专利名称：应用高速逆流色谱法从大叶白麻中纯化三种黄酮苷的方法
技术领域：
本发明属于天然植物的分离制备，具体涉及应用高速逆流色谱法从大叶白麻中纯化三种黄酮苷的方法。
背景技术：
大叶白麻(Poacynum hendersonii),夾竹桃科(Apocynaceae)白麻属(PoacynumL)的ー种直立半灌木，常与罗布麻属的罗布红麻(Pocynum venetum)、白麻属的白麻(Pocynum pictum ) 一起被人们统称为罗布麻。罗布麻，作为茶饮和药用具有悠久历史，多部典籍对此进行了记载。据《中华本草》记载，其药用部位为叶，味甘，微苦，性凉，有清热平肝，利水消肿之功效，主治高血压，眩晕，头痛，心悸，失眠，水肿尿少等症。《中国药典》也对罗布麻有记载“清热利水，平肝安神，用于高血压、头晕、心悸、失眠等”。现代研究表明，罗布麻具有降压降脂、保肝、抗抑郁、镇静、延缓衰老及增强免疫力等功效。另外，目前罗布麻 叶已被开发成保健茶饮，有止渴、清热解毒、降低血压等强身健体之功效。目前三种“罗布麻”中应用较多的为罗布红麻，大叶白麻多作为其替代品应用。为了推进大叶白麻的开发利用，有关其化学成分的研究已经展开雷振环、台宝山、田瑞华等从大叶白麻中分离得到两个木质素成分(-)-丁香脂素和( + )-松脂素-4-0-β葡萄糖苷。堵年生、张云峰、马成等从大叶白麻中分离得到11种化学成分，井根据各种化合物的含量指定罗布麻甲素和丁香树脂醇-双-O-β -D-葡萄糖苷作为大叶白麻的标识化合物及相关产品的功能指标成分(中国专利，申请号200410079914. 8)。魏锦屏、李青山也对大叶白麻进行了研究，并从中分离得到15个化学成分。在上述研究中，研究者都采用常规柱色谱、重结晶等传统分离方法来分离大叶白麻中的単体化合物，不仅耗时耗力、污染严重，而且实验过程中存在不可逆吸附及实验者分离水平的高低不同的现象，大大制约了操作的重复性和単体化合物的制备。因此，单纯由研究者采用传统方法分离得到的単体化合物很难满足大叶白麻进ー步研究和产品开发的需求。高速逆流色谱是近年来发展起来的一种连续的无需固定相的高效、快速的液液分配色谱技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离溶剂选择灵活等优点，目前已广泛应用于生物、医药、环保、化工等领域内化学成分的分离制备和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用高速逆流色谱法从大叶白麻中纯化三种黄酮苷的方法，以能快速、高效制备槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯三种黄酮苷单体，优化所需要的溶剂体系和高速逆流色谱的相关參数，从而使得从大叶白麻中经ー步纯化即可得到纯度在95%以上三种单体得以实现。应用高速逆流色谱法从大叶白麻中纯化三种黄酮苷单体的方法，采取的技术方案是一种应用高速逆流色谱仪从大叶白麻叶中快速分离制备三种黄酮苷的方法是以大叶白麻叶为原料，经过下列步骤处理(1)粗提物浸膏的制备；(2)高速逆流色谱纯化，得到槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯三种黄酮苷，其纯度均高于96%。
(3)利用液相色谱技术对样品纯度进行检验
所述步骤(I)大叶白麻粗提物浸膏的制备a将已粉碎好的大叶白麻，加入5-30倍的40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分离残渣和提取液。b再于残渣内加入40%_90%的酒精5-20倍，重复回流提取2-3次，分离残渣和提取液。c合并上述回流所得提取液，减压回收合并液，得大叶白麻提取物浸膏。所述步骤(2)高速逆流色谱纯化a将溶剂系统正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照体积比5:3:5配制于分液漏斗中，充分摇动后静置分层，以上相为固定相，下相为流动相，取50-300 mg浸膏，溶于5mL上相和5mL下相的混合溶液中，作上样溶液使用；b使高速逆流色谱仪以5. 0-20 mL/min的素的充满上相溶液，然后转动主机，同时将流动相泵入，待达到平衡后，由进样阀进样，于254 nm波长下检测，根据检测器谱图收集目标成分。
所述步骤(3)利用液相色谱技术检验样品样品纯度，色谱条件为C18柱(250mm X 4. 6mm),填料直径i. d.，5 μ m,流动相A-甲醇，B-水；梯度洗脱程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,检测波长为 254 nm。所述的步骤(2)中高速逆流色谱主机的转速为500-900转/分钟，流动相流速
O.8-3. O mL/min ο步骤(2)中大叶白麻浸膏量为50-300 mg，即可以取50 — 300mg数值区间的任一
重量大叶白麻浸膏。上述方法在制取三种单体物质的过程中，时间控制方式分别是异槲皮苷的保留时间为25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留时间为150-220 min，异槲皮苷_6”-0_丙ニ酸酯的出峰时间为230-300 min。该方法以大叶白麻为原料，经过粗提物浸膏的制备、高速逆流色谱纯化、HPLC纯度检验等步骤处理，所得三种单体含量均高于95%，符合ー类植物新药和标准对照品要求。该方法具有处理简单，样品损失少，制备量大，制备单品纯度高及重复性好等优点，适用于从各种含有槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯的天然产物中获取其高纯度单体。
图I是实施例I中大叶白麻浸膏的高效液相色谱图。图2是实施例I按照为本发明步骤，利用高速逆流色谱分离得到槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯等三种黄酮苷的色谱图。图3为实施例I中分离得到的三种黄酮苷槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯的化学结构示意图。图4为实施例I分离纯化得到的异槲皮苷的色谱图。图5为实施例I分离纯化得到的槲皮素-3-0-槐糖苷的色谱图。图6为实施例I分离纯化得到的异槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的色谱图。
具体实施例方式以下是
具体实施例方式将大叶白麻叶于40-90%的こ醇溶液中回流提取，真空悬干得浸膏，然后采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液(5:3:5)构成的混合溶液作为溶剂体系，经制备型高速逆流色谱仪进行分离纯化，即得槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酷。优化得出的高速逆流色谱分离纯化大叶白麻中三种黄酮的具体步骤
I、大叶白麻粗提物浸膏的制备①将已粉碎好的大叶白麻，加入5-30倍的40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分离残渣和提取液。②再于残渣内加入40%_90%的酒精5-20倍，重复回流提取2-3次，分离残渣和提取液。③合并上述回流所得提取液，减压回收合并液，得大叶白麻提取物浸膏。
2、高速逆流色谱纯化①将溶剂系统正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照体积比5:3:5配制于分液漏斗中，充分摇动后静置分层，以上相为固定相，下相为流动相，在50-300 mg数值区间取任一重量的浸膏，溶于5ml上相和5ml下相的混合物中，得上样溶液；②以5-24 mL/min的速度将固定相快速注入高速逆流色谱仪，使之充满固定相溶液，然后以650-900 rpm/min转速，转动高速逆流色谱主机。同时将流动相以O. 8-3. O mL/min速度泵入，待达到平衡后，由进样阀进样，于254 nm波长下检测，根据检测器谱图收集目标成分。3.利用高效液相色谱对制的样品的纯度检验色谱条件为C18柱(250mmX4. 6 mm),填料直径i. d.，5 μ m,流动相A-甲醇；B-水；梯度洗脱程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,检测波长为 254 nm。上述方法在制取三种单体物质的过程中，时间控制是异槲皮苷的保留时间为25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留时间为150-220 min，异槲皮苷_6”-0_丙ニ酸酯的出峰时间为230-300 min。即25-50 min时间段内制得的是异槲皮苷，150-220 min时间段内制得的是懈皮素-3-0-槐糖苷,230-300 min时间段内制得的是懈皮素-3_0_槐糖苷。实施例I:
将已粉碎好的大叶白麻粉末100 g，加入IL 60%的こ醇溶液，回流提取100 min，分离残渣和提取液；将残渣内再加入60 %的酒精1L，重复回流提取2-3次，分离残渣和提取液；合并上述回流所得提取液，减压回收合并液，得大叶白麻提取物浸膏。高速逆流色谱纯化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所组成的溶剂体系分离纯化大叶白麻浸膏，上相为固定相，下相为流动相。根据色谱图收集相应的组分，回收溶液即得化合物。经1H-NMR、13C-NMR鉴定，所得化合物为槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面积归ー化计算，槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的纯度分别为96. 8%，98. 2%，99. 5%。实施例2:
将已粉碎好的大叶白麻粉末100 8，加入0.8 L 70%的こ醇溶液，回流提取100 min，分离残渣和提取液；将残渣内再加入70 %的酒精O. 8 L，重复回流提取2-3次，分离残渣和提取液；合并上述回流所得提取液，减压回收合并液，得大叶白麻提取物浸膏。高速逆流色谱纯化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所组成的溶剂体系分离纯化大叶白麻浸膏，上相为固定相，下相为流动相。根据色谱图收集相应的组分，回收溶液即得化合物。经1H-NMR、13C-NMR鉴定，所得化合物为槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面积归ー化计算，槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6” -O-丙ニ酸酯的纯度分别为97. 2%，98. 5%，98. 0%。实施例3:
将已粉碎好的大叶白麻粉末100 8，加入1.2 L 80%的こ醇溶液，回流提取100 min，分离残渣和提取液；将残渣内再加入80 %的酒精I. 2 L，重复回流提取2-3次，分离残渣和提取液；合并上述回流所得提取液，减压回收合并液，得大叶白麻提取物浸膏。高速逆流色谱纯化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所组成的溶剂体系分离纯化大叶白麻浸膏，上相为固定相，下相为流动相。根据色谱图收集相应的组分，回收溶液即得化合物。经1H-NMR、13C-NMR鉴定，所得化合物为槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面积归ー化计算，槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯的纯度分别为98. 1%，96. 5%, 99. 3%。实施例4:
将已粉碎好的大叶白麻粉末100 8，加入1.5 L 85%的こ醇溶液，回流提取100 min，分离残渣和提取液；将残渣内再加入85 %的酒精I. 5 L，重复回流提取2-3次，分离残渣和提取液；合并上述回流所得提取液，减压回收合并液，得大叶白麻提取物浸膏。高速逆流色谱纯化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所组成的溶剂体系分离纯化大叶白麻浸膏，上相为固定相，下相为流动相。根据色谱图收集相应的组分，回收溶液即得化合物。经1H-NMR、13C-NMR鉴定，所得化合物为槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面积归ー化计算，槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的纯度分别为96. 8 %，97. 9%，98. 6%。实施例5:
将已粉碎好的大叶白麻粉末100 8，加入0.6 L 50%的こ醇溶液，回流提取100 min，分离残渣和提取液；将残渣内再加入50 %的酒精O. 6 L，重复回流提取2-3次，分离残渣和提取液；合并上述回流所得提取液，减压回收合并液，得大叶白麻提取物浸膏。高速逆流色谱纯化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所组成的溶剂体系分离纯化大叶白麻浸膏，上相为固定相，下相为流动相。根据色谱图收集相应的组分，回收溶液即得化合物。经1H-NMR、13C-NMR鉴定，所得化合物为槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面积归ー化计算，槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯的纯度分别为95. 8 %，96. 9%, 97. 7%。
权利要求
1.一种应用高速逆流色谱法从大叶白麻中纯化三种黄酮苷的方法，其特征是以大叶白麻叶为原料，经过下列步骤处理(1)粗提物浸膏的制备；(2)高速逆流色谱纯化，得到槲皮素-3-0-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯三种黄酮苷，其纯度均高于96% ；(3)利用液相色谱技术对样品纯度进行检验； 所述步骤(I)大叶白麻粗提物浸膏的制备a将已粉碎好的大叶白麻，加入5-30倍的.40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分离残渣和提取液；b再于残渣内加入40%_90%的酒精5-20倍，重复回流提取2-3次，分离残渣和提取液；c合并上述回流所得提取液，减压回收合并液，得大叶白麻提取物浸膏； 所述步骤(2)高速逆流色谱纯化a将溶剂系统正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照体积比5:3:5配制于分液漏斗中，充分摇动后静置分层，以上相为固定相，下相为流动相，取50-300 mg浸膏，溶于5mL上相和5mL下相的混合溶液中，作上样溶液使用；b使高速逆流色谱仪以5. 0-20 mL/min的素的充满上相溶液，然后转动主机，同时将流动相泵入，待达到平衡后，由进样阀进样，于254 nm波长下检测，根据检测器谱图收集目标成分； 所述步骤(3)利用液相色谱技术检验样品样品纯度，色谱条件为C18柱(250mm X 4. 6mm),填料直径i. d.，5 μ m,流动相A-甲醇，B-水；梯度洗脱程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,检测波长为 254 nm。
2.根据权利要求I所述的步骤(2)，其特征在于高速逆流色谱所采用的溶剂系统为正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液，体积比为5:3: 5。
3.根据权利要求I所述的步骤(2)，其特征在于高速逆流色谱主机的转速为650-900转/分钟，流动相流速O. 8-3. O mL/min。
4.根据权利要求I所述步骤(2)中大叶白麻浸膏量为50— 300mg，是指数值区间的任一重量大叶白麻浸膏。
5.根据权利要求I所述的应用高速逆流色谱法从大叶白麻中纯化三种黄酮苷的方法，其特征在于异槲皮苷的保留时间为25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留时间为150-220min，异槲皮苷-6”-O-丙ニ酸酯的出峰时间为230-300 min。
全文摘要
一种应用高速逆流色谱法从大叶白麻中纯化三种黄酮苷的方法，其特征是以大叶白麻叶为原料，经过下列步骤处理(1)粗提物浸膏的制备；(2)高速逆流色谱纯化，得到槲皮素-3-O-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-O-丙二酸酯三种黄酮苷，其纯度均高于96%；(3)利用液相色谱技术对样品纯度进行检验。所得三种单体含量均高于95%，符合一类植物新药和标准对照品要求。该方法具有处理简单，样品损失少，制备量大，制备单品纯度高及重复性好等优点，适用于从各种含有槲皮素-3-O-槐糖苷、异槲皮苷和异槲皮苷-6”-O-丙二酸酯的天然产物中获取其高纯度单体。
文档编号C07H17/07GK102702289SQ20121018247
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者史俊友, 景年华, 江帆 申请人:曲靖师范学院