、F-18等等)结合以在Positron Emission Tomography (PET)仪器上检测；并且与金属对比剂(例如含Gd试剂、含Eu试剂等等)结合以用于核磁成像(MRI)。此外，本发明的双特异性抗体可以用于传统免疫组织化学(例如荧光标记、纳米晶体标记、酶标记和比色标记等等)中。在另一实施例中，生物活性分子可以是增强细胞上致电离辐射(例如可能由6°Co 或X光源产生)的细胞毒性作用的放射增敏剂(radiosensitizer)。许多放射增敏剂是已知的，包括(但不限于)苯并P卜啉(benzoporphyrin)衍生化合物(参看，例如美国专利第5，945，439号)、1，2，4-苯并三嗪氧化物(参看，例如美国专利第5，849，738号)、 含某些二胺的化合物(参看，例如美国专利第5，700, 825号)、BCNT(参看，例如美国专利第5，872，107号)、放射增敏性硝基苯甲酸酰胺衍生物(参看，例如美国专利第4，474，814 号)、各种杂环衍生物(参看，例如美国专利第5，064，849号)、钼络合物(参看，例如美国专利第4，921，963号)等等。生物活性分子也可以是配体，抗原决定基标签、肽、蛋白或另一个ABP。配体和抗体可以结合于免疫细胞上的表面标记。用所述抗体作为生物活性分子的嵌合分子充当在承载配体或ABP的结合伴侣的免疫细胞与表达EGFR家族成员的肿瘤细胞之间建立联系的双功能连接子。尤其在采用预祀向(pre-targeting)策略的情况下,许多本文所述的医药品和/ 或放射性标记可以作为螯合剂的形式提供。螯合分子通常与特异性地结合连接于双特异性和/或多特异性ABP的抗原决定基的分子(例如生物素(biotin)、抗生物素(avidin)、链菌素(streptavidin)等等)偶联。 螯合基为所属领域技术人员所熟知。在某些实施例中，螯合基来源于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、环己基I，2-二胺四乙酸(⑶TA)、乙二醇-0，O'-双 (-2-氨基乙基)-N，N，N' ,N'-四乙酸(EGTA)、N，N-双(羟基苄基)-乙二胺-N，N' -二乙酸(HBED)、三乙四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N'，N"，N'"-四乙酸(DOTA)、羟基乙基二胺三乙酸(HEDTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N'，N"， N'"-四乙酸(TETA)、经取代DTPA、经取代EDTA等等。一些优选螯合剂的实例包括未经取代或经取代2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)和2-亚氨基硫杂环己烷，尤其是2-亚氨基-4-巯基甲基硫烷(2 -imino-4-mercaptomethy lthio lane)和 SAPS (N- (4- [21 IAt]破氏苯乙基)玻拍酸酯 (N-(4-[21IAt]astatophenethyl)succinimate))。一种螯合剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N" W " _四乙酸(DOTA)尤其令人感兴趣，这是由于其螯合许多诊断上和治疗上重要的金属(例如放射性核苷酸和放射性标记)的能力。已经描述DOTA与例如抗体的蛋白的结合物。举例来说，美国专利第5，428，156 号教示将DOTA与抗体和ABP片段结合的方法。为了制备这些结合物，将DOTA的一个羧酸基转化成活性酯，活性酯可以与ABP或ABP片段上的胺或巯基反应。Lewis等人(1994) Bioconjugate Chem. 5 =565-576描述一种相似的方法，其中将DOTA的一个羧基转化成活性酯，并将活性DOTA与ABP混合，将ABP与DOTA经ABP赖氨酸残基的ε氨基连接，进而将 DOTA的一个羧基转化成酰胺部分。或者，可以直接或经连接子将螯合剂偶联于抗原决定基标签或偶联于结合抗原决定基标签的部分。已经描述DOTA与生物素的结合物，参看，例如Su(1995) J. Nucl. Med.， 36(增刊5):第154页，其公开DOTA与生物素经由可用氨基侧链生物素衍生物(例如 DOTA-LC-生物素或DOTA-苄基-4-(6-氨基-己酰胺)-生物素)连接的键。Yau等人， W095/15335公开了一种制造可以与生物素结合的硝基-苄基-DOTA的方法。所述方法包含 经羟基暂时保护的环化反应；胺的甲苯磺酰化作用；暂时受保护羟基的去保护；去保护羟基的甲苯磺酰化作用；和分子内甲苯磺酸酯环化。mi等人，(1992) Nucl. Med. BioL，19 (2) 239-244中公开了一种用于合成用111IN和9°Y放射性标记蛋白的巨环螯合剂的方法。Wu等人制得经标记DOTA-生物素结合物以研究具有抗生物素(用于研究的模型蛋白)的稳定性和生物分布。使用含有游离氨基以与原位生成的活性DOTA衍生物反应的生物素酰肼来制造此结合物。本发明的ABP可以与其它生物活性分子融合，所述其它生物活性分子包括(但不限于)细胞毒药物、毒素、肽、蛋白、酶和病毒(Chester, (2000)Dis. Markers 16 :53-62 ； Rippmann 等人 Biochem J. (2000) Biochem J. 349(部分 3) :805-812, Kreitman, RJ. (2001) Curr.Pharm. Biotechnol. 2 :313-325 ；Rybak, S. Μ. (2001)Expert Opin.Biol. Ther. I 995-1003 ；van Beusechem, V. ff.等人 J. Virol. (2002)76:2753-2762)。有效细胞毒性剂或有效负载(payload)可以结合于ABP，所述ABP靶向且结合在靶细胞(包括(但不限于)癌细胞)上所主要发现的抗原。有效负载剂经血流中稳定的连接子连接于ΑΒΡ，或者在(例如)肿瘤位点在所存在条件下易于裂解。负载剂，例如毒素，被传送到靶细胞，且因此能够通过取决于毒素的机制而起始细胞杀死。这些毒素的实例包括(但不限于)小分子，例如真菌衍生刺孢霉素 (calicheamicin) (Hinman 等人(1993)Cancer Res. 53 :3336-3342)和 maytansinoid(Liu 等人(1996) PNASUSA 93:8618-8623，Smith, S. (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3 (2) 198-203)、trichothene 和 CC 1065 ;或蛋白，例如蓖麻毒素 A 链(Messman 等人(2000) Clin. Cancer Res. 6 (4) : 1302-1313)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin) (Tur 等人 (2001) Intl. J. Mol. Med. 8 (5) :579-584)、白喉毒素(diphtheria toxin) (LeMaistre 等人 (1998)Blood91(2) :399-405)和核糖体失活蛋白(Tazzari 等人(2001)，J. Immunol. 167 4222-4229)。在具体实施例中，可以使用一个或一个以上的刺孢霉素分子。刺孢霉素家族的抗生素的成员能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。也已知刺孢霉素的结构类似物。参看 Hinman 等人,Cancer Research 53:3336-42(1993) ;Lode 等人(1998)Cancer Research58 :2925_28。获得 FDA 批准的免疫毒素的实例为Mylotarg (Wyeth Ayerst)-— 种用于急性骨髓性白血病的刺孢霉素结合抗CD33(Sievers等人，(1999)Blood 93(11) 3678-3684 ；Bernstein (2000) Leukemia 14 :474-475)。本发明的 ABP 可以以类似方式与毒素融合。或者，本发明的ABP可以与肉毒杆菌A神经毒素融合，肉毒杆菌A神经毒素是由细菌肉毒梭状(Clostridium botulinum)所产生的蛋白复合物。在另一实施例中，本发明的ABP可以包含一种或一种以上的酶活性毒素和/ 或其片段。这些毒素的实例包括白喉毒素的非结合活性片段、白喉毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素(abrin) A链、莫迪素 (modeccin) A 链、α -八叠球菌(alpha-sarcin)、康乃馨(dianthin)蛋白、商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAP AII 和 PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin) > sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树素 (gelonin)、mitogellin、restrictoein、酿霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢子菌霉菌毒素(tricothecene)。参看，例如WO 93/21232。尤其优选的细胞毒素包括假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素、蓖麻毒素和相思豆毒素。假单胞菌外毒素和白喉毒素均是熟知的。与PE—样，白喉毒素(DT)通过ADP核糖基化延伸因子2杀死细胞，进而抑制蛋白合成。关于免疫毒素的其它引用文献包括Brinkmann，U. In Vivo 14 :21-28 ;Niv等人(2001) Curr.Pharm. Biotechnol. 2 19-46 ；Reiter 等人 Adv. Cancer Res. 81:93-124 ；Kreitman, R. J. (1999)Curr. Opin. Immunol. , 11 :570-578 ；Hall (2001)Meth. Mol. Biol. 166 :139-154 ； Kreitman (2001) Curr. Opin. Investig. Drugs 2(9) :1282_1293。所属领域技术人员熟知编码与各种配体融合的PE或DT的基因克隆方法(参看，例如Siegall等人(1989)FASEB J.， 3 =2647-2652 ;和 Chaudliary 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 :4538-4542)。所有引用文献均以引用的方式并入本文。其它合适生物活性分子包括药理学试剂或含有各种药理学试剂的封装系统(encapsulation system)。因此，嵌合分子的祀向分子可以直接连接于待直接传递至肿瘤的药物。所述药物为所属领域技术人员所熟知，且包括(但不限于)多柔比星 (doxirubicin)、长春碱(vinblastine)、染料木素(genistein)、反义分子等等。或者，生物活性分子可以是封装系统，例如病毒衣壳、脂质体或含有治疗组合物 (例如药物、核酸(例如反义核酸)或另一种优选经屏蔽以免于直接暴露于循环系统的治疗部分)的微胞。制备连接于抗体的脂质体的方法为所属领域技术人员熟知。参看，例如美国专利第4，957，735号，Connor等人(1985)Pharm. Ther. ,28 :341_365。由于具有抗原特异性，因此本发明的ABP可以用于将装载药物的脂质体送往它们的靶标。参看Park，J. ff.等人(2002) Clin. Cancer Res. 8，1172-1181 和 Shi，N.等人(2001) Pharm. Res. 18，1091-1095。本发明的ABP可以与例如PEG的分子结合以改进活体内传递和药物动力学曲线。Leong等人描述具有优于未PEG化形式的低清除率以及极小或无抗原结合活性丧失的抗IL-8抗体的Fab'片段的位点特异性PEG化(Leong, S. R.等人(2001) Cytoltine 16: 106-119)。
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本发明的ABP可以连接于前药。如本文所用术语“前药”是指活性药物的药理学无活性或低活性的的衍生物。可以对前药进行设计以调节药物或生物活性分子的量从而通过操纵药物的特性(例如物理化学、生物医药学或药物动力学特性)而到达所希望的作用位点。前药在体内经酶反应或非酶反应而转化成活性药物。前药可以提供改进的物理化学特性，例如较佳的溶解性、增强的传递特征，例如特异性靶向于特定细胞、组织、器官或配体， 和改进的药物治疗价值。本发明的ABP可以与酶融合而用于前药活化(K0USpar0U，C.A.等人(2002) Int. J. Cancer 99，138-148)。重组分子可以包含ABP和作用于前药上以释放细胞毒素(例如氰化物)的酶。可以前药形式投用治疗剂，且随后通过将如肽基化学治疗剂的前药转化成活性抗癌药物的前药激活酶来进行活化。参看，例如WO 88/07378、WO 81/01145、美国专利第 4，975，278号。一般来说，酶组分包括任何能够以如将其转化成更具活性的细胞毒性形式的方式作用于前药的酶。可用的酶包括(但不限于)可用于将含磷酸酯前药转化成游离药物的碱性磷酸酶、可用于将含硫酸酯前药转化成游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可用于将含肽前药转化成游离药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶 (subtilisin)、羧基肽酶和组织蛋白酶(cathepsin)(例如组织蛋白酶B和L);可用于转化含D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰基羧基肽酶；可用于将糖基化前药转化成游离药物的碳水化合物裂解酶，例如β -半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将用β -内酰胺衍生的药物转化成游离药物的β_内酰胺酶；和可用于将在其氨基氮处分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可以使用在所属技术领域中又称为“抗体酶(abzyme) ”的具有酶活性的抗体将本发明的前药转化成游离活性药物。参看，例如Massey，(1987)328:457-48。所属领域技术人员应了解，本发明的双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子部分通常可以以任何次序连接在一起。因此，例如当靶向分子是单链蛋白时，生物活性分子可以连接于靶向分子的氨基端或羧基端。生物活性分子也可以连接于双特异性和/或多特异性ABP的内部区，或者相反。同样，双特异性和/或多特异性ABP也可以连接于生物活性分子的内部位置或末端。在任何情况下，选择连接点以致不干扰双特异性和/或多特异性ABP或生物活性分子的个别活性。可以借助所属领域技术人员所熟知的任何许多方式连接双特异性和/或多特异性ABP或生物活性分子。生物活性分子通常直接或经连接子(间隔子)与双特异性ABP结合。然而，当生物活性分子和双特异性ABP均为多肽时，可能需要将嵌合分子重组表达为单链融合蛋白。在一个实施例中，双特异性和/或多特异性ABP化学结合于生物活性分子(例如细胞毒素、标记、配体、药物、ABP、脂质体等等)。化学结合分子的方法为所属领域技术人员所熟知。试剂与ABP或其它多肽靶向分子的连接过程会随试剂的化学结构而有所不同。多肽通常含有多种官能团，例如羧酸(COOH)或游离胺(一NH2)基团，这些官能团可与生物活性分子上的合适官能团反应以于该处与生物活性分子结合。或者，双特异性ABP和/或生物活性分子可以经衍生以暴露或连接其它反应官能团。所述衍生化作用可以涉及连接任何许多连接分子，例如那些获自Pierce Chemical Company, Rockford, 111 的连接分子。在一些情况下，当嵌合部分已经到达其靶位点时，可能需要使生物活性分子从双特异性和/或多特异性ABP游离，或活化前药。因此，当在靶位点释放生物活性分子时，可以使用包含在邻近靶位点处可裂解的键的嵌合结合物。可以通过酶活性或者免疫结合物在靶细胞内或在邻近靶位点中所经受的条件来促进键的裂解以从ABP释放试剂。当靶位点是肿瘤时，可以使用在肿瘤位点处所存在的条件下(例如当暴露于肿瘤相关性酶或酸性pH时) 可裂解的连接子。许多不同的可裂解连接子为所属领域技术人员所熟知。参看，美国专利第 4，618，492号、第4，542，225号和第4，625，014号。从这些连接子基团释放试剂的机制包括，例如照射光不稳定性键和酸催化水解。举例来说，美国专利第4，671，958号包括包含连接子的免疫结合物的描述，所述连接子在靶位点处通过患者补体系统的蛋白水解酶活体内裂解。连接子的长度可以是预定的，或者可以根据ABP和与其连接的分子之间的所需空间关系而加以选择。鉴于许多所报导的用于将多种放射诊断化合物、放射治疗化合物、药物、 毒素和其它试剂与抗体相连接的方法，所属领域技术人员应能够确定将所给试剂与ABP或其它多肽连接的合适方法。在一些实施例中，生物活性分子包含连接于ABP或连接于抗原决定基标签的螯合剂。双特异性和/或多特异性ABP携带有相应的抗原决定基标签或ABP，因此双特异性和 /或多特异性ABP与螯合剂的简单接触导致ABP与生物活性分子的连接。可以在使用所述部分(预靶向策略)之后进行所述结合步骤，或者在传递螯合剂之前可以使靶组织与双特异性和/或多特异性ABP结合。适合与各种靶向部分偶联的螯合物的制造方法为所属领域技术人员所熟知(参看，例如美国专利第6，190，923号、第6，187，285号、第6，183，721 号、第 6, 177, 562 号、第 6, 159, 445 号、第 6, 153, 775 号、第 6, 149, 890 号、第 6, 143, 276 号、 第 6，143，274 号、第 6，139，819 号、第 6，132，764 号、第 6，123，923 号、第 6，123，921 号、 第 6，120，768 号、第 6，120，751 号、第 6，117，412 号、第 6，106，866 号、第 6，096，290 号、 第 6，093，382 号、第 6，090，800 号、第 6，090，408 号、第 6，088，613 号、第 6，077，499 号、 第 6，075，010 号、第 6，071，494 号、第 6，071，490 号、第 6，060，040 号、第 6，056，939 号、 第 6，051，207 号、第 6，048，979 号、第 6，045，821 号、第 6，045，775 号、第 6，030，840 号、 第 6，028，066 号、第 6，022，966 号、第 6，022，523 号、第 6，022，522 号、第 6，017，522 号、第 6，015，897 号、第 6，010，682 号、第 6，010，681 号、第 6，004，533 号和第 6，001，329 号)。当双特异性和/或多特异性ABP和/或生物活性分子均为单链蛋白且相对较短 (即小于约50个氨基酸)时，它们可以使用标准化学肽合成技术进行合成。当两种组分均相对较短时，嵌合部分可以合成为单邻近多肽。或者，可以单独合成双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子，且随后通过缩合一个分子的氨基端与另一分子的羧基端而进行融合，从而形成肽键。或者，双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子可以各自与肽间隔子分子的一个末端缩合，进而形成邻近融合蛋白。固相合成是化学合成本发明多肽的优选方法，其中序列的C末端氨基酸连接于不溶性支撑物，接着相继添加序列中的其余氨基酸。固相合成技术由The Peptides Analysis, Synthesis, Biology.第 2 卷Special Methods in Peptide Synthesis,部分 A.，Merrifield 等人 J. Am. Chem. Soc, 85 :2149-2156(1963)中的 Barany 和 Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis ;第 3-284 页，和 Stewart 等人，Solid Phase Peptide Synthesis,第 2 版· Pierce Chem. Co. , Rockford, 111 (1984)描述。“双官能聚合物”是指包含两个不连续官能团的聚合物，这两个不连续官能团能够特异地与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)反应以形成共价或非共价键。可以使用其中一个官能团可与特定生物活性组分上的基团反应而另一个官能团可与第二生物组分上的基团反应的双官能连接子，来形成包括第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分的结合物。用于将各种化合物连接于肽的许多过程和连接分子是已知的。参看，例如欧洲专利申请案第188，256号、美国专利第4，671，958号、第4，659，839号、第4，414，148 号、第4，699，784号、第4，680，338号、第4，569，789号和第4，589，071号，其均以引用的方式并入本文。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上不连续官能团的聚合物，所属两个或两个以上不连续官能团能够特异地与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)反应以形成共价或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可以具有任何所需分子长度或分子量，并且可以经选择以提供连接于ABP的分子间的所需间距或构象。当取代基由其常规化学式从左到右书写而指定时，同样涵盖可以自从右到左所书写结构所得到的化学性质相同的取代基，例如结构-CH2O-等同于结构-0CH2-。术语“取代基”包括(但不限于)“非干扰取代基”。“非干扰性取代基”是指那些产生稳定化合物的取代基。合适的非干扰取代基或基团包括(但不限于)卤素、C1-Cltl烷基、C2-Cltl稀基、C2-Cltl块基、C1-Cltl烧氧基X1-C12芳烧基X1-C12烧芳基、C3-C12环烧基、C3-C12 环稀基、苯基、经取代苯基、甲苯酸基、~■甲苯基、联苯基、C2-C12烧氧基烧基、C2-C12烧氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚硫酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)
烷基)(其中m为I至8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烧基、一NO2> —CN> 一NRC(O) — (C1-Cltl 烧基)、一C(O) — (C1-Cltl 烧基)、C2-C10 烧基硫烧基、一C(O)O—(C1-C10 烧基)、一OH、—SO2、= S、一C00H、—NR2、擬基、一C (0) - (C1-C10 烧基)-CF3、一C(O) -CF3> —C(O) NR2> —(C1-C10 芳基)_S—(C6-C10 芳基)、一C(O) — (C「C10 芳基)、一(CH2)m—O— (— (CH2)m—O— (C「C10 烧基)(其中各 m 为 I 至 8)、--C (O)NR2、一C (S) NR2、一SO2NR2、一NRC (O)NR2、一NRC (S) NR2，其盐等等。如本文所用各 R 为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。除非另外说明，否则自身或作为另一取代基部分的术语“烷基”表示直链或带分枝的链或环状烃基，或其组合，这些基团可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的，并且可以包括具有所指碳原子数(即C1-Cltl表示一至十个碳)的二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是指具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-异戊烯基、2-( 丁二烯基)、2，4_戊二烯基、3- (1，4-戊二烯基)、乙炔基、I-和3-丙炔基、3- 丁炔基和较高碳数同系物和异构体。除非另外说明，否则术语“烷基”也包括下文更加详细定义的烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于经基的烧基命名为“闻烧基(homoalkyl)”。自身或作为另一取代基部分的术语“亚烷基”表示来源于烷烃的二价基团，例如 (但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-,并且另外包括如下文所述“杂亚烷基”的基团。烷基(或亚烷基)通常具有I至24个碳原子，那些具有10个或更少碳原子的基团在本发明中是首选。“较低碳数烷基”或“较低碳数亚烷基”是通常具有八个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。术语“烧氧基”、“烧基氣基”和“烧基硫基”(或硫代烧氧基)以其常规意义使用， 并且分别是指经氧原子、氨基或硫原子连接于分子剩余部分的烷基。除非另外说明，否则单独或与其它术语组合使用的术语“杂烷基”表示由所述数目碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成群组的杂原子组成(其中氮和硫原子可以视情况经氧化而氮杂原子可以视情况经季铵化)的稳定直链或具有分枝的链或环状烃基。 杂原子O、N、S和Si可以位于杂烷基的任何内部位置处，或者位于烷基连接于分子剩余部分处。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-0-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2 -S-CH2-CH3' -CH2-CH2-S (O) -CH3> -CH2-CH2-S(O)2-CH3' -CH = CH-O-CH3' -Si(CH3)3' -CH2-CH =N-OCH3和-CH = CH-N (CH3) -CH3。最多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3 和-CH2-O-Si (CH3) 3。类似地，单独或作为另一取代基部分的术语“杂亚烷基”表示来源于杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基来说，相同或不同杂原子也可以占据任一链末端或两端(包括(但不限于)亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等等)。此外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基来说，连接基化学式所书写的方向并不表示连接基的定向。举例来说， 式-C(O)2R'-表示-C(O)2R'-和-R' C(0)2-。除非另外说明，否则自身或在与其它术语组合中的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表不环状形式的“烧基”和“杂烧基”。因此，环烧基或杂环烧基包括饱和与不饱和环键。 此外，对于杂环烷基来说，杂原子可以占据杂环连接于分子剩余部分的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、I-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1_(1，2，5,6-四氢吡啶基)、1_哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、I-哌嗪基、2-哌嗪基等等。此外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，自身或作为另一取代基部分的术语“亚杂环烷基”表示来源于杂环烷基的二价基团，而自身或作为另一取代基部分的术语“亚环烷基”表示来源于环烷基的二价基团。如本文所用术语“水溶性聚合物”是指任何在水溶液中可溶的聚合物。水溶性聚合物与ABP的键合可以产生以下改变，包括(但不限于)相对于未经修饰形式而言，增加或调节血清半衰期，或者增加或调节治疗半衰期，调节免疫原性，调节物理缔合特征(例如聚集和多聚体形成)，改变受体结合和改表受体二聚化或多聚化作用。水溶性聚合物可以具有或不具有自身生物活性，且可以用作连接子以连接ABP与其它物质，包括(但不限于)一个或一个以上ABP、一个或一个以上生物活性分子。合适的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-Cltl烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5，252，714号， 其以引用的方式并入本文)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚-顺丁烯二酸酐、N-(2_羟基丙基)_甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙氧基化多元醇、肝磷脂、肝磷脂片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷撑二醇及其衍生物、聚烷撑二醇与其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。这些水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。如本文所用术语“聚烷撑二醇” “聚(烷撑二醇)”是指聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。术语“聚烷撑二醇”涵盖直链和支链聚合物且平均分子量介于O. IkDa与 IOOkDa之间。其它示范性实施例列于商业厂商目录中，例如Shearwater Corporation的目录"Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)。除非另外说明，否则术语“芳基”表示可以是单环或稠合于一起或共价连接的多环(优选为I至3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有一至四个选择N、0和S的杂原子的芳基(芳环)，其中氮原子和硫原子视情况经氧化，而氮原子视情况经季铵化。杂芳基可以经杂原子连接于分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、I-萘基、2-萘基、4-联苯基、I-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、 4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、I-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。各上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受取代基的群组。简单地说，当与其它术语组合使用(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)时，术语“芳基”包括上文所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”包括其中芳基连接于烷基的那些基团(包括(但不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，包括其中碳原子经(例如)氧原子置换的烷基(包括(但不限于)亚甲基)，包括(但不限于) 苯氧基甲基、2-卩比唳氧基甲基、3_(1_萘氧基)丙基等等。各上述术语(包括(但不限于“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”))包括经取代和未经取代形式的所述基团。各类基团的示范性取代基于下文提供。烧基和杂烧基(包括通常称为亚烧基、稀基、杂亚烧基、杂稀基、块基、环烧基、 杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自以下多种基团中的一者或一者以上0 至(2m' +1)数目的-OR'、=0、= NR'、= N-OR'、-NR' R;/ , -SR ;、-卤素、-SiR ' R " R ' "、-OC(O)R '、-C(O)R '、-CO2R5、-CONR ' R "、-OC(O) NR' R"、-NR" C(O)R'、-NR' -C(O)N" R' "、-NR" C(O)2R'、-NR-C(NR' R" R'") = NR" "、-NR-C(NR' R" ) =NR' "、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR' R"、-NRSO2R'、 -CN和-NO2，其中m'是所述基团中碳原子的总数。R'、R"、R'"和R""各自独立是指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基，其包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择为当存在一个以上这些基团时如同各R'、R"、R'"和R""基团。当R'和R"连接于相同氮原子时，其可以与氮原子结合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR' R"包括(但不限于)I-吡咯烷基和4-吗啉基。基于上述取代基的描述，所属领域技术人员应了解术语“烷基”是指包括与除氢原子外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括(但不限于)-CFjP-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C (O) CH3> -C (O) CF3> -C (O) CH2OCH3 等等)。与烷基所述取代基相似，芳基和杂芳基的取代基可变化，并且选自(但不限于)0至芳香族环系统上开放价(open valence)总数的卤素、-OR '、= O、 =NR '、= N-OR '、-NR ' R "、-SR '、-卤素、-SiR ' R " R ' "、-OC(O) R '、-C(O) R'、-CO2R'、-CONR' R"、-OC(O)NR' R"、-NR" C(O)R'、-NR' -C(O)NR" R' "、-NR "C(O)2R'、-NR-C(NR' R" R' " ) = NR" "、-NR-C(NR' R" ) = NR' "、-S(O)R'、-S( 0)2R'、-S (O)2NR' R"、-NRSO2R'、-CN 和-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟 (C1-C4)烷基；且其中V、R" "和R""独立为氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择为当存在一个以上这些基团时如同各R'、R"、R'"和R""基团。如本文所用术语“经调节血清半衰期”是指相对于未经修饰形式而言经修饰ABP 的循环半衰期的正或负改变。通过在投与ABP后各个时间点时取血液样品和测定所述分子在各样品中的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性使得可以计算血清半衰期。血清半衰期有利地具有至少约两倍的增加，但是较小的增加也是可用的，例如当使得能够得到满意给药方案或避免毒性作用时。在一些实施例中，所述增加为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。如本文所用术语“经调节治疗半衰期”是指相对于未经修饰形式而言治疗有效量 ABP或包含经修饰生物活性分子的ABP的半衰期的正或负改变。通过在投药后各个时间点时测量分子的药物动力学和/或药效特性来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期有利地使得能够得到尤其有益的给药方案，尤其有益的总剂量，或避免不良作用时。在一些实施例中，增加的治疗半衰期源于效能的提高、经修饰分子与其靶标结合的增加或减少或者未经修饰分子另一参数或作用机制的增加或减少。当用于核酸或蛋白时，术语“分离的”表示核酸或蛋白实质上不含天然状态下相关的其它细胞组分。它可以是均态。分离物质可以是干态或半干态，或者在溶液中，包括(但不限于)水溶液。通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法等分析化学技术确定纯度和均质性。作为存在于制剂中的主要物种的蛋白实质上是纯化的。具体来说，分离基因是从位于基因侧翼并且编码除感兴趣基因之外的蛋白的开放阅读框架中分离得到的。 术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中实质上产生一条带。具体来说，“纯化的”表示核酸或蛋白具有至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或更高纯度。术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非另外特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物、具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然发生核苷酸相似的方式代谢的核酸。 除非另外特别限制，否则所述术语也指包括PNA(肽核酸)的寡核苷酸类似物，用于反义技术中的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酯等等)。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地包括其保守修饰变体(包括(但不限于)简并密码子替换)和互补序列以及明确所指的序列。具体来说，可以通过产生其中一个或一个以上所选(或全部)密码子的第三位经混合碱基和/或脱氧次黄嘌呤残基替换的序列来完成简并密码子替换(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 (1985)； and Cassol 等人(1992) ;Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中交替使用并且指氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白的描述，反之亦然。所述术语适用于天然发生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。术语“氨基酸”是指天然发生和非天然发生的氨基酸，以及以与天然发生氨基酸相似方式行使功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸) 以及焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然发生氨基酸相同基本化学结构 (即结合于氢的α碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。所述类似物具有经修饰R基团(例如正亮氨酸)或经修饰肽骨架，但是保留与天然发生氨基酸相同的基本化学结构。本文根据IUPAC-IUB生物化学名词审定委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的一般所知的三字符号或一字符号来表示氨基酸。同样也可以通过一般所接受的单字代码来表示核苷酸。“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列来说，“保守修饰变体”是指编码相同或基本上相同氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，因此许多功能相同的核酸编码任何给定蛋白。 举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子所指定的每个位置处，可以将密码子改变成任何上述相应密码子而不改变所编码的多肽。所述核酸变异是“沉默变异(silent variation) ”,是一种保守修饰变异。本文编码多肽的每个核酸序列也描述每种可能的核酸沉默变异。所属领域技术人员应认识到，可以修饰核酸中每个密码子(除AUG (—般仅为蛋氨酸密码子)和TGG (—般仅为色氨酸密码子)之外)以产生功能相同分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异暗含在每个所述序列中。关于氨基酸序列而言，所属领域技术人员应认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的个别替换、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸经化学相似氨基酸替换。提供功能相似氨基酸的保守替换表为所属技术领域所熟知。所述保守修饰变体是除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因之外的，但不排除这些。以下八组各含有为相互之间保守替换的氨基酸I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)。参看，例如 Creighton, Proteins !Structures and Molecular Properties (ff H Freeman &Co.;第 2 版(I"3 年 I2 月)。在两个或两个以上核酸或多肽序列的内容中，术语“一致”或百分比“一致性”是指两个或两个以上相同的序列或子序列。当在比较窗口或指定区域上通过使用一种以下序列比较算法或通过手工比对和视觉观察来比较并且比对最大对应度时，如果其具有相同氨基酸残基或核苷酸百分比(即在指定区域上约60%—致性、视情况约65%、约70%、约75%、 约80%、约85%、约90%或约95%—致性)，则序列是“实质上一致的”。所述定义也指测试序列的互补序列。所述一致性可以存在于至少约50个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者在75-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者当未指定时为整个序列或多聚核苷酸或多肽上。对于序列比较来说，通常一个序列充当测试序列所比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标(如果需要)并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定参数。序列比较算法随后基于程序参数而计算测试序列相对于参考序列的百分比序列一致性。如本文所用“比较窗口 ”包括选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100 至约150个组成群组的任何数目连续位置的节段，其中在一个序列和参考序列最佳比对之后可以将该序列与相同数目连续位置的参考序列比较。用于比对比较序列方法为所属领域所熟知。可以执行比较序列的最佳比对，包括(但不限于)Smith和Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2 :482c 的局部同源性算法、Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 443 的同源性比对算法、Pearson 和 Lipman (1988) Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 85 :2444 的搜寻相似性方法、这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA)或者手动比对和视觉观察(例如，参看Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (1995 增刊))。一种适用于确定百分比一致性和序列相似性的算法实例是BLAST和BLAST 2. O算法，其分别描述于 Altschul 等人(1977) Nuc. Acids Res. 25 :3389_3402，和 Altschul 等人 (1990) J. Mol. Biol. 215 =403-410中。执行BLAST分析的软件是经美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用的。BLAST 算法参数 W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认字长(W)ll、 期望值(E)或10、M = 5、N = -4和双链比较。对于氨基酸序列来说，BLASTP使用默认字长 3 和期望值(E) 10，和 BL0SUM62 计分矩阵(参看 Henikoff 和 Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915)比对(B) 50、期望值(E) 10、M = 5、N = -4 和双链比较。通常在关闭“低复杂度”过滤器下进行BLAST算法。BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参看，例如Karlin和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5787)。BLAST 算法所提供的一个相似性度量标准是最小和概率(smallest sum probability) (P(N)),其指示可能偶然发生的两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配的概率。举例来说，如果测试核酸与参考核酸比较的最小和概率小于约O. 2、更优选小于约O. 01且最优选小于约O. 001，则认为核酸与参考序列相似。短语“选择性(或特异性)杂交”是指当序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中时，所述分子在严谨杂交条件下仅与特定核苷酸序列结合、双联或杂交。短语“严谨杂交条件”是指如所属领域已知的低离子强度和高温条件。在严谨条件下探针通常应与其在核酸的复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA) 中的靶子序列杂交，而不与复杂混合物中的其它序列杂交。严谨条件具有序列相关性，并且在不同情况下会有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛指导见于 Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, " Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中。通常将严谨条件选择为低于在所定义的离子强度pH 下特异性序列的热熔点(Tm)约5-10°C。Tm是与靶标互补的探针的50%与靶序列杂交平衡 (当靶序列过量存在、Tm时，50%探针占据平衡)时的温度(在所定义的离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件可以是PH 7. O至8. 3下盐浓度低于约I. OM钠离子(通常约O. 01 至I. OM钠离子浓度)，且对短探针而言温度至少约30°C (包括(但不限于)10至50个核苷酸)而对长探针而言至少约60°C (包括(但不限于)大于50个核苷酸)。也可以通过加入例如甲酰胺的去稳定剂来达到严谨条件。对于选择性或特异性杂交来说，阳性信号可以为至少两倍背景，视情况为10倍背景杂交。示范性严谨杂交条件可以如下50%甲酰胺、 5XSSC 和 1% SDS，在 42°C下温育；或者 5XSSC、1% SDS，在 65°C下温育；用 0. 2XSSC 和 0. 1% SDS在65°C下洗涤。所述洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。如本文所用术语“真核生物”是指属于种系发生真核生物域(Eucarya)的生物体， 例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等等)、纤毛虫、植物(包括 (但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微粒子虫、原生生物
坐坐寸寸ο如本文所用术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核生物体可以属于真细菌(Eubacteria)(包括(但不限于)大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermits thermophilus)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)、突光假单胞菌 (Pseudomonas f Iuorescens)、绿胺杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)等等)种系发生域；或古生菌(Archaea)(包括(但不限于)甲烧球菌(Methanococcus jannaschii)、甲烧细菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、 嗜盐菌属(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和法克隆嗜盐菌 (Halobacterium species) NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈热球菌 (Pyrococcus furiosus)、超嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷气热菌(Aeuropyrum pernix)等等)种系发生域。如本文所用术语“受检者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物，优选哺乳动物， 最优选人。如本文所用术语“有效量”是指(经修饰)非天然氨基酸多肽可以一定程度地减轻所治疗的疾病、病情或病症的一种或一种以上症状的投药量。可以投用本文所述含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以用于预防性、增强性和/或治疗性治疗。术语“增强”表示增加或延长所需作用的功效或持续时间。因此，就增强治疗剂作用来说，术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统作用的功效或持续时间的能力。如本文所用“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂在所需系统中作用的量。当用于患者时， 此用途的有效量将取决于疾病、病症或病情的严重程度和进程、先前疗法、患者健康状况和对药物的反应，和治疗医师的判断。如本文所用术语“经修饰”是指存在对多肽的翻译后修饰。形式“(经修饰)”术语是指所讨论的多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论的多肽可以经修饰或未经修饰。术语“经翻译后修饰”和“经修饰”是指天然或非天然氨基酸在并入多肽链之后所发生的所述氨基酸的任何修饰。仅举例来说，该术语涵盖活体内共翻译修饰、活体内翻译后修饰和活体外翻译后修饰。在预防性应用中，含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与易感于特定疾病、病症或病情或者具有这些风险的患者。将所述量定义为“预防有效量”。在此用途中，准确量也取决于患者的健康状况、体重等等。在所属领域技术范围内可以充分地考虑通过常规实验(例如剂量递增临床试验)来确定所述预防有效量。术语“受保护”是指存在防止在某些反应条件下化学反应官能团反应的“保护基” 或部分。保护基应视所保护的化学反应基的类型而变化。举例来说，如果化学反应基是胺或酰肼，那么保护基可以选自叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。 如果化学反应基是硫醇，那么保护基可以是邻卩比唳基二硫化物(orthopyridyldisulfide)。 如果化学反应基是羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可以是苄基或烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。所属领域已知的其它保护基也可以用于本文所述的方法和组合物，或者与其一起使用。仅举例来说,封闭基(blocking group) /保护基可以选自
麵两基 B"Chz搡丙氧鏡基 _其它保护基描述于 Greene 和 Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第3版，John Wiley & Sons, New York, NY, 1999中，其以引用的方式并入本文。
叔丁基
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在治疗应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病、病症或病情的症状的量投与已经遭受所述疾病、病情或病症的患者。将此量定义为“治疗有效量”，其将取决于疾病、病症或病情的严重程度和进程、先前治疗、患者健康状况和对药物的反应，和治疗医师的判断。在所属领域技术范围内可以充分地考虑通过常规实验(例如剂量递增临床试验)来确定所述治疗有效量。术语“治疗”是指预防性和/或治疗性治疗。除非另外说明，否则采用所属领域技术范围内的常规质谱法、NMR、HPLC、蛋白化学法、生物化学法、重组DNA技术和药理学法。实施方式I.引言本发明提供包含至少一种非天然氨基酸的ABP分子。在本发明的某些实施例中， 具有至少一种非天然氨基酸的ABP包括至少一种翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一种翻译后修饰包含分子连接，其包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、放射性核素、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、 脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、 新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分(photocaged moiety)、 光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团 (intercalating group)、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述组合或任何其它所需化合物或物质，其包含采用所属领域技术人员所已知适用于特定反应性基团的化学方法与包含第一反应性基团的至少一种非天然氨基酸具有反应性的第二反应性基团。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也称为乙炔部分)，且第二反应性基团为叠氮基部分，并且采用[3+2]环加成方法。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸)，且第二反应性基团为炔基部分。在本发明经修饰ABP多肽的某些实施例中，使用至少一种包含至少一种翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一种翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，在真核细胞中或在非真核细胞中活体内进行翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白包括至少一种在由一种宿主细胞活体内所进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白包括至少一种在由一种真核细胞活体内所进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、 棕榈酸酯加成、磷酸化、糖脂键(glycolipid-linkage)修饰等等。在一个实施例中，翻译后修饰包含寡糖与天冬酰胺通过GlcNAc-天冬酰胺键(包括(但不限于)其中寡糖包含 (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc_GlcNAc等等)连接。在另一实施例中，翻译后修饰包含寡糖 (包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等等)通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白或多肽可以包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合体和/或类似物质。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、5'-经优化用于细菌表达的真核生物分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶酸酯裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII (原核生物)、Fd GIII和M13 (噬菌体)、Bgl2 (酵母) 和来源于转座子的信号序列bla。可以使用包含非天然氨基酸的抗原结合多肽调节生物活性分子的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间，所述生物活性分子包括(但不限于)小分子、肽和寡核苷酸。所述小分子、肽和寡核苷酸可以具有包括(但不限于)结合和/或识别靶分子或细胞类型、抗肿瘤活性、抗血管形成活性、抗病毒活性和细胞凋亡活性的生物活性。此外，包含非天然氨基酸的抗原结合多肽可以提供所需活性，包括(但不限于)效应子功能，例如ADCC、吞噬作用或补体依赖性细胞毒性、前药活化、酶活性、催化活性、阻断蛋白-蛋白互作、结合所需抗原和将小分子靶向所需位点。ABP阻断蛋白-蛋白互作可以调节所连接生物活性分子的一种或一种以上活性。可以将小分子用作拮抗剂以干扰其它蛋白或分子的结合活性。抗原结合多肽和小分子可以通过连接子、聚合物或共价键连接。连接子、聚合物或小分子自身可以包含与20种常见氨基酸不具反应性的官能团。连接子或聚合物可以是双官能的。在所需条件下，一个或一个以上涉及抗原结合多肽经连接子、聚合物或共价键结合于生物活性分子的键可以是不可逆的、可逆的或不稳定的。一个或一个以上涉及抗原结合多肽经连接子、聚合物或共价键结合于分子的键可以允许抗原结合多肽或其它分子的受调节释放。所属领域技术人员可以通过化学方法、作为天然产物分离或其它方法产生多种小分子。Rader 等人 Proc Natl Acad Sci USA. 2003 年 4 月 29 日；100(9) :5396_400 中描述一种经由使小合成分子与一般抗体分子反应而对所述分子提供效应子功能和长血清半衰期的方法，此参考案以引用的方式并入本文。通过mAb 38C2(模拟天然醛缩酶的催化抗体)经抗体上反应性赖氨酸残基而与靶向Arg-Gly-Asp肽模拟物的整合素二酮衍生物之间的可逆共价键来产生所述复合物。除了增加肽模拟物的半衰期之外，复合物还展示抗体选择性重新靶向表达整合素ανβ3、ανβ5的细胞表面。所感兴趣的蛋白或多肽可以含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或者十个或十个以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可以相同或不同，例如包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同非天然氨基酸的蛋白中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同位点。在某些实施例中，至少一个(但少于全部)以蛋白的天然发生形式存在的特定氨基酸由非天然氨基酸替换。本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的抗原结合多肽或ABP的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入ABP中可以允许涉及与包括(但不限于) 一个或一个以上非天然编码氨基酸发生特异性化学反应而不与常见发生20种氨基酸反应的结合化学应用。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的ABP经由非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供用PEG衍生物选择性修饰蛋白的高效方法，所述方法涉及将非遗传编码氨基酸选择性并入响应于选择密码子的蛋白和随后用合适的反应性PEG衍生物对这些氨基酸进行修饰，所述非遗传编码氨基酸包括 (但不限于)含有并非发现于20种天然并入氨基酸中的官能团或取代基的氨基酸，所述官能团或取代基包括(但不限于)酮、叠氮或乙炔部分。一旦并入之后，即可以通过使用所属领域技术人员已知适用于存在于天然编码氨基酸的特定官能团或取代基的化学方法来对氨基酸侧链进行修饰。已知多种化学方法适用于本发明中将水溶性聚合物并入蛋白中。所述方法包括(但不限于)分别与包括(但不限于)乙炔或叠氮衍生物进行Huisgen[3+2] 环力口成反应(参看，例如 Padwa，A.白勺 Comprehensive Organic Synthesis,第 4 卷,(1991) 编辑 Trost, B. M. , Pergamon, Oxford,第 1069-1109 页；和 Huisgen, R.的 1, 3~Dipolar Cvcloaddition Chemistry, (1984)编辑 Padwa, A. , Wiley, New York,第 1-176 页)。由于HuiSgen[3+2]环加成法涉及环加成而不是亲核取代反应，因此蛋白可以经极为高度选择性的修饰。可以通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐来在室温下水性条件中以良好区域选择性(1，4> 1，5)进行所述反应。参看，例如Tornoe等人，(2002) Org. Chem. 67 :3057-3064 ;和 Rostovtsev 等人，(2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41 :2596-2599 ； 和TO 03/101972。在[3+2]环加成中可以添加到本发明蛋白中的分子实质上包括任何具有合适官能团或取代基的分子，包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物。可以将这些分子分别添加于具有乙炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)中或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。由Huisgen[3+2]环加成所产生的五元环通常在还原环境中不可逆，并且在水性环境中长时间对水解稳定。因此，多种物质的物理和化学特征可以在所需水性条件下用本发明的活性PEG衍生物修饰。更为重要的是，因为叠氮和乙炔部分相互之间具有特异性(例如，不与任何20种常见遗传编码氨基酸反应)，所以可以在一个或一个以上特异性位点处以极为高选择性修饰蛋白。本发明也提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物，和具有一个或一个以上乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对已经选择性引入响应于选择密码子的蛋白中的叠氮部分的偶联具有高度选择性。类似地，含有叠氮部分的 PEG聚合物衍生物对已经选择性引入响应于选择密码子的蛋白中的乙炔部分的偶联具有高度选择性。更具体来说，叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮、芳基叠氮和这些叠氮的衍生物。烷基叠氮和芳基叠氮的衍生物可以包括其它取代基，只要维持乙炔特异性反应即可。乙炔部分包含烷基乙炔和芳基乙炔和各自的衍生物。烷基乙炔和芳基乙炔的衍生物可以包括其它取代基，只要维持叠氮特异性反应即可。包含非天然编码氨基酸的ABP可以用于采用抗体特异性的试验中。举例来说，本发明的ABP分子可以用于筛选潜在抗原群体。本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的结合物，所述其它物质包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、放射性核素、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、 纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、 氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述组合或任何其它所需化合物或物质。本发明也提供具有叠氮或乙炔部分的物质与具有对应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的结合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可以在蛋白中含有具有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的位置处偶联于生物活性分子。用于 PEG与生物活性分子的偶联的键合包括(但不限于)Huisgen[3+2]环加成产物。所属技术领域已经充分确定，PEG可以用于修饰生物材料的表面(参看，例如美国专利 6，610，281 ；Mehvar, R.，J. Pharmaceut. Sci. ,3(1) : 125-136 (2000)，所述参考案以引用的方式并入本文)。本发明也提供包含具有一个或一个以上反应性叠氮或乙炔位点的表面和一种或一种以上经Huisgen[3+2]环加成键偶联于所述表面的本发明的含叠氮或乙炔聚合物的生物材料。生物材料和其它物质也可以通过除叠氮或乙炔键之外的键(例如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键)偶联于叠氮或乙炔活化的聚合物衍生物，以留下叠氮或乙炔部分可用于随后反应。本发明包括合成本发明含有叠氮和乙炔的聚合物的方法。在含有叠氮的PEG衍生物的情况下，叠氮可以直接结合于聚合物的碳原子。或者，可以通过将一个末端具有叠氮部分的连接剂连接于常规活性聚合物来制备含叠氮的PEG衍生物，以使所得聚合物在其末端具有叠氮部分。在含有乙炔的PEG衍生物的情况下，乙炔可以直接结合于聚合物的碳原子。 或者，可以通过将一个末端具有乙炔部分的连接剂连接于常规活性聚合物来制备含乙炔的 PEG衍生物，以使所得聚合物在其末端具有乙炔部分。更具体来说，在含叠氮的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经反应以生成其上具有更具反应性部分的经取代聚合物，所述更具反应性部分例如甲磺酸酯、三氟代乙烷磺酸酯(tresylate)、甲苯磺酸酯或卤素离去基团。所属领域技术人员熟知含有磺酰酸卤化物、卤素原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和用途。所得经取代聚合物随后经反应以在聚合物的所述末端用叠氮部分取代所述更具反应性的部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物经历与在一个末端具有叠氮的连接剂的反应，以使在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且叠氮部分位于聚合物的所述末端。所属领域技术人员熟知亲核和亲电子部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等等。更具体来说，在含有乙炔的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经反应以置换含有乙炔部分的前驱物中的卤素或其它活性离去基团。或者， 具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物经历与在一个末端具有乙炔的连接剂的反应，以使在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且乙炔部分位于聚合物的所述末端。所属领域技术人员完善确立了卤素部分、活性离去基团、亲核和亲电子部分在有机合成内容和PEG衍生物的制备和应用中的用途。本发明也提供选择性修饰蛋白的方法，以向经修饰蛋白添加其它物质，包括(但不限于)水溶性聚合物，例如含有叠氮或乙炔部分的PEG和PEG衍生物。可以用含叠氮和乙炔的PEG衍生物修饰表面和分子的特性(其中主要是生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性)，而同时提供比所属技术领域先前已知的更具选择性的连接PEG衍生物与蛋白的方法。II.抗原结合多肽存在许多种ABP。ABP自身对许多种抗原具有特异性。也存在大量多种类的抗原特异性ABP片段。因此，ABP旨在包括展示特异性结合靶分子或抗原的能力的任何多肽。任何已知的抗体或抗体片段为ABP。本发明的ABP可以包含Fe区或Fe样区。Fe域提供与效应子功能的连接，例如补体或吞噬细胞。免疫球蛋白的Fe部分具有长血浆半衰期，而Fab具有短寿命(Capon等人 (1989), Nature, 337 :525-531)。当连同治疗蛋白构建时，Fe域可以提供更长半衰期或者并入例如Fe受体结合、蛋白A结合、补体固定和可能甚至是胎盘转移的功能。举例来说，IgGl 抗体的Fe区已经融合于⑶30-L的N端，⑶30-L是结合表达于何杰金氏病(Hodgkin' s Disease)肿瘤细胞、间变性淋巴瘤细胞、T细胞白血病细胞和其它恶性细胞型上的CD30受体(美国专利第5，480，981号)。抗炎性和抗排斥剂IL-10已经融合于鼠科动物Fe y 2a 以增加细胞因子的短循环半衰期。Zheng, X.等人(1995), The Journal of Immunology, 154 :5590-5600。也已经进行研究以评价与人类IgGl的Fe蛋白相连接的肿瘤坏死因子受体对治疗患有脓毒性休克(Fisher, C.等人，N. Engl. J. Med. ,334:1697-1702(1996) ；Van Zee, K.等人，The Journal of Immunology, 156 :2221-2230(1996))和类风湿性关节炎 (Moreland，等人(1997)，N. Engl. J. Med. ,337(3) :141-147)的患者的用途。Fe 也已经与 CD4 受体融合以产生用于治疗AIDS的治疗蛋白(Capon等人(1989)，Nature，337 :525-531)。此外，白细胞介素2的N端也已经融合于IgGl或IgG3的Fe部分以克服白细胞介素2的短半衰期及其全身性毒性(Harvill 等人(1995)，Immunotechnology, I :95-105)。众所周知，抗体的Fe区由可以通过二硫键或通过非共价缔合而连接成二聚或多聚形式的单聚多肽节段组成。天然Fe分子的单聚亚单位之间的分子间二硫键的数目取决于所涉及抗体的种类(例如，IgG、IgA、IgE)或亚类(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgAl、IgGA2) 而为I至4。如本文所用术语“Fe”是单聚、二聚和多聚形式的Fe分子的总称。应注意，当存在适当Cys残基时，除非存在阻止经二硫键形成的二聚化作用的特殊条件，否则Fe单体将自发二聚化。即使通常在Fe 二聚体中形成二硫键的Cys残基被移除或由其它残基置换， 单聚链通常仍将经由非共价互作而二聚化。本文所用术语“Fe”表示任何的这些形式天然单体、天然二聚体(经二硫键连接)、经修饰二聚体(经二硫键和/或非共价键连接)和经修饰单体(即衍生物)。举例来说，可以通过在包括非天然编码氨基酸的残基或序列上进行各种替换来构建Fe部分的变体、类似物或衍生物。变体(或类似物)多肽包括插入变体，其中一个或一个以上氨基酸残基补充Fe氨基酸序列。插入可以位于蛋白的任一末端或两个末端，或者可以位于Fe氨基酸序列中的内部区。在任一末端或两个末端具有其它残基的插入变体可以包括(例如)融合蛋白和包括氨基酸标签或标记的蛋白。举例来说，Fe分子可以视情况含有N端Met，尤其是当所述分子在细菌细胞(例如大肠杆菌)中重组表达时。在Fe缺失变体中，移除Fe多肽中一个或一个以上氨基酸残基。可以在Fe多肽的一端或两端实现缺失，或者可以用移除Fe氨基酸序列中一个或一个以上残基来实现缺失。因此，缺失变体包括Fe多肽序列的所有片段。在Fe替换变体中，移除Fe多肽的一个或一个以上氨基酸残基并且用其它残基置换。一方面，替换为天然保守，然而本发明也涵盖为非保守的替换。举例来说，半胱氨酸残基可以缺失，或者可以用其它氨基酸置换以防止Fe序列的一些或全部二硫交联形成。蛋白可以含有一个或一个以上半胱氨酸残基，并且可以移除各半胱氨酸残基或用其它氨基酸(例如Ala或Ser或非天然编码氨基酸)替换一个或一个以上所述半胱氨酸残基。作为另一实例，也可以进行修饰以引入氨基酸替换以致(I)切除Fe受体结合位点;(2)切除补体(Clq)结合位点；和/或(3)切除抗体依赖性细胞介导细胞毒素(ADCC) 位点。所述位点为所属技术领域所已知，并且任何已知替换均是在本文所用Fe的范围以内。举例来说，就IgGl中的ADCC位点而言,请参看Molecular Immunology,Vol. 29,No. 5, 633-639(1992)。同样,一个或一个以上酪氨酸残基也可以由苯丙氨酸残基置换。此外，也涵盖其它变体氨基酸插入、缺失(例如1-25个氨基酸)和/或替换，并且这些是在本发明的范围以内。保守氨基酸替换通常是首选。此外，改变可以为经改变氨基酸形式，例如肽模拟物或D-氨基酸。Fe序列也可以经衍生化，即承受除氨基酸残基的插入、缺失或替换之外的修饰。修饰优选是天然共价的，并且包括(例如)与聚合物、脂质、其它有机部分和无机部分的化学键接。可以制备本发明的衍生物以增加循环半衰期，或者可以设计本发明的衍生物以改进多肽靶向所需细胞、组织或器官的能力。也可以将完整Fe分子的补救受体结合域(salvage receptor binding domain)用作本发明化合物的Fe部分,例如描述于W096/32478,标题为“Altered Polypeptides with Increased Half-Life” 中。本文指定为 Fe 的一类分子的其它成员描述于WO 97/34631,标题为“Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives”中。本段所引用的两个公开PCT申请案以引用的方式并入本文。可能会在以后发现其它ABP。可以通过预定蛋白序列的计算机辅助二级和三级结构分析并且通过指定用于鉴别结合于特定靶标的分子的选择技术来鉴别新颖ABP。所述后来所发现的ABP也包括于本发明中。因此，提供ABP的描述以用于说明目的，并且仅作为实例，而并不作为对本文所述方法、组合物、策略和技术的范围的限制。此外，本申请案中提及ABP旨在使用该总称作为任何ABP的实例。因此，应了解，本文关于特异性抗原结合多肽或蛋白所描述的修饰和化学方法同样适用于任何抗原结合多肽，包括本文具体列出的那些在内。III.本发明使用的一般重组核酸方法在本发明的许多实施例中，分离、克隆并通常使用重组方法改变编码所感兴趣的 ABP的核酸。所述实施例用于包括(但不限于)蛋白表达或用于变体、衍生物、表达级联或其它来源于抗原结合多肽的序列的产生中。在一些实施例中，编码本发明的多肽的序列经操作连接于异源启动子。可以基于母体多肽的氨基酸序列并接着改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即并入或替换)或移除(即缺失或替换)，来合成编码包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的核苷酸序列。可以根据常规方法通过定点突变来便利地修饰核苷酸序列。 或者，可以通过化学合成制备核苷酸序列，包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成剂，其中根据所需多肽的氨基酸序列设计寡核苷酸，并且优选选择在重组多肽将产生于其中的宿主细胞中被喜爱的密码子。举例来说，可以通过PCR、连接(ligation)或连接链反应合成并组装编码所需多肽部分的几种小寡核苷酸。参看，例如Barany等人，Proc. Natl. Acad.
42Sci. 88 :189-193(1991);美国专利6，521，427，其以引用的方式并入本文。本发明釆用重组遗传学领域的常规技术。公开本发明所用的一般方法的基本内容包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual (第 3版，2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual(1990) ;^BCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人编辑，1994)。描述分子生物学技术的一般内容包括Berger和Ki_el，Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzvmology volume 152 Academic Press, Inc.， San Diego, CA (Berger) ;Sambrook 等人，Molecular Cloninfi-A Laboratory Manual (第
2版)，第 1~3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，New York， 1989(" Sambrook")和 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人编辑，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc. and John Wiley & Sons，Inc.，(补充 1999) (" Ausubel" ) 这些内容描述突变作用、载体用途、启动子和许多其它相关主题，包括(但不限于)产生包括用于产生蛋白的选择密码子的基因，所述蛋白包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶及其配对。各种类型的突变作用用于本发明的多种目的，包括(但不限于)产生tRNA的文库、产生合成酶的文库、产生选择密码子、将编码非天然氨基酸的选择密码子插入所感兴趣的蛋白或多肽中。所述突变作用包括(但不限于)定点随机点突变、同源重组、DNA改组或其它循环突变(recursive mutagenesis)法、嵌合构建、使用含尿啼唳的模板进行的突变、 寡核苷酸定向突变、硫代磷酸酯修饰DNA突变、使用缺口双链DNA等进行的突变，或其任何组合。其它合适方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主菌株进行的突变、限制性选择和限制性纯化、缺失突变、通过总基因合成进行的突变、双链破裂修复等。包括(但不限于)涉及嵌合构建体在内的突变作用也包括在本发明中。在一个实施例中，可以通过天然发生分子或者经改变或变异的天然发生分子的已知信息指导突变，包括(但不限于)序列、序列比较、物理性质、二级结构、三级结构或四级结构、晶体结构等等。本文所见的内容和实例描述这些程序。其它信息见以下公开案和其内所弓 I 用的参考文献Ling 等人，Approaches to DNA mutagenesis an overview, Anal Biochem.254 (2) 157-178 (1997) ；Dale 等人，01igonncIeotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol. Biol. 57 369-374 (1996) ；Smith, In vitro mutagenesis，Ann. Rev. Genet. 19 :423-462 (1985)； Botstein & Shortle， Strategies and applications of in vitro mutagenesis， Science 229 :1193-1201 (1985) ；Carter, Site-directed mutagenesis，Biochem. J. 237 1-7(1986) ;Kunkel， The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis， in Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F. and Lilley，D. M. J. eds.， Springer Verlag，Berlin) (1987) ;Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Proc. Natl.Acad. 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USA 82, 5824 (1985));病毒载体侵染；通过小粒子用核酸在小珠或粒子基质中或者在表面上进行高速弹道穿透(Klein等人，Nature 327，70-73 (1987))。可以在经过改良而获得适用于筛选步骤、激活启动子或选择转化子等的活性的常规营养培养基中培养经工程操作的宿主细胞。这些细胞视情况可以在转基因生物体中培养。包括(但不限于)用于细胞分离和培养(例如，用于随后核酸分离)的其它有用参考文献包括 Freshney (1994) Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第 3 版，Wiley-Liss，New York 和其中所引用的参考文献；Payne 等人(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc. New York，NY ;Gamborg 和 Phillips (编辑)(1995) Plant Cell Tissue and Organ Culture ；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)和 Atlas 和 Parks (编辑)The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press，Boca Raton, FL。将靶核酸引入细胞中的一些熟知方法可用，其中的任何一种均可用于本发明。这些方法包括将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、发射轰击(projectile bombardment)和用病毒载体侵染(在下文进一步讨论)，等等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构建体的质粒数目。使细菌生长至对数生长期，并且可以通过多种所属技术领域已知方法(参看，例如Sambrook)分离细菌内的质粒。此外，许多市售试剂盒可用于从细菌纯化质粒(参看，例如EasyPrep 、FlexiPrep ，均购自Pharmacia Biotech ;购自 Stratagene的StrataClean ;和购自Qiagen的QIAprep )。进一步操纵经分离和经纯化的质粒以产生其它质粒，用于转染细胞或并入相关载体中以侵染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定靶核酸表达的启动子。载体视情况包含一般表达级联，所述表达级联含有至少一个独立终止子序列、允许级联在真核生物或原核生物或两者(包括(但不限于)穿梭载体)中复制的序列和用于原核和真核系统的选择标记。载体适用于复制和整合进真核生物、原核生物或优选为两者。参看，Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979) ；Roberts 等人，Nature, 328 :731 (1987) ；Schneider, B.等人， Protein Expr. Purif. 6435 :10(1995) ；Ausubel, Sambrook, Berger(均同上文)。举例来说，由ATCC提供可用于克隆的细菌和细菌噬菌体的目录，例如由ATCC所发表的The ATCC CataloRue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna 等人(编辑)。其它用于测序、克隆和分子生物学其它方面的基本过程和基础理论考虑事项请见Watson等人(1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY。此夕卜，基本上任何核酸(和基本上任何经标记核酸，无论标准还是非标准)均可以是从任何多种商业来源定购的定制品或标准品，所述商业来源例如Midland Certified Reagent Company (Midland, TX available on the World Wide Web at mere, com) > The Great American Gene Company (Ramona, CA available on the World Wide Web at genco. com)、ExpressGen Inc. (Chicago, IL available on the World Wide Web at expressgen. com)、Operon Technologies Inc. (Alameda, CA),等。诜择密码子本发明的选择密码子扩大蛋白生物合成机器的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特三碱基密码子、无意义密码子，例如终止密码子(琥珀密码子(UAG)或乳白密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基密码子、稀有密码子等等。所属领域技术人员轻易地了解，存在许多数目的可以引入所需基因中的选择密码子，包括(但不限于)编码至少一部分ABP的单个多聚核苷酸中的一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上、4、5、6、7、8、9、10或更多个。在一个实施例中，所述方法涉及选择密码子的用途，所述选择密码子是在真核细胞中活体内并入非天然氨基酸的终止密码子。举例来说，产生识别终止密码子的Ο-tRNA，包括(但不限于)UAG，并且通过O-RS用所需非天然氨基酸进行氨酰化作用。所述Ο-tRNA不由天然发生宿主的氨酰基-tRNA合成酶所识别。常规定点突变可用于在所感兴趣的多肽的所感兴趣的位点处引入终止密码子，包括(但不限于)TAG。参看，例如Sayers，J. R.等人 (1988),5' , 3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 791-802。当编码所感兴趣的多妝的 0-RS、Ο-tRNA 和核酸活体内结合时，非天然氨基酸响应于UAG密码子而并入从而产生在特定位置含有非天然氨基酸的多肽。可以在不显著扰动真核宿主细胞下进行活体内非天然氨基酸的并入。举例来说， 因为UAG密码子的抑制效率取决于Ο-tRNA (包括(但不限于)琥珀抑制基因tRNA)与真核释放因子(包括(但不限于)eRF)(其结合终止密码子并引发生长肽从核糖体释放)之间的竞争，所以抑制效率可以通过包括(但不限于)增加Ο-tRNA和/或抑制基因tRNA的表达水平来调控。选择密码子也包含长密码子，包括(但不限于)四个或四个以上碱基密码子，例如四、五、六或更多碱基密码子。四碱基密码子的实例包括包括(但不限于)AGGA、CUAG, UAGA、CCCU等等。五碱基密码子的实例包括包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、 CUACU、UAGGC等等。本发明的特征包括使用基于移码抑制的长密码子。四个或四个以上碱基密码子可以将包括(但不限于)一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白中。举例来说，在存在突变Ο-tRNA (包括(但不限于)具有反密码子环(例如具有8-10个核苷酸反密码子环)的移码抑制基因tRNA)下，将四个或四个以上碱基密码子读为单氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可以解码包括(但不限于)至少四碱基密码子、至少五碱基密码子或至少六碱基密码子或更多。由于存在256种可能的四碱基密码子，因此可以使用四个或四个以上碱基密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参看,Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology,9 :237-244 : Magliery(2001)Expanding the Genetic Code !Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of" Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, T. Mol. Biol. 307 :755_769。举例来说，已经使用活体外生物合成方法将四碱基密码子用于将非天然氨基酸并入蛋白中。参看，例如 Ma 等人，(1993)Biochemistry, 32 :7939 :和 Hohsaka 等人,(1999) T.Am, Chem. Soc. 121 :34。用两个经过化学酰基化作用的移码抑制基因tRNA，使用CGGG 和AGGU同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物活体外并入链菌素中。参看，例如 Hohsaka 等人，(1999) T. Am. Chem. Soc. 121 :12194。在活体内研究中，Moore 等人检测了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可以为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA能够以13至26%的效率由具有UCUA反密码子的tRNALeu解码，其中在O 或-I框架中发生极少解码。参看，Moore等人，(2000) T. Mol. Biol. . 298 :195。在一个实施例中，基于稀有密码子或无意义密码子的长密码子可以用于本发明，其可以减少在其它非希望位点的错义通读(missense readthrough)和移码抑制。对于给定系统来说，选择密码子也可以包括一种天然三碱基密码子，其中内生系统并不使用(或极少使用)所述天然碱基密码子。举例来说，其包括缺少识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或其中三碱基密码子为稀有密码子的系统。选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩大现有遗传密码字母。一种额外碱基对将三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定和选择性碱基配对、通过聚合酶有效高保真的酶法并入DNA，和合成初生非天然碱基对之后有效持续的引物延伸。可适用于所述方法和组合物的非天然碱基对的描述包括(例如)Hirao 等人，(2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature BiotechnoloRY, 20 :177_182。其它相关出版物列于下文中。对于活体内使用来说，非天然核苷是可穿膜的，并且经磷酸化而形成相应三磷酸酯。此外，增加的遗传信息是稳定的并且不被细胞酶破坏。Benner和他人的先前工作利用了不同于典型Watson-Crick对的氢键类型,其中最值得注意的是iso_C: iso_G对。参看， 例如 Switzer 等人，(1989) J. Am. Chem. Soc. Ill :8322 ;和 Piccirilli 等人，(1990)Nature, 343 33 ；Kool, (2000)Curr. Opin. Chem. BioL,4 :602。这些碱基通常与天然碱基一定程度的错配，并且不能酶法复制。Kool和合作者证明碱基之间的疏水包装互作可以代替氢键以促使喊基对形成。参看 Kool, (2000)Curr. Opin. Chem. BioL,4 602 :和 Guckian 和 Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36，2825。在开发满足所有上述要求的非天然碱基对的工作中，Schultz、Romesberg和合作者已经系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS: PICS自身对(self-pair)比天然碱基对更为稳定,并且可以通过大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。参看,例如McMinn等人，(1999) T. Am. Chem. Soc, 121 11586 :和 Ogawa 等人，(2000) T. Am. Chem. Soc, 122 :3274。可以通过 KF 在具有足够满足生物功能的效率和选择性下合成3MN:3MN自身对。参看，例如Ogawa等人，(2000)L Am. Chem. Soc, 122 :8803。然而，两种碱基均充当进一步复制的链终止剂。最近开发出可用于复制PICS自身对的突变DNA聚合酶。此外，可以复制7AI自身对。参看，例如Tae等人， (2001) T. Am. Chem. Soc, 123 :7439。最近已经开发出在结合Cu(II)后形成稳定对的新颖金属碱基对 Dipi:Py。参看 Meggers 等人，(2000) T. Am. Chem. Soc, 122 :10714。因为长密码子和非天然密码子本身与天然密码子呈正交，所以本发明的方法可以利用所述特性来对其产生正交tRNA。翻译绕过系统(translational bypassing system)也可以用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译绕过系统中，将大序列并入基因中，但是并未翻译为蛋白。所述序列含有充当诱导核糖体在序列上跳跃并且再继续插入的下游翻译的插入物(cue)的结构。在某些实施例中，本发明的方法和/或组合物中所感兴趣的蛋白或多肽(或其部分)由核酸编码。核酸通常包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。可以用所属领域技术人员所熟知的和本文中所描述的方法使编码所感兴趣的蛋白或多肽的基因发生突变，以包括(例如)用于并入非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子。举例来说，所感兴趣的蛋白的核酸发生突变以包括用于并入一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子。本发明包括任何所述变体，其包括(但不限于) 突变体、任何蛋白形式，例如包括至少一个非天然氨基酸。本发明也同样包括对应核酸，即具有编码一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子的任何核酸。可以轻易地使编码所感兴趣的蛋白(例如ABP)的核酸分子突变以在多肽的任何所希望的位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于在所感兴趣的蛋白上引入反应性分子、 水溶性聚合物、蛋白或多种其它分子。适于将半胱氨酸引入抗原结合多肽的所希望部分的方法为所属技术领域熟知(例如美国专利第6，608，183号中所描述的，该专利以引用的方式并入本文)和标准突变技术。IV.非天然编码氨基酸多种非天然编码氨基酸适用于本发明。可以将任何数目的非天然编码氨基酸弓I入 ABP中。一般来说，所引入的非天然编码氨基酸对20种常见遗传编码氨基酸(即丙氨酸、 精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)实质上成化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与未发现于20种常见氨基酸中的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮基、醛基和氨氧基)有效且选择性地反应而形成稳定结合物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的抗原结合多肽可以与聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇))反应，或者与含有炔部分的第二多肽反应以形成稳定结合物，产生叠氮与炔官能团的选择反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。α -氨基酸的一般结构如下所示(式I):
权利要求
1.一种包含以一共价键相互连接的第一 ABP与第二 ABP的双特异性抗原结合多肽 (ABP)，所述共价键是由至少一非天然编码氨基酸的官能团所形成，前述至少一非天然编码氨基酸则是位于第一 ABP以及/或第二 ABP的恒定域；其中所述第一 ABP结合于一选自于下列所构成群组之抗原CD3 Y，⑶3 δ，⑶3 ε ;而所述第二 ABP则特异性结合于一选自于下列所构成群组之抗原HER3、⑶22、⑶70以及叶酸结合蛋白，并且其中所述官能团包含所述非天然编码氨基酸的至少一酮基或叠氮基。
2.根据权利要求I所述的双特异性抗原结合多肽，其包含经共价键连接于所述抗原结合多肽的单一氨基酸处的水溶性聚合物。
3.根据权利要求I所述的双特异性抗原结合多肽，包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团连接于所述多肽。
4.根据权利要求I所述的双特异性抗原结合多肽，包含连接于一个或一个以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体并入多肽中的预选位点处。
5.一种组合物，其包含根据权利要求I所述的双特异性抗原结合多肽和医药学上可接受载剂。
6.一种抗原结合多肽(ABP)，其包含根据权利要求I所述的双特异性抗原结合多肽，所述抗原结合多肽则偶联于一毒素分子。
全文摘要
本发明提供新颖抗原结合多肽(ABP)和其用途。
文档编号C07K19/00GK102603895SQ20121005381
公开日2012年7月25日 申请日期2005年6月17日 优先权日2004年6月18日
发明者丘霍松, 安娜-玛丽亚·A.·海斯·普特南, 布鲁斯·E·基梅尔, 托马斯·O·丹尼尔, 托马斯·P·丘杰克, 特洛伊·E·威尔逊, 芬·蒂昂, 莉莲·霍 申请人:Ambrx公司