专利名称：赋予kokumi的作用剂的制作方法
技术领域：
本申请要求以下申请的优先权2005年11月9日提交的日本专利申请No. 2005-325300，2006 年 7 月 7 日提交的日本专利申请 No. 2006-188458，2005 年 11 月 22日提交的美国临时专利申请No.60/738562，2006年7月20日提交的美国临时专利申请No. 60/807831，将所述申请作为参考并入本文。本发明涉及用于筛选赋予kokumi的物质(kokumi-imparting substance)的方法，赋予kokumi的作用剂(kokumi-imparting agent),其含有通过所述筛选方法获得的赋予kokumi的物质作为活性成分，用于产生食物或饮料例如赋予了 kokumi的食物、调味品和饮料的方法，和赋予了 kokumi的食物或饮料。
背景技术：
钙受体也称为钙感应受体(CaSR)，是由1078个氨基酸组成的受体，并且归类在C类七次-跨膜受体(G蛋白偶联受体；GPCR)中。在1993年报导了这种钙受体的基因的克隆(非专利文件I)，并且已知当用钙等将其激活时，通过提高胞内钙水平等来引起多种细胞应答。将人钙受体的基因序列登记为GenBank登录号NM_000388，并且在动物中非常保守。前述钙受体可以起到促进或阻抑生物学功能的作用。因此，目前，将可以作为钙受体的激活剂和抑制剂的治疗剂根据病理状态适当地使用在神经疾病、肝病、心血管疾病、消化系统疾病和其它疾病的治疗中。例如，钙受体能够检测甲状旁腺(parathyroid)中血钙水平的增加，并且阻抑甲状旁腺激素(PTH)的分泌以修正血钙水平。因此，预期钙受体激活剂具有降低血钙水平的效果。事实上已经阐明当使用钙受体激活剂来治疗血液透析患者中的继发性甲状旁腺功能允进症(secondary hyperparathyroidism)时,其降低PTH水平而不提高钙和磷的水平。由于I丐受体的功能分析主要就I丐体内平衡(calcium homeostasis)来进行，因此迄今为止的应用研究主要关注涉及钙调节的骨代谢疾病。然而，从遗传表达分析等结果(非专利文件2和3)逐渐认清，钙受体广泛分布在除甲状旁腺和肾之外的活体之中，并且提出它们涉及多种生物学功能和引起疾病的可能性。例如，估计钙受体涉及肝、心、肺、消化道、淋巴细胞和胰的功能。本发明的发明人还使用从大鼠组织中提取的RNAs通过基于RT-PCR的分析确认了钙受体在活体中的多种组织中表达。从前述观点看，目前钙受体的激活剂和抑制剂的应用价值正在迅速增加。此夕卜，除钙之夕卜，阳离子如钆(gadolinium)阳离子，碱性肽如聚精氨酸 (polyarginine),多胺如精胺,氨基酸如苯丙氨酸等已被报导为1丐受体激活剂(非专利文件4)。
尽管迄今为止已经开发了如上所述作为钙受体激活剂的许多特异性激活剂，但是在它们之中存在于活体中的化合物很少，而且存在于活体中的化合物活性非常低。因此，含有这些激活剂的用于多种疾病的治疗剂具有严重的涉及副反应、透性和活性的问题。例如，尽管已知氨基酸作用于钙受体，但是由于活性非常弱，认为氨基酸作为激活剂的实际应用是困难的。此外，尽管如上所述已经报导了大分子如聚精氨酸作为激活剂，但是估计所述功能是基于作为具有不规则结构的多价阳离子的作用。即，具有特定结构的肽是否为有用的钙受体激活剂是未知的。同时，在食品(foodstuff)领域中，味道物质已经应用了许多年。具体而言，具有五种基本味道即甜味、咸味、酸味、苦味和鲜味(umami)的物质,和增强这些味道的物质已经广泛用作调味品。作为不能用上述味道来表示的味道概念，还存在“kokumi”。kokumi的意思是不能用五种基本味道表示的味道，并且意指这样的味道，其不仅增强基本味道，还增 强基本味道的边缘味道(marginal taste),例如醇厚感(thickness)、充盈感(growth)(满口感(mouthfulness))、绵延感(continuity)和协调感(harmony)。迄今为止已经报导了用于赋予kokumi的几种方法,至今已经报导的是谷胱甘肽(glutathione)(专利文件I)、明胶和原肌球蛋白(tropomyosin)的加热产物(专利文件2)、含有砜基的化合物(专利文件3)、含有Asn-His序列的肽(专利文件4)等。尽管如上所述已经尝试了多种赋予kokumi的物质的开发，并且主要对天然产物的提取物进行了商业化，但是目前从天然产物提取物例如谷胱甘肽和N-(4-甲基 _5_氧-I-咪唑啉-2-基)肌氨酸(N- (4-methyl-5-oxo-l-imidazolin-2-yl) sarcosine)来分离纯kokumi成分的实例非常少。因此，开发高效、安全和廉价的赋予kokumi的物质是期望的，并且为了这个目的需要一种方便和高灵敏的筛选赋予kokumi的物质的方法。[非专利文件I] Nature, 1993 Dec 9; 366 (6455) : 575-80 [非专利文件 2] J. Endocrinol.，2000 May, 165 (2) : 173-7[非专利文件 3]Eur. J. Pharmacol.，2002 Jul. 5，447(2-3) :271-8[非专利文件 4]Cell Calcium. , 2004 Mar. , 35(3) :209-16[专利文件I]日本专利No.1464928[专利文件 2]日本专利 Laid-open Publication(KOKAI)No. 10-276709[专利文件3]日本专利 Laid-open Publication(KOKAI)No. 8-289760[专利文件4]冊2004/09683
发明内容
[本发明解决的问题]本发明的一个目的是提供方便和高灵敏的筛选赋予kokumi的物质的方法，高效、安全和廉价的赋予kokumi的作用剂，用于产生食物或饮料例如赋予了 kokumi的食物、调味品和饮料的方法，和赋予了 kokumi的食物和饮料。[解决问题的方法]作为搜索钙受体的激活剂的结果，本发明的发明人发现低分子肽(包括谷胱甘肽)能够激活钙受体。此外，由于已知谷胱甘肽是赋予kokumi的物质，他们评估了作为钙受体激活剂的低分子肽是否赋予kokumi，并且发现所述低分子肽赋予了 kokumi。基于这些发现完成了本发明。S卩，本发明提供以下。(I)筛选赋予kokumi的物质的方法，所述方法使用钙受体活性作为指标。(2)根据⑴的筛选方法，其中所述赋予kokumi的物质增强咸味、鲜味、甜味或酸味中的至少一种。(3)根据⑴或⑵的筛选方法，所述方法包括第一步，将钙受体和测试物质反应并且检测钙受体活性；和第二步，测量第一步中检测到钙受体激活活性的测试物质赋予kokumi的效果。 (4)赋予kokumi的作用剂，所述作用剂包含通过根据⑴至(3)中任一项的方法可以获得的赋予kokumi的物质作为活性成分。(5)根据⑷的赋予kokumi的作用剂，所述作用剂包含一种或多种选自下列的物质Y-Glu-X-Gly(X代表除Cys之外的氨基酸或氨基酸衍生物)、y-Glu-Val-Y (Y代表氨基酸或氨基酸衍生物)、Y -Glu-Ala, y-Glu-Gly, y-Glu-Cys, y-Glu-Met,
Y-Glu-Thr^ Y -Glu-VaK Y -Glu-Orn^ Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、Y -Glu-Met (0) ^ Y -Glu- Y -Glu-VaK Y-Glu-Val-NH2、Y-Glu-Val-ol、
Y—Glu-Ser^ Y —Glu-Tau^ Y —Glu-Cys(S-Me) (0) ^ Y —Glu-Leu^ Y —Glu-Ile^ Y —Glu-1—Leu和 y —Glu-Cys(S-Me) 0(6)根据(5)的赋予kokumi的作用剂,其中所述X是Cys (SNO)、Cys (S_烯丙基)、Gly、Cys (S-Me)、Abu 或 Ser,并且 Y 是 Gly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、P;ro、Arg、Asp、Met、Th;r、His、Orn> Asn、Cys 或 Gin。(7)根据(4)至(6)中任一项的赋予kokumi的作用剂，所述作用剂增强咸味、鲜味、甜味或酸味。(8)食物组合物，其含有选自根据⑷至(7)中任一项的赋予kokumi的作用剂的一种或多种物质，和选自具有钙受体激活活性的其它化合物的一种或多种物质。(9)根据￠)的食物组合物，其中所述具有钙受体激活活性的其它化合物是钙、鱼精蛋白、聚精氨酸、精胺、聚赖氨酸、谷胱甘肽和拟钙剂(cinacalcet)。(10)生产被赋予了 kokumi的食物或饮料的方法，所述方法包括将根据⑷至(7)中任一项的一种或多种赋予kokumi的作用剂添加至食物或饮料，从而使所述食物或饮料含有I质量PPb至99. 9质量％的所述赋予kokumi的作用剂。(11)生产被赋予了 kokumi的食物或饮料的方法，所述方法包括将调味品添加至食物或饮料，所述调味品含有I质量PPb至99. 9质量％的一种或多种根据(4)至(7)中任一项的赋予kokumi的作用剂，从而使所述食物或饮料含有0. 01-10质量％的所述调味品。(12)通过根据(9)或(10)的方法可以获得的赋予了 kokumi的食物或饮料。(13)组合物，其含有I质量ppb至99. 9质量%的y -Glu-Val-Gly和I质量ppb至99. 9质量％的选自钙、鱼精蛋白、聚精氨酸、精胺、聚赖氨酸、谷胱甘肽和拟钙剂的一种或多种物质。(14)组合物，其含有I质量ppb至99. 9质量％的选自谷胱甘肽、鱼精蛋白、聚赖氨酸、GABA和它们的盐形式的一种或多种物质，和I质量ppb至99. 9质量％的钙或其盐形式。(15)由下式表示的化合物y -Glu-X-Gly (X 代表 Asn、Gin、His、Lys> Orn 或 Arg)或 y -Glu-Val-Y (Y 代表Leu> lie、Ser> Thr> Met> Cys、Asp、Asn、Gin、Lys> Orn> Arg、Phe> Tyr> Pro、Hyp、Trp> His 或Abu)。(16)通过根据(I)至(3)中任一项的方法可以获得的赋予kokumi的物质作为赋予kokumi的作用剂的用途。(17)将kokumi赋予食物或饮料的方法，其包括将通过⑴至(3)中任一项的方法可以获得的赋予kokumi的物质添加至食物或饮料。发明效果根据本发明，提供方便和高灵敏的筛选赋予kokumi的物质的方法，通过所述筛选方法可获得的高效、安全和廉价的赋予kokumi的作用剂，产生食物或饮料例如赋予了kokumi的食物、调味品和饮料的方法,和赋予了 kokumi的食物和饮料。附图
简述[图I]显示钙对钙受体的作用的图示。通过显微注射将人|丐受体cRNA引入非洲爪娃(Xenopus Iaevis)卵母细胞。记录当以任意浓度(arbitrary concentration)添加氯化I丐溶液时,流过的胞内应答电流(intracellular response current)的值。将胞内电流的最大值看作应答电流值。确认了在作为对照的通过显微注射引入蒸馏水的卵母细胞中未观察到应答。[图2]显示L-氨基酸对钙受体的作用的图示。通过显微注射将人钙受体cRNA引入非洲爪蛙卵母细胞。记录当添加IOmM L-氨基酸溶液时，流过的胞内应答电流的值。将胞内电流的最大值看作应答电流值。确认了在作为对照的通过显微注射引入蒸馏水的卵母细胞中未观察到应答。[图3]显示D-氨基酸对钙受体的作用的图示。通过显微注射将人钙受体cRNA引入非洲爪蛙卵母细胞。记录当添加IOmM D-氨基酸溶液时，流过的胞内应答电流的值。将胞内电流的最大值看作应答电流值。确认了在作为对照的通过显微注射引入蒸馏水的卵母细胞中未观察到应答。[图4]显示肽对钙受体的作用的图示。通过显微注射将人钙受体cRNA引入非洲爪蛙卵母细胞。记录当以任意浓度添加肽溶液时，流过的胞内应答电流的值。将胞内电流的最大值看作应答电流值。确认了在作为对照的通过显微注射引入蒸馏水的卵母细胞中未观察到应答。实施发明的最佳模式在下文中，将详细解释本发明。在本说明书中，“钙受体”也称为钙感应受体(CaSR)，并且属于C类七次-跨膜受体(seven-transmembrane receptor)。在本说明书中,“I丐受体活性”的意思是结合至前述钙受体以激活鸟嘌呤核苷酸结合蛋白并且由此发送信号。此外，在本说明书中，“钙受体激 活剂”是作用于前述钙受体以激活该钙受体并且控制表达钙受体的细胞的功能的物质。在本说明书中，“kokumi”的意思是不能由五种基本味道，甜味、咸味、酸味、苦味和鲜味(umami)表示的味道，其中，不仅使所述基本味道增强，还使基本味道的边缘味道增强，所述边缘味道例如醇厚感、充盈感(满口感)、绵延感和协调感。此外，“赋予kokumi的作用剂”或“赋予kokumi的物质”指以下作用剂或物质其能够增强五种基本味道，甜味、咸味、酸味、苦味和鲜味，并且伴随所述基本味道赋予基本味道的边缘味道，例如醇厚感、充盈感(满口感)、绵延感和协调感。因此，本发明的赋予kokumi的作用剂还能够用作甜味增强剂、咸味增强剂、酸味增强剂、苦味增强剂或鲜味增强剂。对于kokumi的强度，“前味和中味(first and middle taste) ”的意思是在食用之后0_4秒期间感受的味道，而“后味(aftertaste) ”的意思是在食用后5秒之后感受的味道。在本说明书中，除非另有说明，构成肽的全部氨基酸和氨基酸残基均为L-异构体。<1>筛选赋予kokumi的物质的方法本发明筛选赋予kokumi的物质的方法(在下文中也称作本发明的筛选方法)的特征在于使用钙受体活性作为指标。具体而言，本发明的筛选方法包括第一步，将钙受体和测试物质反应并且检测钙受体活性；和第二步，测量第一步中检测到钙受体激活活性的测试物质赋予kokumi的效果。本发明的筛选方法的具体方法步骤在下文中示例。然而，本发明的筛选方法的步骤不限于这些步骤。I)将测试物质添加至用于测量钙受体活性的钙受体活性测量系统，并且测量钙受体活性。2)比较添加测试物质时获得的钙受体活性和不添加测试物质时获得的钙受体活性。3)选择在添加该测试物质时，显示较高钙受体刺激活性的测试物质。4)测量选择的测试物质赋予kokumi的效果,并且选择具有赋予kokumi的效果的测试物质。通过使用例如使用表达钙受体的细胞的测量体系来测量钙受体活性。所述细胞可以是内源表达钙受体的细胞，或引入外源钙受体基因的重组细胞。作为前述的钙受体活性测量系统，可以不受具体限定地使用任何系统，只要在将对于钙受体是特异性的胞外配体(激活剂)添加至表达钙受体的细胞时，用选择的系统能够检测所述激活剂和钙受体的结合(反应)，或响应于所述激活剂和钙受体的结合(反应)将可检测的信号传送至细胞中。当测试化合物的反应产生钙受体活性时；则将这种测试化合物确定为具有钙受体激活活性，并且是赋予kokumi的化合物。通过人的味道测试等能够确认前述的赋予kokumi的效果。此外，不具体限定用于筛选的测试物质，并且可以使用低分子化合物、糖、肽、蛋白质等。作为前述的钙受体，由登记为GenBank登录号匪000388的人钙受体基因编码的人钙受体可作为优选实例来示例。此外，钙受体不限于由前述序列的基因编码的蛋白质，并且其可以是由与前述序列具有60%或更高同源性，优选80%或更高同源性，更优选90%或更高同源性的基因编码的蛋白质，只要所述蛋白质具有钙受体功能。还已知GPRC6A受体和
5.24受体是钙受体的亚型，并且可将它们用于本发明。能够通过在细胞中表达感兴趣的基因并且测量添加钙时的胞内钙离子浓度或电流的变化，来检测钙受体功能。不具体限定钙受体的来源，并且除前述人钙受体之外，实例还包括源自动物例如小鼠、大鼠和犬的钙受体。如上所述，能够通过使用表达钙受体或其片段的活细胞、表达钙受体或其片段的细胞膜、含有钙受体的蛋白质或其片段的体外系统等来确认钙受体活性。使用活细胞的实例在下文显示。然而，钙受体活性的确认不限于该实例。钙受体能够在培养的细胞例如非洲爪蛙卵母细胞、仓鼠卵巢细胞和人胎肾细胞中表达。能够通过以下方法来表达钙受体将钙受体的基因克隆至可含有外源基因的质粒中，并且引入所述质粒或通过使用该质粒作为模板获得的cRNA。为了检测反应，可使用电生理技术、指不胞内I丐水平提闻的突光指不剂等。 首先基于对钙或特异性激活剂的应答来确认钙受体的表达。使用在大约5mM的钙浓度下显示胞内电流的卵母细胞或在大约5mM的钙浓度下显示荧光指示剂的荧光的培养细胞。通过改变钙浓度来测定钙浓度相关性(dependency)。其后，将测试物质例如肽制备成大约I y M至ImM的浓度，并且添加至卵母细胞或培养的细胞,并测量所述测试物质例如前述的肽的受体活性。<2>赋予kokumi的作用剂本发明的赋予kokumi的作用剂包含通过本发明的筛选方法可以获得的赋予kokumi的物质作为活性成分。本发明的赋予kokumi的作用剂含有例如选自
Y-Glu-X-Gly (X代表除Cys之外的氨基酸或氨基酸衍生物)、Y -Glu-Val-Y (Y代表氨基酸或氨基酸衍生物)、Y -Glu-Ala> y -Glu-Gly> y -Glu-Cys> y -Glu-Met> y -Glu-Thr>
Y-Glu-Val、Y -Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys_Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D_Cys、Y-Glu-Met (0)、Y-Glu-Y-Glu-Val、Y-Glu-Val-NH2. Y—Glu-Val-ol、Y—Glu-Ser、Y_Glu_Tau、Y—Glu-Cys(S-Me) (0)、Y—Glu-Leu^ Y—Glu-IIe^ Y—Glu-1—Leu 和
Y-Glu-Cys (S-Me)中的一种或多种物质(在下文中也称作“用于本发明的肽和氨基酸”)作为活性成分。还能够通过上述筛选方法来获得这些肽和氨基酸。在本文中，“氨基酸”的意思是但不限于中性氨基酸例如Gly、Ala、Val、Leu、lie、Ser> Thr> Cys、Met、Asn、Gin、Pro和Hyp，酸性氨基酸例如Asp和Glu，碱性氨基酸例如Lys、Arg和His，芳族氨基酸例如Phe> Tyr> Trp,和其它氨基酸例如高丝氨酸(homoserine)、瓜氨酸(citrulline)、鸟氨酸(ornithine)、a -氨基丁酸(alpha-aminobutylic acid)、正缴氨酸(norvaline)、正亮氨酸(norleucine)和牛横酸(taurine)。在本说明书中，氨基酸残基的缩写如下(I)Gly:甘氨酸(2) Ala:丙氨酸(3) Val:缬氨酸(4) Leu:亮氨酸(5) IIe:异亮氨酸(6)Met:甲硫氨酸(7) Phe:苯丙氨酸(8) Tyr:酪氨酸(9) Trp:色氨酸(IO)His:组氨酸
(Il)Lys:赖氨酸(12)Arg:精氨酸(13) Ser:丝氨酸(14) Thr:苏氨酸(15) Asp:天冬氨酸(I6)Glu:谷氨酸(17)Asn:天冬酰胺(18) Gln:谷氨酰胺 (19) Cys:半胱氨酸(20)Pro:脯氨酸(21) Orn:鸟氨酸(22) Sar:肌氨酸(23) Cit:瓜氨酸(24) N-Val:正缬氨酸(25) N-Leu:正亮氨酸(26) Abu: a -氨基丁酸(27) Tau:牛磺酸(28) Hyp:羟脯氨酸(29) t-Leu:叔亮氨酸此外，“氨基酸衍生物”的意思是上述氨基酸的多种类型的衍生物，可例示为但不限于稀有氨基酸、非天然氨基酸、氨基醇、取代氨基酸，其中用各种取代基取代氨基酸侧链例如羰基、氨基和巯基(thiol group)。这些取代基包括烃基(alkyl group)、酰基、轻基、氨基、烷基氨基(alkylamino)、硝基、磺酰基和多种保护基团。这些取代氨基酸包括，例如，Arg(NO2) :N-Y-硝基精氨酸、Cys (SNO) : S-硝基半胱氨酸、Cys (S-Me) :S-甲基半胱氨酸、Cys (S-烯丙基)S-烯丙基半胱氨酸、Val-NH2:缴氨酰胺(valinamide)、Val_ol:缴氨醇(valinol) (2-氨基-3-甲基-I- 丁醇)。在本说明书中，Y-Glu-Cys(SNO)-Gly具有以下结构式，并且式Y-Glu-Met(O)和
Y-Glu-Cys (S-Me) (0)中的“(0) ”表示亚砜结构。式Y -Glu中的“ U ) ”表示谷氨酸通过谷氨酸中Y位的羧基键合至另一个氨基酸。
I r H
HO2CN \^°2丨丨
§H
NH2O
S-亚硝基谷胱甘肽(GNSO)Y-Glu-X-Gly (X代表除Cys之外的氨基酸或氨基酸衍生物)、y-Glu-Val-Y(Y代表氨基酸或氨基酸衍生物)、Y -Glu-Ala, y-Glu-Gly, y-Glu-Cys, y-Glu-Met,y -Glu-Thr> y -Glu-Val> y -Glu-0rn> Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met> Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、y -Glu-Met (0) > y -Glu- y -Glu-Val > y -Glu-Val-NH2> y -Glu-Val-ol >y —Glu-Ser> y —Glu-Ta u-, y —Glu-Cys (S-Me) (0)、y —Glu-Leu-, y —Glu-Ile-, y —Glu-1—Leu和Y-Glu-Cys(S-Me)赋予kokumi。因此，Y-Glu-X-Gly (X代表除Cys之外的氨基酸或氨基酸衍生物)、Y-Glu-Val-Y (Y代表氨基酸或氨基酸衍生物)、y -Glu-Ala, y-Glu-Gly,Y-Glu-Cys、y -Glu~Met> y -Glu-Thr> y -Glu-Val> Y-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp> D_Cys、y -Glu-Met (0)、y -Glu- y -Glu-Val、Y-GIu-VaI-NH2、y-Glu-Val-ol, y-Glu-Ser, y-Glu-Tau, y-Glu-Cys(S-Me) (0),y -Glu~Leu> y -Glu-Ile> y -Glu-t-Leu 和 Y-Glu-Cys (S-Me)(下文中也称作“用于本发明的肽和氨基酸”)能够作为赋予kokumi的作用剂使用。用于本发明的肽和氨基酸可以独立地使用，或者可以作为它们中任意两种或多种的混合物使用。在这些之中，优选具有以下结构式的化合物Y -Glu-X-Gly (X 代表 Cys (SNO)、Cys (S-烯丙基)、Gly、Cys (S-Me)、Abu 或Ser)或 y -Glu-Val-Y(Y 代表 Gly、Val、Glu、Lys> Phe> Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn> Asn、Cys 或 Gin)。在这些之中，具有以下结构式的化合物是由本发明的发明人新合成的新物质，并且本发明包括这些化合物的发明Y-Glu-X-Gly (X代表Asn、Gln、His、Lys、0rn或Arg)和y -Glu-Val-Y (Y 代表 Leu> lie、Ser、Thr、Met、Cys、Asp、Asn、Gin、Lys、Orn、Arg、Phe、Tyr、Pro、Hyp、Trp> His 或 Abu)。此外,在这些新物质中，Y -Glu-X-Gly (X 代表 Asn、Gin、His、Lys> Orn 或 Arg)和 Y -Glu-Val-Y (Y 代表 Ser、Thr、Met、Cys、Asp、Asn、Gin、Lys、Orn、Arg、Pro或His)是优选的。尽管已知味道肽(taste peptide)的阈浓度(允许感觉味道的最小浓度)是大约0. 2% (MSG的阈浓度的1/10)，并因此使它们实用性不足(J. Agr. FoodChem.，vol. 23，No. I, 49-53 (1975))，但是本发明的化合物在大约0. 0001-0. 1%的极低浓度即显示增强kokumi的活性，并且因此它们是具有极高活性的非常有用的化合物。如前述的用于本发明的肽和氨基酸，如果它们可以作为商业产品获得，则可以使用那些。此外，能够通过合适地使用已知的技术来获得所述肽，所述技术例如(I)化学合成它们的方法，或(2)通过酶反应合成它们的方法。由于用于本发明的肽含有的氨基酸残基的残基数目相对小至2或3个残基，化学合成它们的方法是方便的。在化学合成它们时，可使用肽合成器来合成或半合成寡肽。化学合成它们的方法的实例包括，例如，肽固相合成方法。可以通过常规方法，例如，离子交换层析、反相高效液相层析、亲和层析等来纯化如上所述合成的肽。这种肽固相合成方法和下文的肽纯化是本技术领域熟知的。此外，用于本发明的肽还可通过酶反应制备。例如，可使用国际专利公开W02004/011653中描述的方法。即，还可如下来制备它们将羧基末端被酯化或酰胺化的一个氨基酸或二肽与具有游离氨基的氨基酸(例如，羧基被保护的氨基酸)在肽产生酶(peptide producing enzyme)的存在下反应,并且纯化制得的二肽或三肽。肽产生酶的实例包括具有产生肽的能力的微生物的培养物、从这种培养物分离的微生物细胞、这些微生物的细胞的加工产品、由这些微生物得到的肽产生酶等。用于本发明的肽和氨基酸还包括盐形式的那些。当用于本发明的肽和氨基酸是盐形式时，它们可以是药理上可接受的盐。在式中具有酸性基团(例如羧基)的盐的实例包括铵盐，与碱金属例如钠和钾成的盐，与碱土金属例如钙和镁成的盐，铝盐，锌盐，与有机胺例如三乙胺、乙醇胺、吗啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪和二环己胺成的盐和与碱性氨基酸例如精氨酸和赖氨酸成的盐。在式中存在碱性基团的情况下，与碱性基团成的盐的实例包括与无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸和氢溴酸成的盐，与有机羧酸例如乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、琥拍酸、鞋酸、丁酸、轻节基苯甲酸(hibenzoic acid)、扑酸(pamoicacid)、庚酸(enanthoic acid)、癸酸(decanoic acid)、teoclic acid、水杨酸、乳酸、草酸、扁桃酸(mandelic acid)和苹果酸成的盐,和与有机磺酸例如甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸成的盐。不具体限定赋予kokumi的物质和赋予kokumi的作用剂的使用方法,所述赋予 kokumi的物质通过本发明的筛选方法获得,所述赋予kokumi的作用剂含有选自用于本发明的肽和氨基酸中的一种或多种物质作为活性成分；并且可通过将它们添加至食物或饮料例如调味品、食物和饮料来使用所述赋予kokumi的物质和赋予kokumi的作用剂。可通过将赋予kokumi的物质独立地或与其它多种添加剂等组合添加至食物或饮料例如调味品、食物和饮料来使用通过本发明的筛选方法获得的赋予kokumi的物质。此外,本发明的赋予kokumi的作用剂可以例如仅由选自前述用于本发明的肽和氨基酸中的一种或多种物质组成；此外，其还可以含有任意添加的其它现有的具有赋予kokumi的活性的化合物(例如谷胱甘肽和大蒜素(alliin))或其它多种添加剂等。此外，本发明的赋予kokumi的作用剂可以含有一种或多种现有的具有钙受体激活活性的化合物，并且这样的组合物也落入本发明的范围内。前述现有的具有钙受体激活活性的化合物的实例包括阳离子例如钙和钆阳离子，碱性肽例如聚精氨酸和聚赖氨酸，多胺例如腐胺(putrescine)、精胺(spermine)和亚精胺(spermidine),蛋白质例如鱼精蛋白，氨基酸例如苯丙氨酸和谷胱甘肽,拟I丐剂等。这 些化合物还可以是它们任何可以接受的盐形式。另外，本发明的发明人发现谷胱甘肽具有隹丐受体激活活性。同样，本发明的发明人也已发现，当那些具有赋予kokumi的活性的现有化合物(例如谷胱甘肽)以及本发明的赋予kokumi的作用剂与具有钙受体激活活性的化合物一起配制在组合物中时，还可改进它们赋予kokumi的活性；即，这样的组合物也落在本发明的范围内。作为前述的添加剂，可以使用任何已知能够添加和混合至食物或饮料例如调味品、食物和饮料的那些而无具体限定。这些添加剂的实例包括，例如，香料(perfume)、糖、甜味剂(sweetner)、膳食纤维、维生素、氨基酸例如谷氨酸钠(MSG)、核酸例如一磷酸肌苷(IMP)、无机盐例如氯化钠、水等。
在本发明的筛选方法中获得的赋予kokumi的物质或本发明的赋予kokumi的作用剂用于食物或饮料中的量可以是有效赋予kokumi的量，并且依赖于目的适当地调节该量。然而，举例而言，在调味品、食物或饮料的情况下，按照本发明的赋予kokumi的作用剂或赋予kokumi的物质的总量,其可以是所述调味品、食品或饮料的I质量ppb至99. 9质量％,优选10质量ppb至99. 9质量％,更优选10质量ppm至10质量％。因此，通过将由本发明的筛选方法获得的赋予kokumi的物质或本发明的赋予kokumi的作用剂中的一种或多种添加至食物或饮料，从而使所述食物或饮料含有大约I质量ppb至99. 9质量％,优选10质量ppb至99. 9质量％,更优选10质量ppm至10质量％的所述物质或作用剂，由此能够产生被赋予了 kokumi的食物或饮料。此外，也可通过将调味品添加至食物或饮料,所述调味品含有I质量ppb至99. 9质量％的一种或多种由本发明的筛选方法获得的赋予kokumi的物质或本发明的赋予kokumi的作用剂，从而使所述食物或饮料含有0. 01-10质量％，优选0. 1-10质量％的所述调味品，由此来制备赋予了 kokumi的食物或饮料。
在将通过本发明的筛选方法获得的赋予kokumi的物质或本发明的赋予kokumi的作用剂添加至食物或饮料时，所述物质或作用剂的形式可以是干粉、糊(paste)、溶液等，并且不具体限定其物理性质。
实施例在下文中，将参考实施例对本发明进行具体解释。然而，本发明的范围不限于这些实施例。〈实施例1>〈制备基因(CRNA)>如下制备钙受体的基因。基于在NCBI登记的DNA序列(钙受体NM_000388)，设计了用于PCR的合成寡聚DNAs (正向引物(N)和反向引物(C))(表1，SEQ ID N0S: I和2)。表I合成寡聚DNAs (正向引物(N)和反向引物(C)，h:人)
1^1序列(5’ -3’ )
hCASR—N ACTAATACGACTCACTATAGGGACCATGGCATTTTATAGCTGCTGCTGG hCASR—C TTATGMTTCACTACGTTTTCTGTAACAG通过使用人肾cDNA (Clontech)作为材料，合成了表I中显示的引物(hCASR_N(SEQ ID NO: I)和 hCASR_C(SEQ ID N0:2))，并且通过使用 Pfuultra DNAPolymerase (Stratagene)在以下条件下进行PCR。在94° C反应3分钟之后,将94° C 30秒、55° C 30秒和72° C 2分钟的反应循环重复35次，其后将反应在72° C进行7分钟。通过进行琼脂糖电泳、用DNA染色剂染色和紫外照射来检测是否通过PCR获得了扩增。通过与同时进行电泳的已知大小的DNA标记的比较来确认PCR产物的链长。用限制酶EcoRV消化质粒载体pBR322 (Takara)。通过使用Ligation Kit (连接试剂盒)(Promega)将PCR扩增的基因片段连接至所述质粒的切割位点。用每种连接反应溶液转化大肠杆菌DH5 a菌株，并且选择含有质粒的转化体，在所述质粒中克隆有PCR扩增产物。通过DNA序列分析来确认PCR扩增产物。通过使用这种重组质粒作为模板以及cRNA制备试剂盒(Ambion),制备了钙受体基因的cRNA。
〈实施例2>〈制备多种样品〉作为L-氨基酸样品，使用23种特级(special grade)氨基酸，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、牛磺酸(这些全部来自Ajinomoto)和轻脯氨酸(Nakarai Tesque)。D-Cys和D-Trp (Nakarai Tesque)和氯化I丐使用特级品。此外，作为肽样品，使用y-Glu-Cys-Gly(Sigma Aldrich Japan)、y -Glu-Cys(SNO)-Gly(Doj in ChemicalLaboratory)> y -Glu-Ala (BachemFeinchemikalien AG)、y-Glu-Gly(BachemFeinchemikalien AG)、y -Glu-Cys(Sigma Aldrich Japan)、y-Glu-Met(BachemFeinchemikalien AG)、y -Glu-Abu-Gly (Abu: a -氨基丁酸，Bachem FeinchemikalienAG)、y-Glu-Thr(Kokusan Chemical)、y-Glu-Val(Kokusan Chemical)、y-Glu-Leu (合同制造产品(contract manufactured product))、y -Glu-Ile (合同制造产品)、
Y-Glu-Orn (Kokusan Chemical)、Asp-Gly (合同制造产品)、Cys-Gly (合同制造产品)、Cys-Met (合同制造产品)、Glu-Cys (合同制造产品)、Gly-Cys (合同制造产品)、Leu-Asp (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Val (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Glu (合同制造产品)、Y-Glu-Val-Lys (合同制造产品)、Y-Glu-Y-Glu-Val (合同制造产品)、
Y-Glu-Gly-Gly (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Phe (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Ser (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Pro (合同制造产品)Y -Glu-Val-Arg (合同制造产品)、
Y-Glu-Val-Asp (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Met (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Thr (合同制造产品)、Y-Glu-Val-His (合同制造产品)、Y-Glu-Val-Asn (合同制造产品)、
Y-Glu-Val-Gln (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Cys (合同制造产品)、Y -Glu-Val-Orn (合同制造产品)和Y-Glu-Ser-Gly (合同制造产品)。谷氨酰胺和半胱氨酸在使用时制备,而其它样品在制备后贮藏在-20° C。肽使用具有90%或更高纯度的肽。仅Y-Glu-Cys使用具有80%或更高的纯度的y-Glu-Cys。当溶解每种样品的溶液显示酸性或碱性pH时，通过使用NaOH或HCl将溶液调节至大约中性pH。用于溶解氨基酸和肽、制备非洲爪蛙卵母细胞和培养所述卵母细胞的溶液具有以下组成96mM NaCl、2mM KClUmM MgCl2U. 8mM CaCl2,5mM Hepes, pH 7. 2。〈实施例3>〈合成Y-Glu-Val_Gly>将Boc-Val-OH(8.69g, 40. OmmoI)和Gly-OBzl *HC1 (8. 07g, 40. OmmoI)溶解在二氯甲烷(100ml)中，并且将所述溶液保持在0° C。将三乙胺(6. 13ml，44. 0mmol)、H0Bt(l-羟基苯并三唑，6. 74g，44. Ommol)和WSC ^HCl (盐酸I-乙基_3_ (3-二甲胺丙基)碳化二亚胺(l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride),8. 44g,44. Ommol)添加至所述溶液，并且在室温过夜搅拌所述混合物。将所述反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶解在乙酸乙酯(200ml)中。用水(50ml)、5%柠檬酸水溶液(50ml x两次)、饱和盐水(brine) (50ml)、5% 碳酸氧纳(sodium hydrogencarbonate)水溶液(50ml x 两次)和饱和盐水(50ml)来洗涤所述溶液。将有机层通过无水硫酸镁干燥，通过过滤去除硫酸镁，并且将滤液减压浓缩。将残余物从乙酸乙酯/正-己烷重结晶以获得白色晶体Boc-Val-Gly-OBzl (13. 2g, 36. 2mmol)。将Boc-Val-Gly-OBzl (5. 47g, 15. OmmoI)添加至 4N HCl/ 二噁烷溶液(40ml)，并且在室温搅拌所述混合物50分钟。通过减压浓缩来去除二噁烷，向残余物添加正-己烷(30ml)，并且将所述混合物减压浓缩。将这个过程重复3次以定量地获得H-Val-Gly-OBzl HCl。将上述H-Val-Gly-OBzl HCl 和 Z-Glu-OBzl (5. 57g, 15. Ommol)溶解在二氯甲烷(50ml)中，并且将所述溶液保持在O。C。将三乙胺(2. 30ml，16. 5mmol)、HOBt (I-羟基苯并三唑，2. 53g, 16. 5mmol)和WSC HCl (盐酸I-乙基-3-(3- 二甲胺丙基)碳化二亚胺，3. 16g, 16. 5mmol)添加至所述溶液，并且将混合物在室温搅拌2天。将所述反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶解在经加热的乙酸乙酯(1500ml)中。用水(200ml)、5%柠檬酸
水溶液(200ml X两次)、饱和盐水(150ml)、5%碳酸氢钠水溶液(200ml x两次)和饱和盐水(150ml)来洗涤所述溶液。将有机层通过无水硫酸镁干燥，通过过滤去除硫酸镁，并且将滤液减压浓缩。通过过滤收集沉积的晶体，并且减压干燥以获得白色晶体Z-Glu (Val-Gly-OBzl) -OBzl (6. 5 Ig, 10. 5mmol)。将上述Z-Glu(Val-Gly-OBzl)-OBzl (6. 20g, 10. 03mmol)悬浮在乙醇(200ml)中，并且添加10% IE /碳(I. 50g),在氢气气氛(hydrogen atmosphere)中在55° C进行还原反应5小时。在反应期间，逐步添加总共IOOml的水。通过使用Kiriyama漏斗过滤来去除催化剂，并且将滤液减压浓缩至一半的体积。将反应混合物通过膜滤器(membrane filter)进一步过滤，并且减压浓缩滤液。将残余物溶于少量体积的水中，并且添加乙醇以使晶体沉积，再通过过滤收集晶体，并且减压干燥以获得Y-Glu-Val-Gly (2. 85g, 9. 40mmol)的白色粉末。ESI-MS: (M+H)+=304. I1H-匪R (400MHz, D2O) 8 (ppm) :0. 87 (3H, d, J=6. 8Hz)、0. 88 (3H, d, J=6. 8Hz)、
I.99-2. 09 (3H, m)、2. 38-2. 51 (2H, m) 3. 72 (1H, t, J=6. 35Hz)、3. 86 (1H, d, J=17. 8Hz)、
3.80 (1H, d, J=17. 8Hz)、4. 07 (1H, d, J=6. 8Hz)。〈实施例4>〈合成Y-Glu-Cys (S-Me)-Gly [Cys (S-Me) : S-甲基半胱氨酸]〉将还原型谷胱甘肽(15. Og, 48. 8mmol)添加至水(45ml)，并且在向所述混合物中鼓泡通入(bubble)氮气的同时，将氢氧化钠(4. 52g，2. 2当量，107mmol) —部分一部分地(portionwise)添加至所述混合物。将碘代甲烧(methyl iodide) (4. 56ml, I. 5当量，73mmol)添加至混合物，将混合物密封并且在室温搅拌2小时。用浓盐酸将反应混合物调节至PH 2至3，添加乙醇(150ml)，并且在致冷器中贮藏过夜。由于油状物质是分离的，因此将上清去除。当剩余的油状物质溶于水中并且逐渐添加乙醇时，使部分结晶的油状物质沉积。因此，再次去除上清液。将残余物溶于水(300ml)，吸附在填充于柱中的离子交换树脂(Dowex I-乙酸酯，400ml)上，在用水洗涤之后，用IN乙酸水溶液洗脱。将洗脱液减压浓缩，并且从水/乙醇中沉淀以获得Y-Glu-Cys (S-Me)-Gly (5. 08g, 15. 8mmol)的白色粉末。FAB-MS: (M+H)+=3221H-NMR(^OMHz1D2O) 8 (ppm) : 2. 14 (3H, s)、2. 15-2. 22 (2H, m)、2. 50-2. 58 (2H, m)、2.86 (1H, dd, J=9. OHz, J=14. 0Hz)、3. 03 (1H, dd, J=5. OHz, J=14. OHz)、3. 84 (1H, t, J=6. 5Hz)、
3.99 (2H, S)、4. 59 (1H, dd, J=5. OHz, J=9. OHz)。〈实施例5>〈合成其它肽〉按照与实施例3和4中相似的方式合成Y -Glu-Met (0)、y -Glu-Val-NH2,y-Glu-Val-ol> y-Glu-Ser> y-Glu-Tau> y-Glu-Cys (S-Me) (0)> y-Glu-t-Leu>
Y-Glu-Cys (S-烯丙基)-Gly 和 Y -Glu-Cys (S-Me)。〈实施例6> <评估钙受体激活活性>为了评估钙受体激活活性，使用Ca离子浓度依赖性Cl离子电流测量方法，所述方法使用非洲爪蛙卵母细胞表达体系。如果将每种激活剂添加至表达钙受体的非洲爪蛙卵母细胞，则胞内Ca离子增加。随后，Ca离子浓度依赖性Cl通道开启，并且胞内电流值作为离子电流变化。通过测量这种胞内电流值的变化，能够得知是否存在钙受体激活活性。具体而言，将非洲爪蛙的腹部打开，将成批的卵(egg batch)取出并且用1%胶原酶溶液在20° C处理2小时以获得独个的卵母细胞。通过使用微玻璃毛细管(micro glasscapillary)将每一个卵母细胞50nl无菌水或50nl I y g/yl受体cRNA引入卵母细胞中，并且将所述卵母细胞在18° C培养2或3天。对于培养，使用通过向实施例2中所述溶液添加2mM丙酮酸、10U/ml青霉素和10 u g/ml链霉素而获得的溶液。在培养之后，将测试溶液添加至引入了 cRNA或无菌水的卵母细胞。通过使用放大器Geneclamp500 (Axon)和记录软件 AxoScope 9. 0 (Axon)来进行电生理测量(electrophysiological measurement)。通过双电极电压箝位方法(double electrode voltage clamp method)将卵母细胞电压箝位在_70mV，并且通过Ca离子浓度依赖性Cl离子通道测量胞内电流。将胞内电流的最大值看作应答电流值。〈实施例7><评估钙的钙受体激活活性>通过使用实施例6中描述的方法来评估钙的钙受体激活活性。即，制备引入了钙受体cRNA或无菌水的卵母细胞，并且通过双电极电压箝位方法将所述卵母细胞电压箝位在-70mV。向电压箝位的卵母细胞添加钙(2mM、5mM、10mM、20mM)，并且测量Ca离子浓度依赖性Cl应答电流。结果示于图I。从这些结果，确认了引入卵母细胞中的钙受体cRNA的功能性表达。此外，由于引入了水的卵母细胞即使对高浓度钙也不应答，确认了卵母细胞中自身不表达钙受体。〈实施例8><评估L-氨基酸的钙受体激活活性>通过使用实施例6中描述的方法来评估L-氨基酸的钙受体激活活性。即，制备引入了钙受体cRNA或无菌水的卵母细胞，并且通过双电极电压箝位方法将所述卵母细胞电压箝位在70mV。向电压箝位的卵母细胞添加丙氨酸(IOmM)、精氨酸(IOmM)、天冬酰胺(IOmM)、天冬氨酸(IOmM)、半胱氨酸(IOmM)、谷氨酰胺(IOmM)、谷氨酸(IOmM)、甘氨酸(IOmM)、组氨酸(IOmM)、异亮氨酸(IOmM)、亮氨酸(IOmM)、赖氨酸(IOmM)、甲硫氨酸(IOmM)、苯丙氨酸(IOmM)、脯氨酸(IOmM)、丝氨酸(IOmM)、苏氨酸(IOmM)、色氨酸(IOmM)、酪氨酸(IOmM)、缬氨酸(IOmM)、鸟氨酸(IOmM)、牛磺酸(IOmM)或羟脯氨酸(IOmM)，并且测量Ca离子浓度依赖性Cl应答电流。结果示于图2。由这些结果证明半胱氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有确定的钙受体激活活性。对于前述氨基酸，所述激活活性在Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 2000Apr. 25，97(9) :4814-9 中报导。〈实施例9><评估D-半胱氨酸的钙受体激活活性>通过使用实施例6中描述的方法来评估D-半胱氨酸的钙受体激活活性。S卩，制备引入了钙受体cRNA或无菌水的卵母细胞，并且通过双电极电压箝位方法将所述卵母细胞电压箝位在-70mV。向电压箝位的卵母细胞添加D-半胱氨酸(IOmM)、L-半胱氨酸(IOmM)、D-色氨酸(IOmM)或L-色氨酸(IOmM)，并且测量Ca离子浓度依赖性Cl应答电流。结果示于图3。由这些结果证明了 D-半胱氨酸具有确定的钙受体激活活性。
〈实施例10><评估肽的钙受体激活活性>通过使用实施例6中描述的方法来评估肽的钙受体激活活性。S卩，制备引入了钙受体cRNA或无菌水的卵母细胞，并且通过双电极电压箝位方法将所述卵母细胞电压箝位在70mV。向电压箝位的卵母细胞添加Y -Glu-Cys-Gly (50 u M)、y-Glu-Cys (SNO)-Gly (50 u M), y-Glu-Ala (50 u M), y-Glu-Gly (500 u M),y-Glu-Cys (50u M), y-Glu-Met(500 u M), y-Glu-Thr(50u M), y-Glu-Val (50 u M),y -Glu-Orn (500 u M) > Asp-Gly (ImM)、Cys-Gly (ImM)、Cys-Met (ImM)、Glu-Cys (50 u M) >Gly-Cys (500 u M)或Leu-Asp (ImM)，并且测量Ca离子浓度依赖性Cl应答电流。结果示于图4。由这些结果证明了前述肽具有确定的钙受体激活活性。〈实施例11><评估肽的钙受体激活活性>按照与实施例10中相同的方式来评估肽的钙受体激活活性。将表2中显示的每种肽以 1000 u M、300 u M、100 u M.30 u MUO u M,3 u MU U M、0. 3 y M和 0. I y M添加至电压箝位的卵母细胞，并且测量Ca离子浓度依赖性Cl应答电流。将检测到电流的最低浓度示于表2中作为活性。从这些结果，显然这32种肽具有钙受体激活活性。表2
Isirikpfi
~Iy -Glu-Met (0)IOOOy M
2y -Glu-Val-ValIOOOy M
3y -Glu-Val-GluIOOOy M ~y-Glu-Val-LysIOOOy M
5y -Glu-Val-ArgIOOOy M
权利要求
1.由下式表示的化合物Y-Glu-X-Gly (X 代表 Asn、Gin、His、Lys、Orn 或 Arg)或 Y -Glu-Val-Y (Y 代表 Leu、lie、Ser、Thr、Met、Cys、Asp、Asn、Gln、Lys、Orn、Arg、Phe、Tyr、Pro、Hyp、Trp、His 或 Abu)。
全文摘要
本发明涉及赋予kokumi的作用剂，具体涉及使用钙受体活性作为指标的筛选赋予kokumi的物质的方法，含有通过所述筛选方法获得的赋予kokumi的物质作为活性成分的赋予kokumi的作用剂，生产食物或饮料例如赋予了kokumi的食物、调味品和饮料的方法，和赋予了kokumi的食物或饮料。
文档编号C07K5/093GK102702311SQ20121018436
公开日2012年10月3日 申请日期2006年11月8日 优先权日2005年11月9日
发明者大洲竹晃, 宫村直宏, 山中智彦, 江藤让, 竹下亘, 网野裕右, 长崎浩明 申请人:味之素株式会社