专利名称：一种高速逆流色谱法从党参中分离党参生物碱单体的方法
技术领域：
本发明涉及杂环化合物，具体涉及从中药材党参中分离党参生物碱单体的方法。
背景技术：
党参为桔梗科(Companulaceae)植物党参植物Codonopsis pilosula(Franch)Nannf.、素花党参Codonopsis pilosula Nannf. Var. modesta(Nannf. )L. T. Shen或川党参Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根。党参是一味传统补气中药,味甘,性平,具有健脾补肺，益气生津之功效，主治脾胃虚弱，食少便溏，四肢乏力，肺虚咳喘，气短自汗，气血两亏诸证。在我国盛产于甘肃、山西、陕西、四川、贵 州、云南等地。近年来，文献报道党参中吡咯烷类生物碱具有改善心肌缺血、同时增强PGI2合成和抑制血小板活性的功能，临床上治疗冠心病心绞痛具有较好疗效。目前文献报道的，用于从党参中分离党参生物碱单体的方法为柱层析法，如大孔树脂柱层析法、硅胶柱层析法、氧化铝柱层析法和硅烷键合硅胶反相材料柱层析法。柱层析法的不足之处是分离周期长，回收率低，分离效果很不理想。关于党参生物碱单体的提取方法也有文献报道，如蔡东胡等发表的“党参的酌■苷和卩比咯烧生物喊” (Tung-Hu Tsai, Lie-Chwen Lin, Chem. Pharm. Bull. , 56 492-496 (2008))，公开号为CN1789244A的专利申请。但是，上述文献所公开分离方法均为柱层析法，其步骤冗长、繁琐，耗时长、纯度与得率均较本发明制得的低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高速逆流色谱法从党参中分离党参生物碱单体的方法，该方法不仅效率高，而且所得到的党参生物碱单体的纯度高。本发明解决上述问题的技术方案如下一种高速逆流色谱法从党参中分离党参生物碱单体的方法，该方法包括以下步骤I)取党参药材，切片，用乙醇溶液温浸提取，过滤，回收溶剂后减压浓缩得到浸膏，然后将所得浸膏用质量百分浓度1-5%的酸水溶液溶解，调节pH值至9-11后用有机溶剂连续萃取3飞次，合并萃取液，蒸干，得到党参总生物碱；2)将高速逆流色谱两相溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀、静置分层，平衡后，将上、下相分离；其中所述的高速逆流色谱两相溶剂体系是体积比为1-4 1-3 O. 5-2 1-8的脂肪醇脂肪酸酯脂肪醇水或体积比为1-4 1-4 1-2的氯仿脂肪醇水；3)将步骤I)所得到的得到党参总生物碱用适量的步骤2)所述的下相溶解，制得进样样品；4)取上相作固定相，以2(T25ml/min流速填充满整个逆流色谱仪中的色谱柱，并设定恒温循环器温度为25°C ;以70(T900rpm转速开启逆流色谱仪主机后取下相作流动相，并以2 3ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后由进样阀进样；根据检测器图谱收集目的组分，分别减压蒸干，乙醇重结晶，得到党参碱、党参次碱和管花党参碱。本发明所述的方法，其中，所述的步骤4)还包括高效液相色谱检测步骤，该步骤是将所收集目的组分先进行高效液相色谱检测，并合并特征峰位置相同、形状相似的目的组分，再分别减压蒸干，乙醇重结晶，以减少后续鉴别化合物的工作量；其中所述的高效液相色谱检测条件为色谱柱为规格是5 μ m，4. 6mmX 250mm的Kromasil RP-C18,柱温为25°C ;流动相是体积比为5 : 95 : O. 01的乙腈水三乙胺；流速为I. Oml/min ;紫外检测器的检测波长为232nm。 本发明所述的方法，其中所述的乙醇溶液是体积浓度为6(Tl00%的乙醇。本发明所述的方法，其中所述溶剂体系在25°C下的黏度低，显著提高了固定相保留值，进而使溶质峰分离度良好(参见图I 3)，所得到党参碱、党参次碱和管花党参碱的纯度高达95%以上。
图I是下述实施例I所得到的高速逆流色谱图。图2是下述实施例2所得到的高速逆流色谱图。图3是下述实施例3所得到的高速逆流色谱图。图4是下述实施例I所得到的组分a的高效液相色谱图。图5是下述实施例I所得到的组分b的高效液相色谱图。图6是下述实施例I所得到的组分c的高效液相色谱图。
具体实施例方式实施例I一、党参生物碱单体的分离I、取党参药材5Kg，切片，用体积浓度为60%乙醇溶液温浸提取，过滤，回收溶剂后减压浓缩得到浸膏，然后将所得浸膏用质量百分浓度1%的盐酸水溶液溶解，加碳酸氢钠调节PH值至9-11后用正丁醇连续萃取3次，合并正丁醇萃取液，蒸干，得到党参总生物碱82g。2、将体积比为4 I 0.5 6的正丁醇乙酸乙酯甲醇水的高速逆流色谱两相溶剂体系2300mL置于分液漏斗中，摇匀、静置过夜，将分层的上相与下相分离，并分别超声半小时。3、取步骤I所得到的得到党参总生物碱300mg用20mL步骤2所述的的下相溶解，制得进样样品。4、取上相作固定相，以25ml/min的流速泵满TBE-300B型的高速逆流色谱仪中的色谱柱，并设定恒温循环器温度为25°C ;以900rpm转速开启逆流色谱仪主机后取下相作流动相，并以2ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后由进样阀进样，40min后每隔4min收集I管分离物，共收集60管。上步骤4中，在进样前即开启紫外检测器与N2000色谱工作站软件，进样完毕的同时迅速点击软件开始采集紫外吸收数据，得到如图I所示的高速逆流色谱图。上步骤4中，当流动相平衡时由下述公式算得固定相的保留率P为38. 6% :
p = (V总-V出)/V,6 X 100%，式中，V总为管路总体积(mL) ;Va为平衡过程中流动相退出的固定相体积(mL)。二、分离物的检测将收集到的60管分离物分别以下述进行高效液相色谱检测色谱柱为规格是5 μ m, 4. 6mmX 250mm的Kromasil RP-C18高效液相色谱柱,设定柱温为25 ;流动相是体积比为5 : 95 : O. 01的乙腈水三乙胺；流速为I. Oml/min ;紫外检测器的检测波长为232nm。将检测得到的60管分离物的高效液色谱图进行比对，其中，有3管分离物的特征峰位于相对保留时间(Rt) 5. 49min处，而且形状相似，将其合并得到目的组分a ;有5管分离物的特征峰位于相对保留时间(Rt) 7. 46min处，而且形状相似，将其合并得到目的组分 b ;有8管分离物的特征峰位于相对保留时间(Rt) 12. 53min处，而且形状相似，将其合并得到目的组分C。根据目的组分a、b和c所包含的分离物的收集时间顺序，再结合图I可见，目的组分a、b和c即为图I中a、b和c三段曲线所对应的组分。三、化合物的纯度检测将所得到的目的组分a、b和c分别减压蒸干，乙醇重结晶，得到69mg、45mg和120mg三种白色粉末。将所得到的三种白色粉末，再以上述相同的条件进行高效液相检测，便分别得到如图4 6所示的高效液相色谱图。由图4 6可见，目的组分a、b和c的纯度均可达95%以上。四、化合物的鉴别将上述步骤三中所述的三种白色粉末通过熔点仪测定熔点、紫外(Uultaviolet, UV)全波谱扫描、红外(Infrrared, IR)扫描和核磁共振(Nuclear MagneticResonance, NMR)及质谱(Mass Spectrum, MS)验证，其中，目的组分a所对应的白色粉末的验证结果如下改良碘化铋钾反应呈阳性，显示含有N原子，IRvmaxCm^1:3411处有N-H强吸收峰，并且在1615(^1左右有C-N伸缩振动特征峰出现。ESI-MS m/z:M+267,结合13C-NMR和DEPT谱该化合物含3个甲基、8个次甲基，推测分子式为 C14H21NO3O 1H-NmrGoomHz, D2O) δ 1. 12 (3H, d, H-7, J = 6. 0Hz)，2. 28 (3H, s, H_6)，2. 56 (1H, m)，3. 48 (1H, br d, J = 6. 0Hz)，3. 60 (1H, br t, J = 3. 0，7. 2Hz)，3. 84 (1H, br t, J=3. 0，7. 2Hz)。13C-NMR (100MHz, D2O) δ 74. 82 (CH, C_2)，86. 96 (CH, C_3)，82. 63 (CH, C_4)，66. 42 (CH, C-5), 34. 84 (CH3, C_6), 13. 92 (CH3, C_7), 135. 418 (C, C_l，)，121. 12 (CH, C_6，)，112
26(CHX2, C-2，、C-5，)，55. 12 (OCH3, C_7，)，55. 74 (OCH3, C_3，)，149. 36 (C, C_3，)，150. 42 (C，C-4，)；由上述结果可确定，目的组分a所对应的白色粉末为党参碱(codonopsine)，其化
学结构式为
权利要求
1.一种高速逆流色谱法从党参中分离党参生物碱单体的方法，该方法包括以下步骤 1)取党参药材，切片，用乙醇溶液温浸提取，过滤，回收溶剂后减压浓缩得到浸膏，然后将所得浸膏用质量百分浓度1-5%的酸水溶液溶解，调节PH值至9-11后用有机溶剂连续萃取3飞次，合并萃取液，蒸干，得到党参总生物碱； 2)将高速逆流色谱两相溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀、静置分层，平衡后，将上、下相分离；其中所述的高速逆流色谱两相溶剂体系是体积比为1-4 1-3 0.5-2 1-8的脂肪醇脂肪酸酯脂肪醇水或体积比为1-4 1-4 1-2的氯仿脂肪醇水； 3)将步骤I)所得到的得到党参总生物碱用适量的步骤2)所述的下相溶解，制得进样样品； 4)取上相作固定相，以2(T25ml/min流速填充满整个逆流色谱仪中的色谱柱，并设定恒温循环器温度为25°C ;以70(T900rpm转速开启逆流色谱仪主机后取下相作流动相，并以2 3ml/min流速泵入色谱柱内，待流动相平衡后由进样阀进样；根据检测器图谱收集目的组分，分别减压蒸干，乙醇重结晶，得到党参碱、党参次碱和管花党参碱。
2.根据权利要求I所述的一种高速逆流色谱法从党参中分离党参生物碱单体的方法，其特征在于，所述的步骤4)还包括高效液相色谱检测步骤，该步骤是将所收集的目的组分先进行高效液相色谱检测，并合并特征峰位置相同、形状相似的目的组分，再分别减压蒸干，乙醇重结晶；其中所述的高效液相色谱检测条件为 色谱柱为规格是5 ii m, 4. 6mmX 250mm的Kromasil RP-C18,柱温为25°C ;流动相是体积比为5 : 95 : 0. 01的乙腈水三乙胺；流速为I. Oml/min ;紫外检测器的检测波长为232nm。
3.根据权利要求I或2所述的一种高速逆流色谱法从党参中分离党参生物碱单体的方法，其特征在于，所述的乙醇溶液是体积浓度为6(T100%的乙醇。
全文摘要
本发明涉及一种高速逆流色谱法从党参中分离党参生物碱单体的方法，该方法是选用乙醇提取党参总生物碱，再以体积比为1-4︰1-3︰0.5-2︰1-8的脂肪醇脂肪酸酯︰脂肪醇︰水或体积比为1-4︰1-4︰1-2的氯仿︰脂肪醇︰水作为两相溶剂体系在高速逆流色谱仪上进行液-液色谱分离，得到党参碱、党参次碱和管花党参碱。本发明所述的方法具有溶质峰分离度良好和所得到的党参生物碱单体纯度高的优点。
文档编号C07D207/12GK102659656SQ20121016072
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月22日 优先权日2012年5月22日
发明者林朝展, 祝晨蔯 申请人:广州中医药大学