专利名称：清蛋白融合蛋白的制作方法
清蛋白融合蛋白本申请是申请日为2005年02月09日，申请号为200580012252. 5 (国际申请号为PCT/US2005/004041)，名称为“清蛋白融合蛋白”的发明专利申请的分案申请。光盘中的序列表的介绍本申请涉及下文列出的“序列表”，它作为电子文件在标有“拷贝1”、“拷贝2”和“拷贝3”的三张相同的光盘(⑶-R)上提供。这些光盘每个都含有文件“PF612PCT SL.txt”(929，048个字节，建于2005年2月7日)，将其完整引入作为參考。
背景技术：
本发明主要涉及与清蛋白或清蛋白的片段或变体融合的治疗性蛋白质(包括但不限于至少一种多肽、抗体、肽或其片段和变体)。本发明涵盖编码治疗性清蛋白融合蛋白的多核苷酸、治疗性清蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、制剂和试剂盒。本发明还涵盖经过 编码治疗性清蛋白融合蛋白的多核苷酸转化的宿主细胞，以及使用这些多核苷酸和/或宿主细胞来生成本发明清蛋白融合蛋白的方法。人血清清蛋白(HSA或HA)，其成熟形式具有585个氨基酸的ー种蛋白质(如表KSEQ ID N0:1)所示)，负责血清渗透压的重大比例，而且还作为内源和外源配体的载体而起作用。目前，临床使用的HA是从人血中提取而生产的。在微生物中生产重组HA (rHA)已在EP 330 451和EP 361 991中公开。天然状态或重组生成的治疗性蛋白质，诸如干扰素和生长激素，通常是呈现短暂保存期的不稳定分子，特别是在水溶液中配制时。在配制用于施用时，这些分子的不稳定性提示很多分子必须冻干并在贮藏时一直冷藏，因而使得这些分子难以运输和/或贮藏。当药学制剂必须在医院环境以外贮藏和分配吋，贮藏问题就显得特别尖鋭。对于不稳定蛋白质分子的贮藏问题的实用解决方案少有提出。因此，需要稳定的、持久的、容易分配的蛋白质治疗性分子制剂，优选需要最小限度贮藏后操作的简单制剂。体内施用后，天然状态或重组生成的治疗性蛋白质，诸如干扰素和生长激素，由于从血流中迅速清除从而呈现短暂的血浆稳定性。因此，这些蛋白质提供的治疗效果也是短期的。因此，为了維持它们的期望体内治疗效果，这些蛋白质从血液中迅速清除提示必须以更高频率或更高剂量施用治疗性分子。然而，増加施用治疗性蛋白质的服药方案常常导致患者的注射部位的反应、副作用、和毒性増加。类似的，以更高剂量施用治疗性蛋白质也常常导致患者的毒性和副作用増加。已提议的提高治疗性分子的血浆稳定性的少数实用解决方案，包括化学缀合，为患者带来有限的受益。通常，在多数情况中，这些化学修饰的治疗性分子仍以频繁的服药方案施用，在患者中保持严重的注射部位反应、副作用、和毒性。因此，需要稳定形式的治疗性分子，它能在体内保持比単独的天然状态或重组生成的治疗性蛋白质更高的血浆稳定性并可以较低频率施用，从而降低对患者的潜在副作用。发明概述本发明涵盖包含与清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体融合的治疗性蛋白质(如多肽、抗体、或肽或其片段或变体)的清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖包含编码与清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体融合的治疗性蛋白质(如多肽、抗体、或肽或其片段或变体)的核酸分子或由其组成的多核苷酸。本发明还涵盖包含编码如下蛋白质的核苷酸分子或由其组成的多核苷酸，该蛋白质包含与清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体融合的治疗性蛋白质(如多肽、抗体、或肽或其片段或变体)，该清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体足以延长治疗性蛋白质的保存期，与其未融合状态相比提高治疗性蛋白质的血浆稳定性，和/或在体外和/或在体内稳定溶液中(或药物组合物中)的治疗性蛋白质和/或其活性。本发明还涵盖由本发明多核苷酸编码的清蛋白融合蛋白，以及经过本发明多核苷酸转化的宿主细胞，及使用本发明的这些多核苷酸和/或宿主细胞和生成本发明的清蛋白融合蛋白的方法。在本发明的一个优选方面，清蛋白融合蛋白包括但不限于表2中所描述的那些蛋白质和编码此类蛋白质的多核苷酸。本发明还涵盖包含本发明清蛋白融合蛋白和制药学可接受稀释剂或载体的药学制剂。这些制剂可装在试剂盒或容器中。该试剂盒或容器可与关于该治疗性蛋白质的延长 保存期的说明书一起包装。这些制剂可用于在患者中治疗、预防、改善或诊断疾病或疾病症状的方法，包括对患者施用药学制剂的步骤，其中患者优选哺乳动物，最优选人类。在其它实施方案中，本发明涵盖预防、治疗或改善疾病或紊乱的方法。在优选的实施方案中，本发明涵盖治疗表I “优选适应症γ”列中所列出的疾病或紊乱的方法，包括以有效治疗、预防或改善疾病或紊乱的数量对需要这种治疗、预防或改善的患者施用本发明的清蛋白融合蛋白，该清蛋白融合蛋白包含与表I “治疗性蛋白质χ”列(与表I “优选适应症Y”列中所列出的待治疗疾病或紊乱位于同一行)中所公开的治疗性蛋白质(或其片段或变体)对应的治疗性蛋白质或其部分。在一个实施方案中，表I或2中所描述的清蛋白融合蛋白具有延长的保存期。在另ー个实施方案中，表I或2中所描述的清蛋白融合蛋白比表I中所描述的相应未融合治疗性分子更加稳定。本发明还包括修饰后含有本发明核酸分子(包括但不限于表I和2中所描述的多核苷酸)的转基因生物体，优选修饰后表达本发明清蛋白融合蛋白的转基因生物体。具体地，本发明涉及如下方面I.包含选自下组的成员的清蛋白融合蛋白(a)治疗性蛋白质X和包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的清蛋白；(b)治疗性蛋白质X和SEQ ID NO 1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性；(c)治疗性蛋白质X和SEQ ID NO 1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性，且其中所述清蛋白活性是与未融合状态的治疗性蛋白质x的保存期相比延长治疗性蛋白质x的保存期的能力；(d)治疗性蛋白质X和SEQ ID NO 1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性，且其中所述片段或变体包含SEQ ID NO 1的氨基酸1-387的氨基酸序列；(e)治疗性蛋白质X的片段或变体和包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列的清蛋白，其中所述片段或变体具有治疗性蛋白质x的生物学活性；
(f) (a)-(e)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质x或其片段或变体融合在清蛋白的N-末端，或清蛋白片段或变体的N-末端；(g) (a)-(e)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质X或其片段或变体融合在清蛋白的C-末端，或清蛋白片段或变体的C-末端；(h) (a)-(e)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质x或其片段或变体融合在清蛋白的N-末端和C-末端，或清蛋白片段或变体的N-末端和C-末端；(i) (a)-(e)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，它包含第一治疗性蛋白质x或其片段或变体和第二治疗性蛋白质x或其片段或变体，其中所述第一治疗性蛋白质x或其片段或变体不同于所述第二治疗性蛋白质x或其片段或变体； (j) (a)-(i)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质x或其片段或变体通过接头与所述清蛋白或清蛋白片段或变体分开；和(k) (a)-(j)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白具有如下通式R1-L-R2 ；R2-L-R1 ;或R1-L-R2-L-R1，且其中Rl是治疗性蛋白质X或其片段或变体，L是肽接头，而R2是包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列的清蛋白或清蛋白的片段或变体。2.项I的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白的保存期或血浆稳定性大于未融合状态的治疗性蛋白质x或其片段或变体的保存期或血浆稳定性。3.项I的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的治疗性蛋白质-X或其片段或变体的体外生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白质x或其片段或变体的体外生物学活性。4.项I的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体内生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白质x或其片段或变体的体内生物学活性。5.包含插入到清蛋白或其片段或变体中的治疗性蛋白质X或其片段或变体的清蛋白融合蛋白，包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列或其片段或变体。6.包含插入到清蛋白或其片段或变体中的治疗性蛋白质X或其片段或变体的清蛋白融合蛋白，包含选自下组的ー个或多个氨基酸序列(a) SEQ ID NO: I 的氨基酸 54-61 ；(b) SEQ ID NO 1 的氨基酸 76-89 ；(c)SEQ ID NO 1 的氨基酸 92-100 ；(d)SEQ ID NO 1 的氨基酸 170-176 ；(e)SEQ ID NO 1 的氨基酸 247-252 ；(f) SEQ ID NO 1 的氨基酸 266-277 ；(g) SEQ ID NO 1 的氨基酸 280-288 ；
(h) SEQ ID NO : I 的氨基酸 362-368 ；(i)SEQ ID NO :1 的氨基酸 439-447 ；(j) SEQ ID NO :1 的氨基酸 462-475 ；(k)SEQ ID NO :1 的氨基酸 478-486 ;和(I)SEQ ID NO: I 的氨基酸 560-566。7.项5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质x或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比足以延长治疗性蛋白质x或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的部分清蛋白。8.项6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质x或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比足以延长治疗性蛋白质x或其片段 或变体的保存期或血浆稳定性的部分清蛋白。9.项5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质χ或其片段或变体的体外生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质x或其片段或变体的体外生物学活性的部分清蛋白。10.项6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质χ或其片段或变体的体外生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质x或其片段或变体的体外生物学活性的部分清蛋白。11.项5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质χ或其片段或变体的体内生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质x或其片段或变体的体内生物学活性的部分清蛋白。12.项6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质χ或其片段或变体的体内生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质x或其片段或变体的体内生物学活性的部分清蛋白。13.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是非糖基化的。14.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是在酵母中表达的。15.项14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化缺陷的。16.项14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化和蛋白酶缺陷的。17.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是由哺乳动物细胞表达的。18.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白是由培养中的哺乳动物细胞表达的。19.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白还包含分泌前导序列。20.包含项1-12任一项的清蛋白融合蛋白和制药学可接受载体的组合物。21.包含项20的组合物的试剂盒。22.治疗患者的疾病或紊乱的方法，包括施用项1-12任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。23.项22的方法，其中所述疾病或紊乱包含适应症Y。24.治疗患有受治疗性蛋白质X或其片段或变体调节的疾病或素乱的患者的方法，包括施用有效量的项1-12任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。
25.项24的方法，其中所述疾病或紊乱是适应症Y。26.延长治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的方法，包括将治疗性蛋白质X或其片段或变体与清蛋白或其片段或变体融合的步骤，与未融合状态的治疗性蛋白质x或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比，所述清蛋白或其片段或变体足以延长治疗性蛋白质x或其片段或变体的保存期或血浆稳定性。27.核酸分子，包含编码项1-12任一项的清蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。28.包含项27的核酸分子的载体。29.包含项28的核酸分子的宿主细胞。附图简述
图IA-D显示了人清蛋白的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID N0:1)和编码它的多核苷酸(SEQ ID NO 2)0 SEQ ID NO :2的核苷酸1-1755编码人清蛋白的成熟形式(SEQ IDNO :1)。图2显示了 pPPC0005克隆载体ATCC保藏物PTA-3278的限制性图谱。图3显示了 pSAC35酿酒酵母表达载体的限制性图谱(Sleep等人,BioTechnology8 42,1990)。图4显示了由CID 2011和2053中包含的DNA所编码的IFNb清蛋白融合蛋白的各种稀释度在ISRE-SEAP/293F报道细胞中对SEAP活性的影响(见实施例76)。将蛋白质在DMEM/10%FBS中连续稀释，从5e_7到le_14g/ml，并用于处理ISRE-SEAP/293F报道细胞。24小时后由报道细胞取出上清液并测定SEAP活性。从三个稳定克隆293F/#2011、CH0/#2011和NS0/#2053纯化IFNb清蛋白融合蛋白。哺乳动物衍生的IFNb，Avonex来自Biogen且据报道有2. 0e5IU/yg的比活。图5比较了由CID 3165编码的IFN清蛋白融合蛋白(CID 3165蛋白质)和重组蛋白IFNa (rIFNa)对Hs294T黑素瘤细胞的抗增殖活性。将细胞在含不同浓度CID 3165蛋白质或rIFNa的培养基中进行培养，并在培养3天后通过BrdU掺入来測量增殖情況。CID3165蛋白质在浓度高于10ng/ml时对细胞增殖引起了可测量的抑制作用，在约200ng/ml时达到了 50% 抑制。(■ )=CID 3165 蛋白质，( )=rIFNa。图6显示了 IFNa清蛋白融合蛋白的各种稀释度在ISRE-SEAP/293F报道细胞中对SEAP活性的影响。测试了在清蛋白的上游融合IFNa的一种制备物( )以及在清蛋白的下游融合IFNa的两种不同制备物(籲)和( )。图7显示了由构建物2249中包含的DNA所编码的IFNa清蛋白融合蛋白(CID 2249蛋白质)的时间和剂量在经过处理的猴子中对OAS(p41)mRNA水平的影响(见实施例78)。每个时间点第一条为赋形剂对照，第二条为第一天静脉内注射30 μ g/kg CID 2249蛋白质，第三条为第一天皮下注射30 μ g/kg CID 2249蛋白质，第四条为第一天皮下注射300μ g/kgCID 2249蛋白质，第五条为第一、三、五天皮下注射40 μ g/kg重组IFNa。图8显示了由构建物CID 3691和3618中包含的DNA所编码的BNP清蛋白融合蛋白(CID 3691和3618蛋白质)在NPR-A/293F报道细胞中对激活cGMP形成的剂量-应答关系(见实施例80和81)。测试了重组ΒΝΡ(·)以及在清蛋白的上游融合BNP的两种不同制备物(□)和(籲)。图9显示了 BNP清蛋白融合蛋白在自发性高血压大鼠中对平均动脉压的影响(见实施例80)。赋形剂(□)、重组BNP蛋白(·)、或BNP清蛋白融合蛋白(〇)通过尾部静脉注射进行投递。收缩压和舒张压通过套尾法(cuff-tail)进行记录。
图10显示了 11-12周龄的雄性C57/BL6小鼠在静脉内注射重组BNP蛋白质(·)或BNP清蛋白融合蛋白(O )后的血浆cGMP水平(见实施例80)。在静脉内注射后的几个时间点收集尾部血液制备血浆来测定cGMP水平。图11显示了禁食的约8周龄糖尿病db/db小鼠中在单次施用串联GLP-I (7-36A8G) 2x-HSA 融合物(CID 3610) ( )、单体 GLP-1 (7-36A8G)-HSA 融合物(Λ)、或単独的HSA(·)后24小时的血糖水平。血糖水平通过ロ服葡萄糖耐受测试法进行測量。在禁食的约8周龄糖尿病db/db小鼠中，在单次施用后24小吋，串联GLP-I (7-36A8G) 2x_HAS 融合物(CID 3610)( O )比单体 GLP-I (7-36A8G) -HSA 融合物(Δ )具有意想不到的更有效的使葡萄糖正常化的活性(glucose-normalizing activity)。发明详述定义提供下面的定义是为了便于理解贯穿本说明书所使用的某些术语。在用于本文吋，“多核苷酸”指具有编码如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，该融合蛋白包含以相同读码框与至少ー个治疗性蛋白质X (或其片段或变体)连接的至少ー个清蛋白(或其片段或变体)分子或由其组成；具有编码如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，该融合蛋白包含SEQ IDNO Y (如表2第6列所述)的氨基酸序列或其片段或变体或由其组成；具有包含SEQ ID NO :Χ所示序列或由其组成的核苷酸序列的核酸分子；具有编码如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，该融合蛋白包含SEQ ID NO :Ζ的氨基酸序列或由其组成；具有编码如表2或实施例中所述生成的本发明清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；具有编码本发明治疗性清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；具有表2中描述的清蛋白融合构建物所含有的核苷酸序列的核酸分子；或者具有于ATCC保藏的清蛋白融合构建物(如表3所述)所含有的核苷酸序列的核酸分子。在用于本文吋，“清蛋白融合构建物”指包含以相同读码框与编码至少ー个分子的治疗性蛋白质(或其片段或变体)的至少一段多核苷酸连接的编码至少ー个分子的清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸或由其组成的核酸分子；包含以相同读码框与编码至少ー个分子的如表2或实施例中所述产生的治疗性蛋白质(或其片段或变体)的至少一段多核苷酸连接的编码至少ー个分子的清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸或由其组成的核酸分子；或者包含以相同读码框与编码至少ー个分子的治疗性蛋白质(或其片段或变体)的至少一段多核苷酸连接的编码至少ー个分子的清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸或由其组成的核苷酸分子，它还包含例如一种或多种下列元件(I)功能性自主复制载体(包括但并不限于穿梭载体、表达载体、整合载体、和/或复制系统)，(2)转录起始区(例如启动子区，诸如例如可调节或可诱导的启动子、组成型启动子)，(3)转录终止区，(4)前导序列，和(5)选择标记。编码治疗性蛋白质和清蛋白的多核苷酸，一旦成为清蛋白融合构建物的一部分，每个可称为该清蛋白融合构建物的“部分”、“区域”或“模块”。本发明主要涉及编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸；清蛋白融合蛋白；以及使用清 蛋白融合蛋白或编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防或改善疾病或紊乱的方法。在用于本文吋，“清蛋白融合蛋白”指通过将至少ー个清蛋白(或其片段或变体)分子与至少一个治疗性蛋白质(或其片段或变体)分子融合而形成的蛋白质。本发明的清蛋白融合蛋白包含治疗性蛋白质的至少ー个片段或变体以及人血清清蛋白的至少ー个片段或变体，它们是通过基因融合相连的(即清蛋白融合蛋白是通过翻译如下核酸产生的，其中编码完整或部分治疗性蛋白质的多核苷酸以相同读码框与编码完整或部分清蛋白的多核苷酸相连接)。治疗性蛋白质和清蛋白蛋白质，一旦成为清蛋白融合蛋白的一部分，每个可称为该清蛋白融合蛋白的“部分”、“区域”或“模块”(例如“治疗性蛋白质部分”或“清蛋白蛋白质部分”)。在高度优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白包含治疗性蛋白质X或其片段或变体(包括但不限于治疗性蛋白质X的成熟形式)的至少ー个分子以及清蛋白或其片段或变体(包括但不限于清蛋白的成熟形式)的至少ー个分子。在另ー个优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白由宿主细胞加工并分泌到周围的培养基中。在用于表达的宿主的分泌途径中发生的对新生清蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于信号肽切割、ニ硫键形成、正确折叠、碳水化合物的添加和加工(诸如例如N-和O-连接的糖基化)、特异性蛋白水解切割、和组装成多聚体蛋白质。本发明的清蛋白融合蛋白优选是经过加工形式的。在最优选的实施方案中，“清蛋白融合蛋白的经过加工形式”指经过N-末端信号肽切割的清蛋白融合蛋白产物，本文还称为“成熟的清蛋白融合蛋 白，，。在几种情况中，具有代表性的含有本发明清蛋白融合构建物的克隆保藏于美国典型培养物保藏中心(本文称为“ATCC ”)。此外，通过本领域已知的和本文其它地方描述的技术有可能从保藏物重新得到指定的清蛋白融合构建物。ATCC 位于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳萨斯镇大学路 10801 号(10801 University Boulevard, Manassas,Virginia 20110-2209, USA)。ATCC 保藏物是根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际公认的微生物保藏条款生成的。在一个实施方案中，本发明提供了编码包含治疗性蛋白质和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，本发明提供了由表2中描述的多核苷酸所编码的包含治疗性蛋白质和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在另ー个优选的实施方案中，本发明提供了编码其序列显示于表2中SEQ IDNO Y的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗性活性片段和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗性活性变体和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白质成分是血清清蛋白的成熟部分。本发明还涵盖编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在另外的实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗性活性片段或由其组成的清蛋白融合蛋白。在另外的实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗性活性变体或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是治疗性蛋白质的成熟部分。在另ー个优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是治疗性蛋白质的胞外可溶性结构域。在候选实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是治疗性蛋白质的活性形式。本发明还涵盖编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在另外的实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗性活性片段或变体和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗性活性片段或变体或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分或由其组成的清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。治疗性蛋白质如上所述，本发明的多核苷酸编码包含治疗性蛋白质的至少ー个片段或变体和人血清清蛋白的至少ー个片段或变体或由其组成的蛋白质，所述片段或变体是优选通过基因融合而彼此相连的。另ー个实施方案包括编码包含治疗性蛋白质的至少ー个片段或变体和人血清清蛋白的至少ー个片段或变体或由其组成的蛋白质的多核苷酸，所述片段或变体是通过化学 缀合而彼此相连的。在用于本文吋，“治疗性蛋白质”指具有一种或多种治疗性和/或生物学活性的蛋白质、多肽、抗体、肽或其片段或变体。本发明所涵盖的治疗性蛋白质包括但不限于蛋白质、多肽、肽、抗体、和生物制品。(术语肽、蛋白质、和多肽在本文中可互換使用)。明确设想了术语“治疗性蛋白质”涵盖抗体及其片段和变体。因此，本发明的蛋白质可含有治疗性蛋白质的至少ー个片段或变体和/或抗体的至少ー个片段或变体。此外，术语“治疗性蛋白质”可指治疗性蛋白质的内源性或天然存在的关联物。呈现“治疗性活性”的多肽或具有“治疗性活性”的蛋白质是指拥有与治疗性蛋白质诸如本文描述的或本领域其它途径已知的一种或多种治疗性蛋白质有关的ー种或多种已知生物学和/或治疗性活性的多肽。作为非限制性实例，“治疗性蛋白质”指可用于治疗、预防或改善疾病、状况或紊乱的蛋白质。作为非限制性实例，“治疗性蛋白质”可以是与特定细胞类型(正常的(如淋巴细胞)或异常的(如癌细胞))特异结合并因此可用于将化合物(药物或胞毒剂)特异靶向该细胞类型的蛋白质。例如，可由本发明的清蛋白融合蛋白包含的“治疗性蛋白质”部分的不完全列表包括但并不限于GLP-1、GLP-2、PACAP-27、PACAP-28、VIP、CD4M33、分泌素、胰高血糖素样肽、泌酸调节素、PHM、IFNa、IFNP、ANP、BNP、NGF、BDNF、⑶NF、和促生长素抑制素。干扰素杂化物(hybrid)也可融合于清蛋白的氨基或羧基末端以形成干扰素杂化物清蛋白融合蛋白。干扰素杂化物清蛋白融合蛋白可具有得到增强或者抑制的干扰素活性，诸如抗病毒应答、细胞生长的调控、和免疫应答的调节(Lebleu等人，PNAS USA 73:3107-3111,1976 ;Gresser 等人，Nature 251 :543-545,1974 ;及 Johnson, Texas ReportsBiol Med 35:357-369,1977)。每种干扰素杂化物清蛋白融合蛋白可用于治疗、预防、或改善病毒感染(如肝炎(如HCV);或HIV)、多发性硬化症、或癌症。在一个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分包含干扰素α_干扰素α杂化物(在本文中称为α-α杂化物)。例如，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的α-α杂化物部分包含与干扰素aD融合的干扰素αΑ或由其组成。在另ー个实施方案中，A/D杂化物在共有的BglII限制性位点处与干扰素a D融合，其中A/D杂化物的N-末端部分与干扰素a A的氨基酸1-62对应而C-末端部分与干扰素a D的氨基酸64-166对应。例如，此A/D杂化物将包含氨基酸序列CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRXJSLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX2DSILA VKKYFRRITLYLTEKKYSPCAffEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE (SEQ ID NO 99),
其中X1是R或K而X2是A或V (例如见构建物ID # 2875)。在另ー个实施方案中，A/D杂化物在共有的PvuIII限制性位点处融合，其中A/D杂化物的N-末端部分与干扰素a A的氨基酸1-91对应而C-末端部分与干扰素a D氨基酸93-166对应。例 如，此A/D杂化物将包含氨基酸序列CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRXJSLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX2DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAffEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE (SEQ ID NO 100),其中X1是1 或K而第二个X2是ム或V (例如见构建物ID# 2872)。这些杂化物在美国专利号4，414，510中有进ー步的描述，将其完整引入本文作为參考。在另ー个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的α-α杂化物部分包含与干扰素a F融合的干扰素a A或由其组成。在另ー个实施方案中，A/F杂化物在共有的PvuIII限制性位点处融合，其中A/F杂化物的N-末端部分与干扰素a A的氨基酸1_91对应而C-末端部分与干扰素a F的氨基酸93-166对应。例如，此A/F杂化物将包含氨基酸序列CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRXISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDMEACVIQEVGVEETPLMNVD SILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAffEVVRAEIMRSFSLSKIFQERLRRKE (SEQ ID NO 101),其中X或是R或是K (例如见构建物ID # 2874)。这些杂化物在美国专利号4，414，510中有进ー步的描述，将其完整引入本文作为參考。在另ー个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的α-α杂化物部分包含与干扰素αΒ融合的干扰素αΑ或由其组成。在另ー个实施方案中，Α/Β杂化物在共有的PvuIII限制性位点处融合，其中Α/Β杂化物的N-末端部分与干扰素a A的氨基酸1-91对应而C-末端部分与干扰素α B的氨基酸93-166对应。例如，此Α/Β杂化物将包含氨基酸序列CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRXJSLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNL
fstkdssaawdetlldkfytelyqqlndlex2x3x4x5qevgviesplmyedsilavrkyfqritlyltekkyssca
WEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE (SEQ ID NO 102),其中X1是R或K而X2到X5是SCVM或VIXD (例如见构建物ID # 2873)。这些杂化物在美国专利号4，414，510中有进ー步的描述，将其完整引入本文作为參考。在另ー个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分包含干扰素β_干扰素α杂化物(在本文中称为β-α杂化物)。例如，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的β-α杂化物部分包含与干扰素aD (在本文中称为干扰素α-I)融合的干扰素β -I或由其组成。在另ー个实施方案中，β-1/aD杂化物是这样融合的，其中N-末端部分与干扰素β -I的氨基酸1-73对应而C-末端部分与干扰素a D的氨基酸74-167对应。例如，此β -I/ a D杂化物将包含氨基酸序列MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNXDSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEI MRSLSLSTNLQERLRRKE (SEQ ID NO 103),其中X是A或V。这些杂化物在美国专利号4，758，428中有进ー步的描述，将其完整引入本文作为參考。在另ー个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分包含干扰素α_干扰素β杂化物(在本文中称为α-β杂化物)。例如，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的α-β杂化物部分包含与干扰素β-I融合的干扰素CiD (也称为干扰素α-l)或由其组成。在另ー个实施方案中，aD/β-Ι杂化物是这样融合的，其中N-末端部分与干扰素a D的氨基酸1-73对应而C-末端部分与干扰素β -I的氨基酸74-166对应。例如，此aD/β-Ι杂化物将包含氨基酸序列MCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMS SLHLKRYYGRIL HYLKAKEYSHCAffTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO 104)ο这些杂化物在美国专利号4，758，428中有进ー步的描述，将其完整引入本文作为參考。在另外的实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分可包含α-α干扰素杂化物、α-β干扰素杂化物、和干扰素杂化物的其它组合物。在另外的实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分可进行修饰以包括对干扰素杂化物氨基酸序列的突变、替代、删除、或添加。这些对干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的修饰可用于例如提高产量水平、提高稳定性、提高或降低活性、或赋予新的生物学特性。本发明涵盖上文所述干扰素杂化物清蛋白融合蛋白，以及含有编码这些多肽的多核苷酸的宿主细胞和包载体。在一个实施方案中，由上述多核苷酸编码的干扰素杂化物清蛋白融合蛋白具有延长的保存期。在另ー个实施方案中，由上述多核苷酸编码的干扰素杂化物清蛋白融合蛋白与相应的未融合干扰素杂化物分子相比在体外和/或在体内在溶液中(或在药物组合物中)具有更长的血清半衰期和/或更稳定的活性。在另ー个非限制性实例中，“治疗性蛋白质”指具有生物学活性特别是可用于治疗、预防或改善疾病的生物学活性的蛋白质。治疗性蛋白质可具有的生物学活性的不完全列表包括抑制细胞的HIV-I感染、刺激肠上皮细胞增殖、降低肠上皮细胞通透性、刺激胰岛素分泌、诱导支气管扩张和血管舒张、抑制醛固酮和肾素分泌、调节血压、促进神经生长、增强免疫应答、增强炎症、抑制食欲、或者下文“生物学活性”部分所描述的和/或表I (第二列)对指定治疗性蛋白质所公开的任何ー种或多种生物学活性。在一个实施方案中，将IFN-P-HSA融合物用于抑制埃博拉病毒(Ebola virus)和SARS病毒(多伦多-2毒株，Toronto-2 strain)。例如，在Vero细胞中评估了融合于成熟HSA上游的IFN-β (CID 2053蛋白)针对埃博拉病毒和SARS病毒的体外抗病毒活性。以细胞病理效应(CPE)的抑制作用和细胞存活力的中性红测定法为基础，将这些细胞用于评估CID 2053蛋白质的保护作用。体外信号转导通过基因表达分析进行评估。另外，CID 2053蛋白质的药动学和药效学在恒河猴中进行评估。结果显示以有利的安全指数实现了有力的体外抗病毒活性。CID 2053蛋白质针对埃博拉病毒的IC50为O. 4ng/ml而针对SARS病毒的IC50为2ng/ml。阵列分析(array analysis)显示CID 2053蛋白质和IFN-β诱导一组相似基因的表达并引发IFN激发的应答元件(ISRE)信号转导途径。在以静脉内50 μ g/kg或皮下300 μ g/kg的剂量施用CID 2053蛋白质的恒河猴中，末端半衰期(terminal half-life)是36-40小时。施用CID 2053蛋白质引起血清新喋呤(neopterin)水平及OASl mRNA的表达的持续升高。在另ー个实施方案中，将IFN-a-HSA融合物用于抑制归类于A类-纤丝病毒(Filo)(埃博拉)、沙粒病毒(Arena) (Pichende)、B类-披膜病毒(Toga) (VEE)或C类-布尼亚病毒(Bunya)(庞塔托鲁(Punto toro))、黄病毒(Flavi)(黄热病、西尼罗(West Nile))的病毒因子。例如，采用CPE抑制、中性红染色和病毒产率测定法来评估融合于HSA下游的IFN-α (CID 3165蛋白质)的抗病毒活性。CID 3165蛋白质的药动学和药效学在恒河猴及人类受试者中进行评估。结果显示以有利的安全指数实现了针对所有RNA病毒的抗病毒活性。在CPE測定法中IC50值的范围为〈O. lng/ml (庞塔托鲁A)到19ng/ml (VEE)0在恒河猴中，CID 3165蛋白质的半衰期为90小时并在长达服药后14天仍能检测到。在人类受试者中，CID 3165蛋白质是安全的并且耐受性良好。单次注射服药后的Cmax与剂量成比例。在500 μ g组中平均Cmax为22ng/ml，而平均t1/2为150小吋。每2_4周或更长时间服药一次得到了药动学的支持。在单次注射组(120-500 μ g)中在多数受试者中观察到针对丙型肝炎的抗病毒反应。在另ー个实施方案中，将IFN-a-HSA融合物用于治疗慢性丙型肝炎感染(HCV)的患者。干扰素α，也称为干扰素alfa或白细胞干扰素，是治疗感染HCV患者的护理标准。术语“干扰素α ”指具有抗病毒活性的高度同源的相关多肽的家族。IFN-a-HAS融合物的干扰素α部分包含本领域已知的任何干扰素α或其片段或由其组成。本发明所涵盖的干扰素α的非限制性实例包括但不限于表I治疗性蛋白质一列中所公开的干扰素α蛋白质。在具体的实施方案中，干扰素α部分包含干扰素a-2a、干扰素a_2b、干扰素ci-2C、共有干扰素、干扰素alfacon-Ι、干扰素α-nl、干扰素α_η3、干扰素α的任何商品化形式诸如例如 INTRON A (Schering Corp.，Kenilworth, N. J. )、R0FER0N (Hoffman-La Roche, Nutley, N. J. )> Berofor α 干扰素(Boehringer IngelheimPharmaceutical,Inc., Ridgefied, Conn. )、OMNIFERON (Viragen,Inc., Plantation,FL)、MULTIFER0N (Viragen, Inc.，Plantation, FL)、WELLFER0N (GlaxoSmithKline，London, Great Britian)、INFERGEN ⑩(Amgen, Inc. , Thousands Oaks, CA)、SUMIFER0N (Sumitomo, Japan)>BELER0F0N (Nautilus Biotech,France)或任何纯化的干扰素 α 产品或其片段或由其组成。在另外的实施方案中，IFN-a-HSA融合蛋白的干扰素α部分可通过附着化学模块而得以修饰。例如，干扰素α部分可通过聚こニ醇化得以修饰。因此，在另 外的实施方案中，IFN-a-HSA融合蛋白的干扰素α部分包含干扰素a _2a、2b、或共有干扰素的聚こニ醇化形式或由其组成，并且包含但不限于商品化聚こニ醇化干扰素α，诸如例如 PEG-INTR0N (Schering Corp. , Kenilworth, N. J. )、PEGASYS (Hoffman-La Roche,Nutley, N. J. )、PEG-0MNIFER0N (Viragen, Inc.，Plantation, FL)或其片段。然而，在用于本文吋，“ IFN-a-HSA”融合物指与本领域已知的任何干扰素α蛋白质或其片段融合的HSA。根据先前是否接受过用于治疗HCV感染的干扰素治疗方案，可将感染HCV的患者分为两类。“首次接受治疗的患者”指那些从未接受过干扰素治疗方案治疗的患者。“曾经接受治疗的患者”指那些曾经接受过或者正在接受干扰素治疗方案治疗的患者。“不应答者”指这样的曾经接受治疗的患者，他们先前接受过干扰素治疗方案治疗但未达到治疗的主要目的诸如早期病毒载量减少(EVR)或治疗终末应答(ETR)。然而，在用于本文吋，“HCV患者”指感染了 HCV的患者并且不论他是首次接受治疗的、曾经接受治疗的、或是不应答者。另外，丙型肝炎病毒可分为四种基因型，基因型1、2、3、或4。通常，感染HCV患者的丙型肝炎病毒包含単一基因型。然而，肝炎病毒可包含两种或多种基因型的组合。另外，丙型肝炎病毒的基因型还可以是已知HCV基因型之ー的变体。在另ー个实施方案中，HCV患者的丙型肝炎病毒是基因型I或其变体。然而，在用于本文吋，“HCV”指任何基因型的丙型肝炎病毒，或其组合或变体。对携带HCV的患者的标准治疗牵涉用干扰素α联合抗病毒剂诸如利巴韦林(病毒唑)进行治疗。通常，姆日一次，姆周两次，或姆周一次施用干扰素α而姆日一次施用利巴韦林。然而，最近的研究也使用了干扰素α并联合本领域已知的用于治疗HCV的其它抗病 毒剂。因此，在另ー个实施方案中，可将IFN-α -HSA融合物单独或联合抗病毒剂诸如例如利巴韦林施用于HCV患者。如上所述，CID 3165蛋白质的药动学支持每2-4周或更长时间一次的服药方案。因此，在另ー个实施方案中，通过每2-4周一次単独或联合有效量的抗病毒剂施用IFN- a -HSA融合物来治疗HCV患者。在优选的实施方案中，通过每2_4周一次联合有效量的抗病毒剂施用IFN- a -HSA融合物来治疗HCV患者。在另ー个优选的实施方案中，每4周一次对HCV患者施用IFN- a -HSA融合物。在另ー个优选的实施方案中，每4周超过一次对HCV患者施用IFN- a -HSA融合物。在另外的实施方案中，每4周或更长时间一次对HCV患者施用IFN-a -HSA融合物，其中治疗还包括施用有效量的抗病毒剂。在另ー个实施方案中，IFN-a -HSA融合物可作为低剂量的单ー疗法用于HCV的维持疗法。在另ー个实施方案中，IFN- a -HSA融合物可联合利巴,林和ー种或多种其它抗病毒剂用于HCV的治疗。或者，在另ー个实施方案中，IFN-a-HSA融合物可联合除利巴韦林以外的ー种或多种抗病毒剂用于HCV的治疗。在另ー个实施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治疗其它病毒感染。例如，在一个实施方案中，IFN-a-HSA融合物可用于治疗こ型肝炎(HBV)。在另ー个实施方案中，IFN-a-HSA融合物可用于治疗人乳头状瘤病毒(HPV)。在另ー个实施方案中，IFN-a-HSA融合物可用于治疗癌症，包括但不限于毛细胞性白血病、恶性黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、AIDS相关卡波西肉瘤、多发性骨髄瘤、或肾细胞癌。在另ー个实施方案中，将GLP-I-HAS融合物用于调节糖尿病患者的血糖水平。在另ー个实施方案中，将野生型或突变型GLP-I的串联融合物用于调节糖尿病患者的血糖水平。例如，在给约8周龄的糖尿病db/db小鼠皮下注射GLP-I-HAS蛋白后，通过ロ服葡萄糖耐量测试(通过ロ服管饲法每kg体重给予Ig葡萄糖)评估了単体GLP-1 (7-36A8G)-HAS和串联GLP-1 (7-36A8G)-HSA (CID 3610)融合物调节血糖水平的能力。此葡萄糖耐量试验包括皮下注射GLP-I-HSA融合物，随后通过ロ服管饲法每kg体重给予Ig葡萄糖。给禁食的糖尿病db/db小鼠施用等摩尔剂量(100和171nmol/kg)的单体或串联GLP-I-HSA融合蛋白，并在单次施药后6或24小时进行ロ服葡萄糖耐量测试。相当令人惊讶和出乎意料的是，与单体 GLP-1 (7-36A8G)-HSA 融合物相比，串联 GLP-1 (7-36A8G) -HAS 融合物(CID 3610)在注射后6小时显著降低血糖。另外，在注射后24小时对糖尿病db/db小鼠进行评估时，単体GLP-1 (7-36A8G)-HSA和串联GLP-1 (7-36A8G) -HAS (CID 3610)融合物之间的差异甚至更加显著。如图11所示，串联GLP-1 (7-36A8G)-HAS融合物(CID 3610) ( )拥有出乎意料有力的血糖正常化活性，然而单个GLP-1 (7-36A8G) -HAS ( Δ )融合物的禁食血糖水平与本质上显然是糖尿病且单独施用HSA( ·)的动物相似。在用于本文吋，“治疗活性”或“活性”可指其在人体中的作用符合期望治疗成果的活性，或指在非人哺乳动物或其它物种或生物体中的期望效果。治疗活性可在体内或在体外測量。例如，可在细胞培养物中测定期望效果。这些体外或细胞培养物测定法对于所述治疗性蛋白质在本领域通常是可获得的。測定法的实例包括但不限于本文实施例部分或表I “例示性活性測定法” 一列(第3列)中所描述的。与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质，诸如细胞表面和分泌性蛋白质，通常通过附着一个或多个寡糖基团进行修饰。这种修饰，称为糖基 化，可显著影响蛋白质的物理特性，而且对于蛋白质的稳定性、分泌、和定位可能是重要的。糖基化发生于沿着多肽主链的特定位置。通常有两种主要的糖基化类型附着于丝氨酸或苏氨酸残基的特征为O-连接寡糖的糖基化；附着于Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列中的天冬酰胺残基的特征为N-连接寡糖的糖基化，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。N-こ酰神经氨酸(也称为唾液酸)通常是N-连接和O-连接寡糖的末端残基。诸如蛋白质结构和细胞类型等变数影响不同糖基化位点处链内碳水化合物単位的数量和本质。糖基化异构体也常常存在于指定细胞类型中的相同位点处。与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质及其类似物和变体可进行修饰，因此由于对其核酸序列的操作，由表达它们的宿主细胞改变ー个或多个位点处的糖基化，或者由于它们的其它表达条件。例如，可通过消除或引入糖基化位点来产生糖基化异构体，例如通过氨基酸残基的替代或删除，诸如用谷氨酰胺替代天冬酰胺，或者可通过在不会将其糖基化的宿主细胞中表达蛋白质来产生未糖基化的重组蛋白，例如在大肠杆菌或糖基化缺陷的酵母中。这些方法在下文中有更详细的描述且在本领域是已知的。治疗性蛋白质，特别是表I中所公开的那些，和它们的核酸和氨基酸序列在本领域是众所周知的，并且可从公共数据库诸如化学文摘社数据库(如CAS注册号)、GenBank、和提供订阅的数据库诸如GenSeq (如Derwent)获得。可用于衍生本发明多核苷酸的例示性治疗性蛋白质核苷酸序列显示于表2的第7列“ SEQ ID NO :X”。SEQ ID NO :X所示序列可以是编码指定治疗性蛋白质(如全长的或成熟的)的野生型多核苷酸序列，或在一些情况中该序列可以是所述野生型多核苷酸序列的变体(如编码野生型治疗性蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸的DNA序列已经优化，例如用于在特定物种中进行表达；或编码野生型治疗性蛋白质的变体的多核苷酸(即定点突变体；等位基因变体))。利用SEQ ID Ν0:Χ所示序列衍生同一行中所描述的构建物完全在熟练技术人员的能力之内。例如，如果SEQ IDNO :X对应于全长蛋白质，但是该蛋白质只有一部分用于生成特定CID，那么根据分子生物学技术诸如PCR来扩增特定片段并将其克隆到合适载体中在本领域技术之内。与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的其它治疗性蛋白质包括但不限于表I “治疗性蛋白质X”一列(第I列)中所公开的ー种或多种治疗性蛋白质或多肽或其片段或变体。表I提供了与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质或由本发明的多核苷酸编码的清蛋白融合蛋白的不完全列表。第一列“治疗性蛋白质X”公开了治疗性蛋白质分子，随后可能的圆括号中包括包含该治疗性蛋白质分子或其片段或变体或由其组成的蛋白质的学名和品牌。在用于本文吋，“治疗性蛋白质X”可指个别治疗性蛋白质分子，或指与此列中所公开的指定治疗性蛋白质分子相关的整组治疗性蛋白质。“生物学活性”列(第2列)描述了与治疗性蛋白质分子相关的生物学活性。第3列“例示性活性測定法”提供了描述可用于测试治疗性蛋白质X或包含治疗性蛋白质X (或其片段)部分的清蛋白融合蛋白的治疗性和/或生物学活性的測定法的參考文献。将“生物学活性”列中所引用的每篇參考文献完整引入本文作为參考，特别是在參考文献中所描述的用于测定表I “生物学活性”列所示相应生物学活性的各自活性測定法的描述方面(例如见其中的 方法部分)。第四列“优选的适应症Y”描述了可通过治疗性蛋白质X或包含治疗性蛋白质Χ(或其片段)部分的清蛋白融合蛋白来治疗、预防、诊断、和/或改善的疾病、紊乱、和/或状況。“构建物ID”列(第5列)提供了与表2中所公开的编码包含所提到的治疗性蛋白质X (或其片段)部分或由其组成的清蛋白融合蛋白的例示性清蛋白融合构建物的链接。表I
权利要求
1.包含选自下组的成员的清蛋白融合蛋白 (a)治疗性蛋白质X和包含SEQID NO 1的氨基酸序列的清蛋白； (b)治疗性蛋白质X和SEQID NO 1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性； (c)治疗性蛋白质X和SEQID NO 1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性，且其中所述清蛋白活性是与未融合状态的治疗性蛋白质X的保存期相比延长治疗性蛋白质X的保存期的能力； (d)治疗性蛋白质X和SEQID NO 1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性，且其中所述片段或变体包含SEQ ID NO 1的氨基酸1-387的氨基酸序列； (e)治疗性蛋白质X的片段或变体和包含SEQID NO :I的氨基酸序列的清蛋白，其中所述片段或变体具有治疗性蛋白质X的生物学活性； (f)(a)-(e)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质X或其片段或变体融合在清蛋白的N-末端，或清蛋白片段或变体的N-末端; (g)(a)-(e)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质X或其片段或变体融合在清蛋白的C-末端，或清蛋白片段或变体的C-末端; (h)(a)-(e)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质X或其片段或变体融合在清蛋白的N-末端和C-末端，或清蛋白片段或变体的N-末端和C-末端； (i)(a)-(e)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，它包含第一治疗性蛋白质X或其片段或变体和第二治疗性蛋白质X或其片段或变体，其中所述第一治疗性蛋白质X或其片段或变体不同于所述第二治疗性蛋白质X或其片段或变体； (j) (a)-(i)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质X或其片段或变体通过接头与所述清蛋白或清蛋白片段或变体分开；和 (k) (a)-(j)的治疗性蛋白质X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白具有如下通式R1-L-R2 ；R2-L-R1 ;或R1-L-R2-L-R1，且其中Rl是治疗性蛋白质X或其片段或变体，L是肽接头，而R2是包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列的清蛋白或清蛋白的片段或变体。
2.权利要求I的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白的保存期或血浆稳定性大于未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性。
3.权利要求I的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体外生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体外生物学活性。
4.权利要求I的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体内生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体内生物学活性。
5.包含插入到清蛋白或其片段或变体中的治疗性蛋白质X或其片段或变体的清蛋白融合蛋白，包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列或其片段或变体。
6.包含插入到清蛋白或其片段或变体中的治疗性蛋白质X或其片段或变体的清蛋白融合蛋白，包含选自下组的ー个或多个氨基酸序列(a)SEQ ID NO 1的氨基酸 54-61 ；(b)SEQID NO 1 的氨基酸 76-89 ；(c)SEQID NO 1 的氨基酸 92-100 ；(d)SEQID NO 1 的氨基酸 170-176 ；(e)SEQID NO 1 的氨基酸 247-252 ；(f)SEQ ID NO 1 的氨基酸 266-277 ；(g)SEQID NO 1 的氨基酸 280-288 ；(h)SEQID NO 1 的氨基酸 362-368 ；(i)SEQID NO 1 的氨基酸 439-447 ；(j) SEQ ID NO 1 的氨基酸 462-475 ；(k)SEQ ID NO 1 的氨基酸 478-486 ;和(1)SEQ ID NO 1 的氨基酸 560-566。
7.权利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比足以延长治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的部分清蛋白。
8.权利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比足以延长治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的部分清蛋白。
9.权利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体外生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体外生物学活性的部分清蛋白。
10.权利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体外生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体外生物学活性的部分清蛋白。
11.权利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体内生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体内生物学活性的部分清蛋白。
12.权利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体内生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质X或其片段或变体的体内生物学活性的部分清蛋白。
13.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是非糖基化的。
14.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是在酵母中表达的。
15.权利要求14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化缺陷的。
16.权利要求14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化和蛋白酶缺陷的。
17.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是由哺乳动物细胞表达的。
18.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白是由培养中的哺乳动物细胞表达的。
19.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白还包含分泌前导序列。
20.包含权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白和制药学可接受载体的组合物。
21.包含权利要求20的组合物的试剂盒。
22.治疗患者的疾病或紊乱的方法，包括施用权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述疾病或紊乱包含适应症Y。
24.治疗患有受治疗性蛋白质X或其片段或变体调节的疾病或紊乱的患者的方法，包括施用有效量的权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。
25.权利要求24的方法，其中所述疾病或紊乱是适应症Y。
26.延长治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的方法，包括将治疗性蛋白质X或其片段或变体与清蛋白或其片段或变体融合的步骤，与未融合状态的治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比，所述清蛋白或其片段或变体足以延长治疗性蛋白质X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性。
27.核酸分子，包含编码权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。
28.包含权利要求27的核酸分子的载体。
29.包含权利要求28的核酸分子的宿主细胞。
全文摘要
本发明涵盖清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖编码本发明清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有这些核酸的载体、经过这些核酸载体转化的宿主细胞、及使用这些核酸、载体和/或宿主细胞和生成本发明清蛋白融合蛋白的方法。另外，本发明还涵盖包含清蛋白融合蛋白的药物组合物以及使用本发明的清蛋白融合蛋白来治疗、预防或改善疾病、紊乱或状况的方法。
文档编号C07K14/765GK102816241SQ201210139189
公开日2012年12月12日 申请日期2005年2月9日 优先权日2004年2月9日
发明者克雷格.A.罗森, 威廉.A.哈塞尔廷, 保罗.A.穆尔, 贾森.B.博克, 亚当.贝尔, 石阳古, 戴维.拉弗勒 申请人:人类基因科学公司