一种雷公藤有效成分的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种以雷公藤根为原料提取得到雷公藤红素和雷公藤甲素的新方法。该工艺特征在于萃取分离富集有效分。雷公藤根的醇提取浸膏分配在由聚合物-无机盐水溶液和乙醇形成的双水相体系中，然后用水不溶性有机溶剂对分配在双水相体系中雷公藤浸膏进行萃取，得到有效部位。将得到的有效部位用醇溶解，加水结晶除去大部分非有效物质得到富集的有效部位。该富集的有效部位经过高速逆流色谱分离得到雷公藤红素。该富集的有效部位经过硅胶柱层析分离，重结晶后得到雷公藤甲素。本发明具有以下的优点：1.本发明用聚合物-无机盐水溶液-乙醇-水不溶性有机溶剂三相萃取富集雷公藤有效成分，萃取充分并且不乳化，萃取效率高。2.本发明用沉淀法除杂，显著降低了后续分离的难度。
【专利说明】一种雷公藤有效成分的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化工产品的分离方法，具体是分离雷公藤中有效成分的方法。
技术背景
[0002]卫矛科雷公藤属植物在我国就有10个种，而用于药用的主要有3种:即雷公藤、昆明山海棠(又称粉背雷公藤)和东北雷公藤(又称黑蔓)。雷公藤又称水莽草、黄药、黄藤、菜虫药、断肠草[全国高等植物图鉴，第二册，科学出版社，1982,2686]。雷公藤具有多种药理作用，如:清热解毒、祛风除湿、舒筋活血通络、消肿止痛、杀虫止痒；已用于多种疾病的治疗，如:类风湿性关节炎、某些皮肤病、肾炎、肝炎，有一定的抗肿瘤和抗生育作用，还具有潜在的抗HIV活性[Hongquan Huan et al.Sesquiterpene alkaloids from Tripterygiumhypoglaucum and Tripterygium wilfordii:a new class of potent ant1-HIV agent.Journal of Natural products.2000,63 (3):357-361]。因此,雷公藤中有效成分分离提纯技术的研究对未来新药的研发具有深远的影响。
[0003]目前国内文献报道的对雷公藤的有效成分分离纯化方法主要有:醇提水沉法、水提醇沉法、醇提有机溶剂萃取法[陈俊元等，中国医药工业杂志，1989，5，195-200]。通过比较研究得出的初步结论是，水提醇沉法与醇提水沉法相比提取率相近但是降低了成本，醇提有机溶剂萃取法和前两种工艺相比萃取率最好，但是直接用有机溶剂萃取乳化严重，处理麻烦，难以进行工业生产[李汉堡等，中成药，1991，10，1-4]。上述三种方法都存在如下问题:工艺复杂、物耗过大、收得率低，而且大量使用有毒有害的试剂，如氯仿、乙醚、丙酮等。曾有利用磷酸二氢钠水溶液与乙醇形成双水相，然后用水不溶性溶剂进行三相萃取富集雷公藤有效成分[肖世基等，广西大学学报，2011，3，496-499]。但所用无机盐的回收比较麻烦。而采用聚合物-无机盐水溶液-乙醇-有机溶剂三相萃取法则可以降低无机盐用量，同时聚合物可以通过超滤膜过滤回收，且聚合物与浸膏中的成分存在一定的相互作用，使得萃取可以以一定的选择性进 行。其工艺是将雷公藤根干粉用醇提取，得到提取液，浓缩后得浸膏。将浸膏分散于聚合物-无机盐水溶液-乙醇-水不溶性有机溶剂三相系统中，进行选择性萃取，分离出上层有机相，浓缩有机相得到有效部位，然后将得到的有效部位用醇溶解加水分步结晶除去大部分非有效物质得有效成分部位。有效成分部位用高速逆流色谱分离得到雷公藤红素，用硅胶柱层析分离得到雷公藤甲素。
【发明内容】
[0004]本发明是将雷公藤醇提物用三相萃取分离方法得到雷公藤的有效部位，萃取充分且不产生乳化现象，缩短分离时间。然后用适当的有机溶剂溶解除去不溶物，再分步结晶除去非有效成分。最后将富集得到的雷公藤有效部位用高速逆流色谱进行分离，得到纯度95%的雷公藤红素(tripterine)，用硅胶柱层析分离得到98%的雷公藤甲素(triptolide)。
[0005]本发明分离纯化包括以下方法步骤:[0006]1.雷公藤粗提取物的制备:将雷公藤根粉碎，以2~10倍(w/w)雷公藤干重的醇回流提取I~5次，每次2~5小时，提取液减压浓缩成浸膏；
[0007]2.将上述制得的浸膏溶解分配在0.5-5% PEG-20000、5%~30%硫酸铵水溶液-乙醇双水相体系(PEG-20000-硫酸铵水溶液与乙醇形成等体积的两相体系)中，用石油醚(沸程60-90°C，下同)萃取I~5次，分出石油醚层，浓缩回收。石油醚萃取后余下的双水相再用乙酸乙酯-石油醚混合溶剂(乙酸乙酯体积含量10%~50% )萃取2~10次，萃取液浓缩得浸膏，回收萃取剂可反复使用；
[0008]3.将步骤2所得的乙酸乙酯-石油醚萃取浸膏溶于2~10倍质量的乙醇中，过滤除去不溶物，滤液加水沉淀，低温静置24小时，然后过滤，滤液浓缩得到浸膏；
[0009]4.将步骤3所得浸膏经高速逆流色谱分离得到高纯度的雷公藤红素。色谱条件:正己烷，乙酸乙酯，甲醇，水按体积比为I~4: 2~5: 2~5: I~4充分混合，静置分为两相，分出两相。轻相为固定性，重相为流动相。将步骤3所得浸膏溶解在轻相中，形成
0.5-10%的溶液。温度20~40°C，主机转速600~1000r/min，流动相流速1.0~5.0ml/min。紫外检测器检测波长λ = 425nm。组分峰对应流出液经过浓缩，得到雷公藤红素。
[0010]4.将步骤3所得浸膏经硅胶柱层析分离得到高纯度的雷公藤甲素。色谱条件:干法装柱，干法上样，先用由乙酸乙酯和石油醚按体积比为1: 9~3: 7组成的洗脱液洗去雷公藤甲素前的部分，再用由乙酸乙酯和石油醚体按积比为2: 8~5: 5组成的洗脱液洗脱，定量收集流出液。流出液用雷公藤甲素标样进行跟踪分析，合并相同组分，重结晶后得到雷公藤甲素。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实例对本发`明进行详细描述。
[0012]雷公藤干燥根200kg刨片并粉碎为0.5-1.5mm碎粒，用5倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次3小时。提取液减压浓缩得17kg干浸膏A。取I % PEG-2000-10%硫酸铵4000ml,乙醇4000ml充分混合。然后搅拌下加入Ikg的浸膏A，使之充分溶解和分配。先以2000ml石油醚萃取3次,分出石油醚层浓缩得石油醚部位浸骨135.5g。分去石油醚溶液后余下的双水相，用2000ml萃取剂(乙酸乙酯:石油醚=2: 8，体积比)萃取6次，萃取液浓缩得到16.1g浸膏B。将浸膏B溶解在150ml乙醇中，过滤，除去不溶物得滤液，往滤液中加8ml水，静置后再过滤，然后往滤液再加8ml水，静置过滤，滤液浓缩得结晶物，结晶物再用乙醇溶解，过滤除去固形物，滤液浓缩得9.Sg浸膏C。
[0013]将上面所得浸膏Cl.0g经高速逆流色谱分离。雷公藤红素分离条件如下。色谱条件:正己烷，乙酸乙酯，甲醇，水按体积比为2: 3: 3: 2充分混合，静置分为两相，分出两相。轻相为固定性，重相为流动相。将步骤3所得浸膏溶解在轻相中，形成8%的溶液，进行逆流色谱分离。温度25°C，主机转速800r/min，流动相流速2.0ml/min。紫外检测器检测波长λ = 425nm。组分峰对应流出液经过浓缩，得到雷公藤红素12mg。经高效液相色谱分析，雷公藤红素纯度为96.1%。
[0014]将上述制得的浸膏C 8.Sg经柱色谱分离得雷公藤甲素，分离过程如下:将8.Sg制的浸膏溶解在50ml乙醇中，加入20克300-400目的硅胶拌样。600克300-400目硅胶在105°C下活化40分钟后干法装柱(柱内径7.8cm)，将拌好样的硅胶干法上样，先用20%体积的乙酸乙酯和80%体积的石油醚洗去雷公藤甲素前的部分，再用30%体积的乙酸乙酯和70%体积的石 油醚洗脱，定量收集(300ml/份)流出液。流出液经检测后合并、浓缩，浓缩物经过重结晶后得到雷公藤甲素55mg。经高效液相色谱分析，所得雷公藤甲素纯度为98.5%。
【权利要求】
1.一种以雷公藤根为原料提取得到雷公藤有效成分的新方法，其特征在于，以干燥的雷公藤根为原料，经过刨片并粉碎、溶剂提取，提取液浓缩得到雷公藤浸膏。该浸膏经过部位分离富集，得到富含雷公藤活性物质的有效部位。该有效部位经过高速逆流色谱分离得到高纯度的雷公藤红素，经过硅胶柱层析分离得到雷公藤甲素(又名雷公藤内酯醇)，操作步骤如下: (1)将雷公藤材料刨片并粉碎为0.5-1.5mm碎粒。然后用溶剂热回流提取，选用溶剂为95%乙醇。重复提取3次，每次3小时，滤液减压浓缩，得到浸膏A ； (2)将上述制得的浸膏溶于聚合物-无机盐水溶液-乙醇双水相体系进行分配，然后用石油醚(沸程60-90°C，下同)萃取，分出石油醚溶液。余下双水相体系再用萃取剂萃取，萃取液合并、浓缩得浸膏B。 (3)将(2)所得的浸膏溶于乙醇中，加水后静置结晶，过滤得到滤液，浓缩得到浸膏C。 (4)将(3)所得浸膏C用溶剂溶解成5%溶液，经高速逆流色谱分离得到高纯度的雷公藤红素。将(3)所得浸膏C经硅胶柱层析分离得到高纯度雷公藤甲素。
2.根据权利要求1所叙的雷公藤中有效成分分离工艺，其特征在于所述步骤(2)中，所用聚合物为聚乙二醇-20000 (PEG-20000)，无机盐为硫酸铵。(2)所述的双水相体系，其特征在于由含1% PEG-20000，10%硫酸铵的水溶液与乙醇形成等体积的两相体系。
3.根据权利要求1所叙的雷公藤中有效成分分离工艺，其特征在于所述步骤(2)中，萃取剂由20%体积的乙酸乙酯和80%体积的石油醚组成。
4.根据权利要求1所叙的雷公藤中有效成分分离工艺，其特征在于所叙步骤(3)中，所得的浸膏溶于8倍质量的95%乙醇中，先加入1/2倍浸膏质量的水，静置沉淀，过滤得滤液。在所得滤液中加入1/2倍浸 膏的水，静置沉淀，过滤得滤液，滤液浓缩得固体物。上述固体物再用95%乙醇溶解，过滤除去不容物，滤液浓缩得浸膏。
5.根据权利要求1所叙的雷公藤中有效成分分离工艺，雷公藤红素的分离方法，其特征在于所叙步骤(4)中的高速逆流色谱，所用的固定相和流动相由以下溶剂组成一正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水以此按体积比为I~4: 2~5: 2~5:1~4的比例充分混合，静置分为两相。轻相为固定相，重相为流动相。色谱条件为:25°C下主机转速800转/分。紫外检测器检测波长λ = 425nm。组分峰对应流出液经过浓缩，得到雷公藤红素。
6.根据权利要求1所叙的雷公藤中有效成分分离工艺，雷公藤甲素的分离方法，其特征在于所叙步骤⑷中的硅胶柱层析，经活化(110°C40分钟)的硅胶减压下装填至体积不变，得到干装柱(硅胶高度30~60cm)。浸膏溶解在无水乙醇中成浓度为约5%溶液，加硅胶充分吸附后，去掉溶剂，得到吸样硅胶。以上所用硅胶为300~400目规格。减压下把吸样硅胶加到干装硅胶柱上。减压下加入由乙酸乙酯和石油醚按体积比为1: 9~3: 7组成的洗脱液，直至溶液达到层析住出口，然后停止减压，常压下继续用由乙酸乙酯和石油醚按体积比为1: 9~3: 7组成的洗脱液洗去雷公藤甲素前的部位，再用由乙酸乙酯和石油醚体按积比为2: 8~5: 5组成的洗脱液洗脱，定量收集流出液。流出液用雷公藤甲素标样进行跟踪分析，合并相同组分，重结晶后得到雷公藤甲素。
【文档编号】C07J73/00GK103524591SQ201210230388
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月5日 优先权日:2012年7月5日
【发明者】韦万兴, 肖世基, 刘力恒 申请人:广西大学