专利名称：基因重组人生长激素的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因重组人生长激素的制备方法。
背景技术：
生长激素(human growth hormone,GH)是由脑垂体前叶特异性细胞分泌的一种单链、非糖基化蛋白激素，它是由191个氨基酸组成，分子量为22kDa，等电点为5. 1，链内含有四个半胱氨酸，组成两对二硫键。生长激素是通过血液运输到靶组织，影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统。其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调节蛋白质、糖及脂肪的代谢等，临床上主要用于治疗侏儒症，近年来研究发现生长激素还可治疗烧伤、创伤、骨折、骨质疏松等多种疾病。在体内，生长激素调节肌肉、骨、软骨细胞的生长与分化等多种生理过程主要 通过两种可能的机制发挥其功能，一是经胰岛素样生长因子等生长介质介导，生长激素刺激肝细胞释放胰岛素样生长因子，再经过胰岛素样生长因子作用于靶细胞促进细胞的增殖和生长；二是生长激素可以直接与靶细胞表面的生长激素受体结合，刺激靶细胞的生长。部分学者认为生长激素对脂肪组织的促成熟分化作用和对免疫系统、造血系统的促增殖发育作用主要是通过直接途径起作用。大量研究证实，生长激素缺乏是导致儿童生长障碍重要的因素之一。最初获得的生长激素制剂主要是取自动物牛的垂体，但由于其种属特异性，治疗效果不佳，并且有发热、过敏等副作用，不久就停止使用。1958年，人们将从人尸体垂体中提取到的少量天然人生长激素，作为激素替代疗法用于治疗儿童侏儒症，其疗效显著，坚持数年治疗，可获得正常身高，但人的垂体仅O. 5g，治疗一个病例需要约1000个垂体，药源稀缺，难以满足巨大患者群的需要。而化学合成的方法效率非常低，成本高，没有实用价值，因此采用基因工程方法大规模生产人生长激素是满足临床大量需求的重要手段。1985年，用大肠杆菌重组DNA技术合成的生长激素获准在临床使用，它是通过包涵体技术生产，含192个氨基酸，较之天然生长激素的氨基酸序列在N端多一个蛋氨酸(Met)，故被称为蛋氨酸生长激素，其生物活性和天然产物相同。虽然临床使用表明Met-重组人生长激素治疗效果和人垂体分离的生长激素相似，但Met-重组人生长激素在治疗过程中容易诱导较大的免疫反应，即使是高纯度Met-重组人生长激素制剂，仍有50 % 80 %病人会产生抗体，因此，人们趋向于研究N-端不带Met的Met人生长激素。用大肠杆菌生产无Met的Met人生长激素有两种方法，一种是在胞内表达产生Met-人生长激素后，在加工、纯化过程中用酶法除去Met分子；另一种方法是用分泌型载体，把人生长激素成熟蛋白的编码序列直接转录入高表达高分泌启动子和信号序列后面，在分泌过程中切去信号肽，使表达的人生长激素累积在细胞周质中。90年代，人们开始用哺乳类细胞合成重组人生长激素(191肽)，该制剂的氨基酸序列与人天然生长激素完全一致，因为它是在哺乳细胞中合成，而非大肠杆菌，故无污染的危险，同时减少了抗原性。近年来，人们又不断尝试利用多种表达系统比如昆虫细胞、蚕、转基因小鼠、家兔、山羊、牛等表达人生长激素，但存在表达量不高，工艺复杂、发酵后处理繁琐、难以工业化生产等问题。毕赤酵母作为低等真核生物，具有高效分泌表达的特点，同时可以利用自身信号肽的切割的特点，获得无Met的人生长激素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述基因重组人生长激素表达量较低的缺点，提供一种基因重组人生长激素表达量相对高、便于操作的基因重组人生长激素的制备方法。解决上述技术问题采用的技术方案是以I型人胶原蛋白氨基酸302 346基序作为前导肽引导人生 长激素表达的前导肽-人生长激素融合蛋白，I型人胶原蛋白氨基酸302 346基序的氨基酸序列为I GPRGLPGERG RPGAPGPAGA RGNDGATGAA GPPGPTGPAG PPGFP前导肽-人生长激素融合蛋白的氨基酸序列为I GPRGLPGERG RPGAPGPAGA RGNDGATGAA GPPGPTGPAG PPGFPEFKRE AFPTIPLSRL61 FDNAMLRARR LYQLAYDTYQ EFEEAYILKE QKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNRVKTQQ121 KSNLELLRIS LLLIQSffLEP VQLLRSVFAN SLVYGASDSN VYRHLKDLEE GIQTLMWRLE181 DGSPRTGQIF NQSYSKFDTK SHNDDALLKN YGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC241 GF前导肽-人生长激素融合蛋白的氮端为I型人胶原蛋白302 346基序的45个氨基酸组成的前导肽，碳端为人生长激素的191个氨基酸，两段氨基酸序列之间添加PPIC9K载体自身α信号肽切割位点Lys-Arg-Glu-Ala、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸,分泌表达时切割获得基因重组人生长激素。基因重组人生长激素的氨基酸序列如下I FPTIPLSRLF DNAMLRARRL YQLAYDTYQE FEEAYILKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT61 PSNRVKTQQK SNLELLRISL LLIQSffLEPV QLLRSVFANS LVYGASDSNV YRHLKDLEEG121 IQTLMWRLED GSPRTGQIFN QSYSKFDTKS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV181 QCRSVEGSCG F上述基因重组人生长激素的制备方法包括下述步骤I、基因的获得从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计I型人胶原蛋白302 346基序前导肽和人生长激素PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I ,EcoR I、Not K α信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，I型人胶原蛋白302 346基序前导肽和人生长激素的引物序列如下；I型人胶原蛋白302 346基序前导肽引物序列F: CGCTCGAGGGCCCCCGTGGCCTGCR: CGGAATTCAGGGAAGCCAGGAGGACCAG人生长激素引物序列F: GCGAATTCAAACGAGAAGCTTTCCCAACCATTCCCTTATCR: TAGCGGCCGCCTAGAAGCCACAGCTGC采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白302 346基序前导肽和人生长激素基因；I型人胶原蛋白302 346基序前导肽的基因序列如下
I GGCCCCCGTG GCCTGCCTGG TGAGAGAGGT CGCCCTGGAG CCCCTGGCCC TGCTGGTGCT61 CGTGGAAATG ATGGTGCTAC TGGTGCTGCC GGGCCCCCTG GTCCCACCGG CCCCGCTGGT121 CCTCCTGGCT TCCCT人生长激素基因序列如下I TTCCCAACCA TTCCCTTATC CAGGCTTTTT GACAACGCTA TGCTCCGCGC CCGTCGCCTG61 TACCAGCTGG CATATGACAC CTATCAGGAG TTTGAAGAAG CCTATATCCT GAAGGAGCAG121 AAGTATTCAT TCCTGCAGAA CCCCCAGACC TCCCTCTGCT TCTCAGAGTC TATTCCAACA181 CCTTCCAACA GGGTGAAAAC GCAGCAGAAA TCTAACCTAG AGCTGCTCCG CATCTCCCT G241 CTGCTCATCC AGTCATGGCT GGAGCCCGTG CAGCTCCTCA GGAGCGTCTT CGCCAACAGC301 CTGGTGTATG GCGCCTCGGA CAGCAACGTC TATCGCCACC TGAAGGACCT AGAGGAAGGC361 ATCCAAACGC TGATGTGGAG GCTGGAAGAT GGCAGCCCCC GGACTGGGCA GATCTTCAAT421 CAGTCCTACA GCAAGTTTGA CACAAAATCG CACAACGATG ACGCACTGCT CAAGAACTAC481 GGGCTGCTCT ACTGCTTCAG GAAGGACATG GACAAGGTCG AGACATTCCT GCGCATCGTG541 CAGTGCCGCT CTGTGGAGGG CAGCTGTGGC TTCTAG2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白以及人生长激素的连接对载体pPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-Leader ;对pPIC9K-Leader质粒与人生长激素分别进行EcoR I及Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-Leader-GH。该重组DNA序列如下I CTCGAGGGCC CCCGTGGCCT GCCTGGTGAG AGAGGTCGCC CTGGAGCCCC TGGCCCTGCT61 GGTGCTCGTG GAAATGATGG TGCTACTGGT GCTGCCGGGC CCCCTGGTCC CACCGGCCCC121 GCTGGTCCTC CTGGCTTCCC TGAATTCAAA CGAGAAGCTT TCCCAACCAT TCCCTTATCC181 AGGCTTTTTG ACAACGCTAT GCTCCGCGCC CGTCGCCTGT ACCAGCTGGC ATATGACACC241 TATCAGGAGT TTGAAGAAGC CTATATCCTG AAGGAGCAGA AGTATTCATT CCTGCAGAAC301 CCCCAGACCT CCCTCTGCTT CTCAGAGTCT ATTCCAACAC CTTCCAACAG GGTGAAAACG361 CAGCAGAAAT CTAACCTAGA GCTGCTCCGC ATCTCCCTGC TGCTCATCCA GTCATGGCTG421 GAGCCCGTGC AGCTCCTCAG GAGCGTCTTC GCCAACAGCC TGGTGTATGG CGCCTCGGAC481 AGCAACGTCT ATCGCCACCT GAAGGACCTA GAGGAAGGCA TCCAAACGCT GATGTGGAGG541 CTGGAAGATG GCAGCCCCCG GACTGGGCAG ATCTTCAATC AGTCCTACAG CAAGTTTGAC601 ACAAAATCGC ACAACGATGA CGCACTGCTC AAGAACTACG GGCTGCTCTA CTGCTTCAGG661 AAGGACATGG ACAAGGTCGA GACATTCCTG CGCATCGTGC AGTGCCGCTC TGTGGAGGGC721 AGCTGTGGCT TCTAGGCGGC CGC3、毕赤酵母电转化将10 μ g经Sal I内切酶线性化的pPIC9K-Leader_GH质粒，与80 μ L毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至O. 2cm冰预冷的电转化杯中，电击4 10毫秒，加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30 1倒置培养2 3天，在MD培养基平板上长出菌落。4、多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为O. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培养，筛选获得转化子。5、前导肽-人生长激素融合蛋白毕赤酵母发酵将筛选到的基因工程菌接种于400ml BMGY培养基中，30 1振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30 V，pH值为5. 0，培养16 20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30°C，诱导温度29°C，pH值为4. 5，溶氧控制在20% 30%，流加入质量浓度为75%的含12 mL/LPTMl微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0. 25，诱导发酵36 42小时。在蛋白发酵分泌表达出胞外的过程中，细胞壁中所含有的蛋白酶切割α信号肽切割位点，切割出人生长激素。6、基因重组人生长激素的纯化 发酵结束后，发酵液尚心分尚，取上清液，用分子截留量为60000D或80000D或100000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为6000D或10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得人生长激素粗蛋白浓缩液；用Sephacryl SlOO分子筛层析分离人生长激素粗蛋白浓缩液，然后用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析，收集洗脱液，超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，获得基因重组人生长激素，基因重组人生长激素的氨基酸序列如下I FPTIPLSRLF DNAMLRARRL YQLAYDTYQE FEEAYILKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT61 PSNRVKTQQK SNLELLRISL LLIQSffLEPV QLLRSVFANS LVYGASDSNV YRHLKDLEEG121 IQTLMWRLED GSPRTGQIFN QSYSKFDTKS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV181 QCRSVEGSCG F在本发明的重组人生长激素的纯化步骤6中，发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为100000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为6000D的卷式超滤膜超滤,收集浓缩液,得人生长激素粗蛋白浓缩液；用Sephacryl SlOO分子筛层析分离人生长激素粗蛋白浓缩液，然后用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析，收集洗脱液，超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，获得基因重组人生长激素。本发明以I型胶原蛋白302 346基序作为前导肽引导人生长激素高表达，通过毕赤酵母高密度发酵及一系列纯化方法获得高纯度的人生长激素，为重组人生长激素临床应用的进一步扩展奠定了基础。
图I是实施例I中表达载体pPIC9K-Leader_GH的质粒图谱。图2是实施例I中前导肽与人生长激素基因的PCR产物电泳图。图3是实施例I中人生长激素的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图4是实施例I中人生长激素的Western Blot鉴定图下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例I以I型人胶原蛋白氨基酸302 346基序作为前导肽引导人生长激素表达的前导肽-人生长激素融合蛋白，I型人胶原蛋白氨基酸302 346基序的氨基酸序列为
I GPRGLPGERG RPGAPGPAGA RGNDGATGAA GPPGPTGPAG PPGFP前导肽-人生长激素融合蛋白的氨基酸序列为I GPRGLPGERG RPGAPG PAGA RGNDGATGAA GPPGPTGPAG PPGFPEFKRE AFPTIPLSRL61 FDNAMLRARR LYQLAYDTYQ EFEEAYILKE QKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNRVKTQQ121 KSNLELLRIS LLLIQSffLEP VQLLRSVFAN SLVYGASDSN VYRHLKDLEE GIQTLMWRLE181 DGSPRTGQIF NQSYSKFDTK SHNDDALLKN YGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC241 GF前导肽-人生长激素融合蛋白的氮端为I型人胶原蛋白302 346基序的45个氨基酸组成的前导肽，碳端为人生长激素的191个氨基酸，两段氨基酸序列之间添加PPIC9K载体自身α信号肽切割位点Lys-Arg-Glu-Ala、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸,分泌表达时切割获得基因重组人生长激素。基因重组人生长激素的氨基酸序列如下I FPTIPLSRLF DNAMLRARRL YQLAYDTYQE FEEAYILKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT61 PSNRVKTQQK SNLELLRISL LLIQSffLEPV QLLRSVFANS LVYGASDSNV YRHLKDLEEG121 IQTLMWRLED GSPRTGQIFN QSYSKFDTKS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV181 QCRSVEGSCG F上述基因重组人生长激素的制备方法包括下述步骤I、基因的获得从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA,采用GeneCopoeia First-Strand cDNAsynthesis Kit试剂盒按说明书的使用方法进行反转录，获得cDNA, GeneCopoeiaFirst-Strand cDNA synthesis Kit试剂盒由西安依科生物技术有限公司销售。根据I型人胶原蛋白及人生长激素基因序列，设计I型人胶原蛋白302 346基序前导肽及人生长激素基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I ,EcoR I ,Not I、α信号肽切割位点AAACGAGAAGCT, I型人胶原蛋白302 346基序前导肽及人生长激素基因引物序列如下I型人胶原蛋白302 346基序前导肽(leader)引物序列F: CGCTCGAGGGCCCCCGTGGCCTGCR: CGGAATTC AGGGAAGCCAGGAGGACCAG人生长激素(GH)引物序列F: GCGAATTCAAACGAGAAGCTTTCCCAACCATTCCCTTATCR: TAGCGGCCGCCTAGAAGCCACAGCTGC采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白302 346基序前导肽和人生长激素基因，PCR扩增方法为25 μ L反应体系中含有13. 3μ L灭菌的二次蒸馏水、2. 5μ L IOXPCRbuffer, 3. 5 μ L 2 m mol/L dNTP Mix, 2. 5 μ L MgCl2,1 μ L 10 μ mol/L Primer F, I μ L10ymol/L Primer R,0. 2μ L 0.5 U/μ L Taq 酶，I μ L cDNA 模板。反应条件为95°C 5 分钟，94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 30秒，30个循环，72°C 10分钟，4 10分钟，用PCR仪对I型人胶原蛋白和人生长激素进行PCR扩增，PCR扩增结果见图2，由图2可见，I型人胶原蛋白302 346基序前导肽PCR扩增产物在150bp处出现特异性条带，与I型人胶原蛋白302 346基序前导肽设计的基因序列大小一致，人生长激素基因PCR扩增产物在570bp处出现特异性条带，与人生长激素基因设计的基因序列大小一致。2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白以及人生长激素的连接
(I)载体pPIC9K和I型人胶原蛋白的双酶切对载体pPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I进行双酶切，pPIC9K载体购于美国Invitrogen公司。双酶切体系如下
权利要求
1.一种基因重组人生长激素的制备方法，其特征在于它包括下述步骤 (1)基因的获得 从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得CDNA，设计I型人胶原蛋白302 346基序前导肽和人生长激素PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I ,EcoR I ,Not I、α信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，I型人胶原蛋白302 346基序前导肽和人生长激素的引物序列如下； I型人胶原蛋白302 346基序前导肽引物序列F: CGCTCGAGGGCCCCCGTGGCCTGCR: CGGAATTCAGGGAAGCCAGGAGGACCAG人生长激素引物序列F: GCGAATTCAAACGAGAAGCTTTCCCAACCATTCCCTTATCR: TAGCGGCCGCCTAGAAGCCACAGCTGC 采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白302 346基序前导肽和人生长激素基因；I型人胶原蛋白302 346基序前导肽的基因序列如下 IGGCCCCCGTG GCCTGCCTGG TGAGAGAGGT CGCCCTGGAG CCCCTGGCCC TGCTGGTGCT .61CGTGGAAATG ATGGTGCTAC TGGTGCTGCC GGGCCCCCTG GTCCCACCGG CCCCGCTGGT . 121 CCTCCTGGCT TCCCT 人生长激素基因序列如下 ITTCCCAACCA TTCCCTTATC CAGGCTTTTT GACAACGCTA TGCTCCGCGC CCGTCGCCTG . 61TACCAGCTGG CATATGACAC CTATCAGGAG TTTGMGAAG CCTATATCCT GAAGGAGCAG . 121 MGTATTCAT TCCTGCAGAA CCCCCAGACC TCCCTCTGCT TCTCAGAGTC TATTCCMCA .181 CCTTCCAACA GGGTGAAMC GCAGCAGAAA TCTAACCTAG AGCTGCTCCG CATCTCCCTG .241 CTGCTCATCC AGTCATGGCT GGAGCCCGTG CAGCTCCTCA GGAGCGTCTT CGCCAACAGC . 301 CTGGTGTATG GCGCCTCGGA CAGCMCGTC TATCGCCACC TGAAGGACCT AGAGGAAGGC .361 ATCCAMCGC TGATGTGGAG GCTGGAAGAT GGCAGCCCCC GGACTGGGCA GATCTTCMT .421 CAGTCCTACA GCAAGTTTGA CACAAAATCG CACAACGATG ACGCACTGCT CAAGAACTAC .481GGGCTGCTCT ACTGCTTCAG GAAGGACATG GACMGGTCG AGACATTCCT GCGCATCGTG .541 CAGTGCCGCT CTGTGGAGGG CAGCTGTGGC TTCTAG (2)载体pPIC9K与I型人胶原蛋白以及人生长激素的连接 对载体PPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-Leader ;对pPIC9K-Leader质粒与人生长激素分别进行EcoR I及Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-Leader-GH ； 该重组DNA序列如下 ICTCGAGGGCC CCCGTGGCCT GCCTGGTGAG AGAGGTCGCC CTGGAGCCCC TGGCCCTGCT .61GGTGCTCGTG GAAATGATGG TGCTACTGGT GCTGCCGGGC CCCCTGGTCC CACCGGCCCC . 121 GCTGGTCCTC CTGGCTTCCC TGMTTCMA CGAGAAGCTT TCCCAACCAT TCCCTTATCC .181 AGGCTTTTTG ACAACGCTAT GCTCCGCGCC CGTCGCCTGT ACCAGCTGGC ATATGACACC .241 TATCAGGAGT TTGAAGMGC CTATATCCTG AAGGAGCAGA AGTATTCATT CCTGCAGAAC.301 CCCCAGACCT CCCTCTGCTT CTCAGAGTCT ATTCCAACAC CTTCCAACAG GGTGAAMCG . 361 CAGCAGAAAT CTAACCTAGA GCTGCTCCGC ATCTCCCTGC TGCTCATCCA GTCATGGCTG.421 GAGCCCGTGC AGCTCCTCAG GAGCGTCTTC GCCAACAGCC TGGTGTATGG CGCCTCGGAC.481 AGCAACGTCT ATCGCCACCT GAAGGACCTA GAGGMGGCA TCCAMCGCT GATGTGGAGG .541 CTGGAAGATG GCAGCCCCCG GACTGGGCAG ATCTTCAATC AGTCCTACAG CAAGTTTGAC .601 ACAAMTCGC ACAACGATGA CGCACTGCTC MGAACTACG GGCTGCTCTA CTGCTTCAGG .661 AAGGACATGG ACAAGGTCGA GACATTCCTG CGCATCGTGC AGTGCCGCTC TGTGGAGGGC .721 AGCTGTGGCT TCTAGGCGGC CGC (3)毕赤酵母电转化 将10 μ g经Sal I内切酶线性化的pPIC9K-Leader-GH质粒，与80 μ L毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至O. 2cm冰预冷的电转化杯中，电击4 10毫秒，加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30 1倒置培养2 3天，在MD培养基平板上长出菌落； (4)多拷贝插入重组子的筛选 将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为O. 5g/L、lg/L、.2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培养，筛选获得转化子； (5)前导肽-人生长激素融合蛋白毕赤酵母发酵 将筛选到的基因工程菌接种于400ml BMGY培养基中，30 1振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30 °C，pH值为5.0，培养.16 20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30°C，诱导温度29°C，pH值为4. 5，溶氧控制在20% 30%，流加入质量浓度为75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0. 25，诱导发酵36 42小时。在蛋白发酵分泌表达出胞外的过程中，细胞壁中所含有的蛋白酶切割α信号肽切割位点，切割出人生长激素； (6)基因重组人生长激素的纯化 发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为60000D或80000D或100000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为6000D或10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得人生长激素粗蛋白浓缩液；用Sephacryl SlOO分子筛层析分离人生长激素粗蛋白浓缩液，然后用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析，收集洗脱液，超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，获得基因重组人生长激素，基因重组人生长激素的氨基酸序列如下 IFPTIPLSRLF DNAMLRARRL YQLAYDTYQE FEEAYILKEQ KYSFLQNPQTSLCFSESIPT . 61PSNRVKTQQK SNLELLRISL LLIQSffLEPV QLLRSVFANS LVYGASDSNVYRHLKDLEEG . 121IQTLMffRLED GSPRTGQIFN QSYSKFDTKS HNDDALLKNY GLLYCFRKDMDKVETFLRIV . 181QCRSVEGSCG F 。
2.按照权利要求I所述的基因重组人生长激素的制备方法，其特征在于在重组人生长激素的纯化步骤(6)中，发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为100000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液,用分子量为6000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得人生长激素粗蛋白浓缩液；用Sephacryl SlOO分子筛层析分离人生长 激素粗蛋白浓缩液，然后用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析，收集洗脱液，超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，获得基因重组人生长激素。
全文摘要
一种基因重组人生长激素的制备方法，包括步骤基因的获得、载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白以及人生长激素的连接、毕赤酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、前导肽-人生长激素融合蛋白毕赤酵母发酵、基因重组人生长激素的纯化步骤。本发明以Ⅰ型胶原蛋白302～346基序作为前导肽引导人生长激素高表达，通过毕赤酵母高密度发酵及一系列纯化方法获得高纯度的人生长激素，为重组人生长激素临床应用的进一步扩展奠定了基础。本发明具有生产工艺简单、蛋白表达量高、纯度高的特点，可用于制备基因重组人生长激素。
文档编号C07K1/18GK102925451SQ201210138578
公开日2013年2月13日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者李哲, 侯增淼, 高恩, 严淋, 赵金礼 申请人:陕西东大生化科技有限责任公司