专利名称：一种竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱、制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物分离技术领域，具体地说，是涉及竹叶提取液中黄酮类物质的高选择性分离、纯化和富集的竹叶黄酮 分子印迹固相萃取柱的制备方法。
背景技术：
在药物分离中，样品的前处理过程至关重要。柱色谱分离是一种较为常用的样品前处理技术。固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE)由液固萃取和柱液相色谱技术结合发展而来，与液-液萃取法(Liquid-Liquid Extraction, HE)相比，SPE具有回收率高、分离效果好，操作简单、省时、省力等优点而被广泛应用于样品的前处理。目前SPE柱填料种类正相、反相及离子交换柱和吸附树脂柱。正相SPE柱填料主要为硅胶、氧化铝和硅镁吸附剂等。反相SPE柱填料主要为C18键合硅胶、氰基键合硅胶柱(CN)等。这些柱填料通过吸附目标物，使产生干扰的共提物被淋洗移除，达到净化、富集的目的；或将杂质留在柱上，待测的目标物通过SPE柱，样品被净化，但不能富集待测组分，也不能分离保留性质比待测组分更弱的杂质，造成净化不完全。分子印迹固相萃取(Molecularlyimprinted solid-phase extraction, MIPSE)是利用MIP选择吸附机理制备SPE填料，不仅可以提高SPE净化效果，实现低浓度的药物的分离富集，同时可以实现SPE柱的多次重复使用，从而降低成本。竹叶黄酮是从竹叶中提取出的一类天然产物，具有抗氧化、抗衰老等作用，是新兴的功能性食品添加剂和天然药物。竹叶黄酮以炭苷黄酮为主，荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异特荆苷是竹叶黄酮的主要成分。目前市场上的竹叶黄酮产品主要为粗制品，上述4种黄酮的总含量一般在10%以内，难以满足市场对高含量竹叶黄酮产品的需求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有实验室分离、富集竹叶黄酮方法的缺点和不足，提供一种竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱、制备及应用方法，使其能够快速简单的分离纯化竹叶提取液中的竹叶黄酮，可直接应用于竹叶黄酮的特异性选择分离、高效富集。本发明是通过以下技术方案实现的竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤⑴制备质量浓度为3%_3. 5%的分散剂水溶液；将功能单体4-乙烯基吡啶和模板分子木犀草素溶解在分散剂水溶液中；将交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、引发剂偶氮二异丁腈分别溶解于有机溶剂中，然后和上述分散剂水溶液混合；并进行超声脱气；在70-75°C下搅拌，在通氮气保护下进行聚合反应10_24h，生成分子印迹聚合物颗粒；所述的模板分子木犀草素、4-乙烯基吡啶、二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩尔比为I (5-6) 80，二甲基丙烯酸乙二醇酯、有机溶剂、分散剂溶液的体积比为I : 2-3 20-30。偶氮二异丁腈是本领域常规技术，只要加入少量引发即可。⑵反应结束后，离心过滤，分离出聚合物颗粒；再将分离出的聚合物颗粒用水反复洗涤，再用甲醇、丙酮洗涤多次；最后通过索氏提取进一步除去聚合物颗粒中的模板分子木犀草素，直至检测不出模板分子，然后真空干燥；⑶将⑵所制得的聚合物颗粒填充于聚丙烯或玻璃色谱柱管内，管的两端分别装上筛板，即制得固相萃取柱。所述的分散剂水溶液为羧乙基纤维素水溶液；所述的筛板为聚乙烯筛板，其孔径为20i!m。所述的超声脱气时间为10-20min ;所述的搅拌转速为600_700rpm。所述的水为超纯水。所述聚合物颗粒真空干燥，温度为60°C，干燥时间为6 8h。 本发明制备的竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱，应用于竹叶提取液中竹叶黄酮的分离、纯化和富集，具体步骤如下⑴装填竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱后，先用乙腈活化，再用质量浓度5-15%甲醇水溶液淋洗，⑵加入样品提取液或样品溶液；⑶用15-15%甲醇水溶液淋洗；⑷用甲醇洗脱2次，收集洗脱液，用0. 45 y m滤膜过滤后，进行收集。上述优选甲醇水溶液浓度10% ;本发明制备的竹叶黄酮分子印迹聚合物颗粒是一种具有固定空穴大小、形状和确定排列功能基团的高分子交联聚合物，对竹叶黄酮的立体结构具有动态记忆功能。本发明可应用于竹叶提取液中竹叶黄酮的分离、富集和纯化，较普通的液-液萃取法、C18固相萃取法更为简单、快速、更为高效。
具体实施例方式以下结合实施例进一步阐明本发明内容，但本发明并不限制于如下实施例的范围。实例I.竹叶黄酮分子印迹聚合物颗粒固相萃取柱(模板分子与功能单体摩尔比为 I : 5)⑴配制浓度为3%_3. 5%的羧乙基纤维素溶液；将2. 5mmol功能单体4_乙烯基吡啶(4-vp)、0. 5mmol模板分子木犀草素和5mmol的乙酸锌溶解在甲醇中，超声作用30min ;将7. 5mL的交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、0. 2g引发剂(AIBN)和7. 5mL的二甲苯混合；超声作用20min ;将上述三种溶液混合超声脱气IOmin ;在70°C恒温650rpm搅拌10h。⑵将上述制备的分子印迹聚合物颗粒离心过滤，然后用超纯水洗涤5次，再用甲醇抽滤洗涤5次，最后通过索氏提取进一步除去模板分子。⑶将除去模板分子的聚合物，真空干燥(60°C )，得到竹叶黄酮分子印迹聚合物颗粒。⑷将所制得的聚合物颗粒填充于聚丙烯或玻璃色谱柱管内，管的两端分别装上筛板，即制得固相萃取柱。实例2.竹叶黄酮分子印迹聚合物颗粒固相萃取柱(模板分子与功能单体摩尔比为 I : 8)⑴配制浓度为3%-3. 5%的羧乙基纤维素溶液；将4. Ommol功能单体4_乙烯基吡啶(4-vp)、0. 5mmol模板分子木犀草素和5mmol的乙酸锌溶解在甲醇中，超声作用30min ;将7. 5mL的交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、0. 2g引发剂(AIBN)和7. 5mL的二甲苯混合；超声作用20min ;将上述三种溶液混合超声脱气IOmin ;在70°C恒温650rpm搅拌10h。⑵将上述制备的分子印迹聚合物颗粒离心过滤，然后用超纯水洗涤5次，再用甲醇抽滤洗涤5次，最后通过索氏提取进一步除去模板分子。⑶将除去模板分子的聚合物，真空干燥(60°C )，得到竹叶黄酮分子印迹聚合物颗粒。⑷将所制得的聚合物颗粒填充于聚丙烯或玻璃色谱柱管内，管的两端分别装上筛板，即制得固相萃取柱。实例3.竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱的制备与性能评价
⑴用3mL聚丙烯固相萃取小柱空管作为固相萃取小柱,在固相萃取柱的底部放置一层20 ii m的聚乙烯筛板，准确称取200mg实施例I或2的分子印迹聚合物，干法装填入小柱中，轻轻敲打压实上面再加入一层筛板，即得竹叶黄酮分子印迹固相萃取小柱。⑵用2mL乙腈润洗柱子，并保持2min，除去残留的液体，保持湿润，上样前勿让淋洗剂流干；⑶上样。取IOmL竹叶提取液，加入分子印迹固相萃取柱中。提取液中含有木犀草素、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、槲皮素和异牡荆苷标准品。⑷淋洗，5mL10%甲醇淋洗,流速<2mL/min。(5)洗脱，加入IOmL甲醇，抽真空洗脱，收集洗脱液,用0. 45 U m滤膜过滤后，HPLC分析。本发明效果为，该固相萃取柱吸附竹叶黄酮效果较好，在添加浓度为10mg/L时，6种竹叶黄酮的的回收率在80%-120%之间，RSD在3%-5%之间。实例4.分子印迹固相萃取小柱应用于竹叶黄酮的分离、纯化⑴称取IOg市售竹叶黄酮粉样品，用10%乙醇溶解、稀释100倍，过滤或离心，得到竹叶黄酮样品溶液。⑵称取500mg制备的竹叶黄酮分子印迹聚合物，按照实例2方法装填固相萃取柱。⑶在装填的固相萃取柱中加入2mL乙腈活化，再用2mL10%甲醇淋洗。⑷移取50mL步骤中⑴制备的竹叶黄酮样品溶液，加入已活化的固相萃取柱中；待样品溶液完全淋下后，用5mL10%甲醇淋洗，弃去淋洗液；再用5mL甲醇洗脱2次。(5)将收集的洗脱液于45°C下减压浓缩，得到分离的竹叶黄酮样品，经HPLC检测，所得竹叶黄酮样品中总黄酮含量为86. 20%。
权利要求
1.一种竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤 ⑴制备质量浓度为3%-3. 5%的分散剂水溶液；将功能单体4-乙烯基吡啶和模板分子木犀草素溶解在分散剂水溶液中；将交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、引发剂偶氮二异丁腈分别溶解于有机溶剂中，然后和上述分散剂水溶液混合；并进行超声脱气；在70-75°C下搅拌，在通氮气保护下进行聚合反应10_24h，生成分子印迹聚合物颗粒； 所述的模板分子木犀草素、4-乙烯基吡啶、二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩尔比为I :(5-6) 80，二甲基丙烯酸乙二醇酯、有机溶剂、分散剂溶液的体积比为I : (2-3): (20 —30)； ⑵反应结束后，离心过滤，分离出聚合物颗粒；再将分离出的聚合物颗粒用水反复洗涤，再用甲醇、丙酮洗涤多次；最后通过索氏提取进一步除去聚合物颗粒中的模板分子木犀草素，直至检测不出模板分子，然后真空干燥； (3)将(2)所制得的聚合物颗粒填充于聚丙烯或玻璃色谱柱管内，管的两端分别装上筛板，即制得固相萃取柱。
2.按照权利要求I的方法，其特征在于，所述的分散剂水溶液为羧乙基纤维素水溶液。
3.按照权利要求I的方法，其特征在于，所述的筛板为聚乙烯筛板，其孔径为20i!m。
4.按照权利要求I的方法，其特征在于，所述的超声脱气时间为10-20min;所述的搅拌转速为 600-700rpm。
5.按照权利要求I的方法，其特征在于，所用的水为超纯水。
6.按照权利要求I的方法，其特征在于，所述聚合物颗粒真空干燥，温度为60°C，干燥时间为6-8h。
7.按照权利要求1-6的任一方法制备的竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱。
8.权利要求7的竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱，应用于竹叶提取液中竹叶黄酮的分离、纯化和富集，具体步骤如下 ⑴装填竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱后，先用乙腈活化，再用质量浓度5-15%甲醇水溶液淋洗； ⑵加入样品提取液或样品溶液； ⑶用15-15%甲醇水溶液淋洗； ⑷用甲醇洗脱2次，收集洗脱液，用0. 45 y m滤膜过滤后，进行收集。
9.按照权利要求8的应用，其特征在于，甲醇水溶液浓度10%。
全文摘要
一种竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱、制备及其应用，属于药物分离技术领域。本发明将模板分子木犀草素、功能单体4-乙基吡啶和交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，按模板分子∶功能单体∶交联剂摩尔比为1∶(5-8)∶80，通过悬浮聚合而成竹叶黄酮分子印迹聚合物颗粒。将制备的竹叶黄酮分子印迹聚合物颗粒，填充于聚丙烯或玻璃固相萃取柱空管内，制得竹叶黄酮分子印迹固相萃取柱。本发明制得的竹叶黄酮固相萃取柱用于竹叶黄酮提取液的选择性富集和纯化，具有简单、快速、回收率高等特点，在天然黄酮类化合物分离领域应用前景广阔。
文档编号C07D311/30GK102671639SQ20121016449
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者姚曦, 孙嘏, 岳永德, 汤锋, 王光勇, 王进, 郭雪峰 申请人:国际竹藤中心