蛋白质固定膜及制作方法、固定蛋白质的方法
【专利摘要】本发明提供一种蛋白质固定膜及其制作方法以及固定蛋白质的方法，所述蛋白质固定膜，用于非生物材料与蛋白质的连接，包括固定在所述非生物材料表面的金膜以及巯基自组装分子膜，所述巯基自组装分子膜固定在所述金膜的表面。该蛋白质固定膜具有较高的活性以及固定效率高，蛋白质的固定数量为50～100/匹克。此外，巯基自组装分子膜致密度高，可以长时间的保持，保持时间在1年以上。
【专利说明】蛋白质固定膜及制作方法、固定蛋白质的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种用于在磁电阻生物传感器上固定蛋白质的蛋白质固定膜、该蛋白质固定膜的制作方法以及在生物传感器上固定蛋白质的方法。
【背景技术】
[0002]随着科技的不断进步，在医学、环境保护以及军事等领域需要对生物分子进行探测，如，在临床医学上用于疾病的诊断，在农业上用于农产品病源微生物检测，在微生物领域用于生物毒剂的快速检测等等。目前对生物分子的探测常采用酶电极法、酶联免疫吸附法(ELISA)等。
[0003]酶电极法是采用氧电极作为换能器，以葡萄糖氧化酶为活性材料，这种检测方法容易受溶解氧含量的变化、高温、电压波动等的影响，因此检测的稳定性不高；而且，所采用的酶电极的尺寸较大，通常在IOcm以上，因此，这种检测方法无法向微型化发展。
[0004]酶联免疫吸附法是采用酶标板作为固定抗体的材料，以双抗体夹心法抓获抗原物质，并以酶标仪检测吸光度作为检测结果。虽然这种方法所需的抗体数量较少，检测的稳定性以及灵敏度有所提高，但这种方法依赖于庞大、精密的光学系统，因此限制了其应用范围。
[0005]为此，研究人员开发了生物传感器来检测生物分子，磁标记磁电阻(MR)生物传感器即是一种较为先进的生物传感器，其具有灵敏度高、特异性好等优点，而且可以向微型化发展，因此磁标记磁电阻生 物传感器具有广泛地应用前景。
[0006]磁标记磁电阻生物传感器是通过纳米磁球来标记抗原分子，通过磁电阻传感器来探测磁球产生的磁场，从而探测抗原分子的一种新技术。具体地，请参阅图1，磁标记磁电阻生物传感器包括磁电阻阵列1、蛋白质固定膜(生物接口层)2、一抗3、抗原分子4、二抗5以及磁珠6，其中，磁电阻阵列I的表面制作有铬层和金膜(图中未示出)，蛋白质固定膜2固定在磁电阻阵列I的表面，一抗3固定在蛋白质固定膜2上；二抗5和磁珠6结合在一起形成免疫磁珠；抗原分子4位于一抗3和免疫磁珠之间，并连接一抗3和免疫磁珠,一抗
3、抗原分子4以及免疫磁珠结合在一起,形成夹心结构；磁珠6产生的磁场可以改变磁电阻阵列的电阻，从而可以探测到抗原分子的存在。
[0007]尽管研究人员提出了上述结构的磁标记磁电阻生物传感器，但是，由于此项技术的研究处于起步阶段，因此目前所采用的蛋白质固定膜的活性较低，固定效率低，即每个蛋白质固定膜分子可固定的蛋白质较少，而且保持时间短，一般仅为I~3个月。
【发明内容】
[0008]针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种蛋白质固定膜及其制作方法，其活性较高、固定效率高，而且保持时间长。
[0009]另外，本发明还提供一种固定蛋白质的方法，该方法可以在非生物材料表面固定更多的蛋白质，而且蛋白质的活性高。[0010]本发明提供的一种蛋白质固定膜，用于非生物材料与蛋白质的连接，包括固定在所述非生物材料表面的金膜，还包括巯基自组装分子膜，所述巯基自组装分子膜固定在所述金膜的表面。
[0011]优选地，所述巯基自组装分子膜为碳链长度均为2~20的两种有机分子的混合膜，所述两种有机分子分别为一端含有巯基，另一端含有羧基的官能团，以及一端含有巯基，另一端含有羟基的官能团，所述巯基与所述金膜连接，所述羧基和所述羟基露出。
[0012]优选地，所述金膜的厚度为10~80nm。
[0013]优选地，在所述金膜与所述非生物材料之间还包括铬层，所述铬层的厚度为5~20nmo
[0014]本发明还提供一种蛋白质固定膜的制作方法，包括以下步骤:
[0015]提供表面制作有金膜的基底；
[0016]清洗所述表面制作有金膜的基底的表面；
[0017]将所述表面制作有金膜的基底放入巯基化合物溶液中以使所述巯基化合物固定在所述金膜表面，从而在所述金膜的表面形成巯基自组装分子膜。
[0018]优选地，所述巯基化合物溶液为包含两种巯基化合物的酒精溶液，所述两种巯基化合物的碳链长度为2~20，其中，一种所述巯基化合物溶液包含有巯基和羧基；另一种所述巯基化合物溶液包含有巯基和羟基。
[0019]优选地，在所述巯基化合物溶液中所述两种巯基化合物的浓度均为0.1~10豪摩尔/升，所述两种巯基化合物的比例为1:1。
[0020]优选地，所述两种巯基化合物为巯基乙酸和巯基乙醇，或巯基11酸和巯基11醇，或疏基16酸和疏基11醇。
[0021]优选地，所述巯基化合物溶液的温度为40~100°C，所述表面制作有金膜的基底在所述巯基化合物溶液中放置I~5小时。
[0022]优选地，在所述金膜的表面形成巯基自组装分子膜后，还包括清洗所述表面制作有金膜的基底，具体包括以下步骤:
[0023]将所述基底放入酒精溶液清洗3~6min ；
[0024]在含有10~30 (体积分数)％乙酸的酒精溶液中清洗3~6min ；
[0025]再次利用酒精溶液清洗3~6min。
[0026]另外，本发明还提供一种固定蛋白质的方法，用于在非生物材料制作的基底表面固定蛋白质，包括以下步骤:
[0027]在所述基底表面制作金膜；
[0028]在所述金膜的表面制作本发明所提供的所述蛋白质固定膜；
[0029]借助所述蛋白质固定膜将蛋白质固定在所述金膜的表面。
[0030]优选地，借助所述蛋白质固定膜将蛋白质固定在所述金膜的表面，包括以下步骤:
[0031]通过含有活化剂的乙磺酸溶液使固定在所述基底表面的所述蛋白质固定膜活化；
[0032]用磷酸盐溶液洗涤所述基底3次以上；
[0033]将所述基底放入蛋白质溶液中，使所述蛋白质固定膜与所述蛋白质溶液中的蛋白质发生共价反应，从而将所述蛋白质固定在所述基底表面。
[0034]优选地,所述蛋白质溶液的浓度为0.01~lmg/ml,所述蛋白质溶液的温度为4~40°C，反应时间为0.5~2小时。
[0035]优选地，所述含有活化剂的乙磺酸溶液的浓度为0.5~10mg/ml，所述活化过程是在室温下避光反应10分钟~I小时。
[0036]优选地，所述活化剂为3-乙基碳化二亚胺。
[0037]优选地，借助所述蛋白质固定膜将蛋白质固定在所述金膜的表面后，还包括:将固定蛋白质的所述基底在4~40°C的封闭液中放置10分钟~I小时，所述封闭液为含5(体积分数)％牛血清白蛋白的0.01~0.2摩尔/升的盐酸盐缓冲液，PH = 7.0~7.6。
[0038]本发明具有下述有益效果:
[0039]本发明提供的蛋白质固定膜为包含巯基自组装分子膜的金膜，巯基自组装分子膜具有较高的活性，更易与蛋白质连接，而且巯基自组装分子膜的固定效率高，蛋白质的固定数量为50~100/匹克。 此外，巯基自组装分子膜致密度高，可以长时间的保持，可在4°C的温度下保持时间在I年以上。
[0040]另外，本发明提供的蛋白质固定膜的制作方法是通过巯基化合物溶液而使金与巯基连接，从而在金层表面形成致密的巯基自组装分子膜。通过该方法制作的巯基自组装分子膜具有较高的活性，更易与蛋白质连接，而且巯基自组装分子膜的固定效率高，蛋白质的固定数量为50~100/匹克。此外，巯基自组装分子膜致密度高，可以长时间的保持，保持时间在I年以上。
[0041]此外，本发明提供的固定蛋白质的方法是通过本发明提供的蛋白质固定膜使蛋白质固定在非生物材料表面，因此非生物材料表面的蛋白质数量较多，而且蛋白质的活性高。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为磁标记磁电阻生物传感器的结构示意图；
[0043]图2为本发明提供的蛋白质固定膜的结构示意图；
[0044]图3为本发明提供的在生物传感器上制作蛋白质固定膜的方法的流程图；以及
[0045]图4为本发明提供的固定蛋白质的方法的流程图。
【具体实施方式】
[0046]为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明提供的蛋白质固定膜及其制作方法以及固定蛋白质的方法进行详细描述。
[0047]本发明提供的蛋白质固定膜是用于在非生物材料表面固定蛋白质的固定膜，非生物材料既可以是非金属材料，如硅片，也可以是金属材料。
[0048]本实施例蛋白质固定膜是用于在包含有磁电阻阵列的传感器基底制作蛋白质固定膜。如图2所示，该蛋白质固定膜包括固定在传感器基底表面的金膜以及巯基自组装分子膜，巯基自组装分子膜固定在金膜的表面。
[0049]所述巯基自组装分子膜为碳链长度均为2~20的两种有机分子的混合膜，其中，一种有机分子的一端含有巯基(-SH),另一端含有羧基(-COOH)的官能团；另一种有机分子的一端含有巯基(-SH)，另一端含有羟基(-0H)的官能团。所述巯基与金膜连接，从而形成表面致密的巯基自组装分子膜。羧基和羟基露出，而且羧基可以与蛋白质分子中的氨基发生共价反应；羟基可以增强巯基自组装分子膜的致密度。
[0050]在所述金膜与所述传感器基底之间还设有铬层，所述铬层的厚度为5~20nm，优选8~15nm ;金膜的厚度为10~80nm,优选20~70nm,更优选25~60nm。
[0051]本实施例提供的蛋白质固定膜为包含巯基自组装分子膜的金膜，巯基自组装分子膜具有较高的活性，更易与蛋白质连接，而且巯基自组装分子膜的固定效率高，蛋白质的固定数量为50~100/匹克。此外，巯基自组装分子膜致密度高，可以长时间的保持，可在4°C的温度下保持时间在I年以上。另外，包含巯基自组装分子膜的金膜不影响制作在其表面的蛋白质活性，从而可以保证蛋白质与其它蛋白质发生反应。
[0052]图3为本发明提供的蛋白质固定膜的制作方法。本实施例蛋白质固定膜是固定在生物传感器的表面，该生物传感器包括传感器基底，在传感器基底内设有磁电阻阵列。请参阅图3，蛋白质固定膜的制作方法包括以下步骤:
[0053]步骤slO，提供表面制作有金膜的生物传感器。
[0054]本步骤是提供生物传感器，在生物传感器的表面设有铬层，铬层的厚度为5~20nm,优选8~15nm ;在铬层的表面设有金膜，金膜的厚度为10~80nm,优选20~70nm,更优选25~60nm。本实施例所采用的生物传感器的表面积为0.01~IOmm2,这里所指的表面积为需要制作蛋白质固定膜的表面积。
[0055]步骤s20，清洗所述表面制作有金膜的传感器。
[0056]本步骤是利用去离子水清洗传感器的表面，以将金膜表面以及传感器其它表面的灰尘、油污等污染物去除。
[0057]步骤s30，将所述表面制作有金膜的传感器放入巯基化合物溶液中以使所述巯基化合物固定在所述金膜表面，从而在所述金膜的表面形成巯基自组装分子膜。
[0058]所述巯基化合物溶液为包含两种巯基化合物的酒精溶液，两种巯基化合物的浓度均为0.1~10豪摩尔/升，两种巯基化合物的比例为1:1。巯基化合物溶液的温度为40~100°C，所述表面制作有金膜的基底在所述巯基化合物溶液中放置I~5小时。从而使巯基与金膜连接，从而形成表面致密的巯基自组装分子膜。羧基和羟基露出，而且羧基可以与蛋白质分子中的氨基发生共价反应；羟基可以增强巯基自组装分子膜的致密度。
[0059]本实施例两种巯基化合物的碳链长度均为2~20，而且，一种所述巯基化合物溶液包含有疏基和竣基；另一种所述疏基化合物溶液包含有疏基和羟基。两种疏基化合物可以为疏基乙酸和疏基乙醇，或疏基11酸和疏基11醇，或疏基16酸和疏基11醇。
[0060]步骤s40，清洗制作有巯基自组装分子膜的传感器。
[0061]将所述基底放入酒精溶液清洗3~6min ;在含有10~30 (体积分数)%乙酸的酒精溶液中清洗3~6min ;再次利用酒精溶液清洗3~6min。
[0062]本发明提供的蛋白质固定膜的制作方法是通过巯基化合物溶液而使金与巯基连接，从而在金层表面形成致密的巯基自组装分子膜。通过该方法制作的巯基自组装分子膜具有较高的活性，更易与蛋白质连接，而且巯基自组装分子膜的固定效率高，蛋白质的固定数量为50~100/匹克。此外，巯基自组装分子膜致密度高，可以长时间的保持，保持时间在I年以上。
[0063]本实施例还提供一种固定蛋白质的方法，如图4所示，包括以下步骤:[0064]步骤SlOO，在所述传感器表面制作金膜。
[0065]在传感器表面的金膜可以采用溅射或其它现有的技术制作。
[0066]步骤S200，在所述金膜的表面制作蛋白质固定膜。
[0067]蛋白质固定膜采用本发明提供的蛋白质固定膜的结构及组成，以及制作蛋白质固定膜的方法与本发明提供的蛋白质固定膜的制作方法相同，因此，这里不再赘述。
[0068]步骤S300，借助所述蛋白质固定膜将蛋白质固定在所述金膜的表面。本实施例蛋白质可以是肌红蛋白质或其它种类的蛋白质。
[0069]步骤s301，通过含有活化剂的乙磺酸(MES)溶液使固定在所述传感器表面的所述蛋白质固定膜活化。
[0070]所述含有活化剂的乙磺酸溶液的浓度为0.5~10mg/ml,优选0.6~8mg/ml,所述活化过程是在室温下避光反应10分钟~I小时，优选20~50分钟。
[0071]本实施例活化剂可以是3-乙基碳化二亚胺，也可以是其它能够使蛋白质固定膜活化的物质。
[0072]步骤s302，用磷酸盐(PBS)溶液洗涤所述传感器3次以上，如洗涤3~5次。
[0073]步骤S303，将所述传感器放入蛋白质溶液中，使所述蛋白质固定膜与所述蛋白质溶液中的蛋白质发生共价反应，即羧基与肌红蛋白中的氨基发生反应，从而将所述蛋白质固定在所述传感器的表面。
[0074]所述蛋白质溶液的浓度为0.01~lmg/ml,优选0.1~0.8mg/ml,所述蛋白质溶液的温度为4~40°C，反应时间`为0.5~2小时，优选反应0.8~1.5小时。
[0075]步骤s400，将固定蛋白质的所述传感器在4~40°C的封闭液中放置10分钟~I小时，所述封闭液为含5 (体积分数)%牛血清白蛋白的0.01~0.2M盐酸盐缓冲液，PH =
7.0 ~7.6。
[0076]步骤s500，用洗涤液清洗传感器6次以上。
[0077]所述洗涤液包括盐酸盐缓冲液、NaCl缓冲液以及有机分子(Tween-20)，其中，盐酸盐缓冲液为0.01~0.2M(摩尔/升)，PH = 7.0~7.6，NaCl缓冲液为0.15M，有机分子的0.01~0.5(质量分数)％。
[0078]本发明提供的固定蛋白质的方法是通过本发明提供的蛋白质固定膜使蛋白质固定在非生物材料表面，因此非生物材料表面的蛋白质数量较多，而且蛋白质的活性高。
[0079]可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种蛋白质固定膜，用于非生物材料与蛋白质的连接，包括固定在所述非生物材料表面的金膜，其特征在于，还包括巯基自组装分子膜，所述巯基自组装分子膜固定在所述金膜的表面。
2.根据权利要求1所述的蛋白质固定膜，其特征在于，所述巯基自组装分子膜为碳链长度均为2~20的两种有机分子的混合膜，所述两种有机分子分别为一端含有巯基，另一端含有羧基的官能团，以及一端含有巯基，另一端含有羟基的官能团，所述巯基与所述金膜连接，所述羧基和所述羟基露出。
3.根据权利要求1所述的蛋白质固定膜，其特征在于，所述金膜的厚度为10~80nm。
4.根据权利要求1所述的蛋白质固定膜，其特征在于，在所述金膜与所述非生物材料之间还包括铬层，所述铬层的厚度为5~20nm。
5.一种蛋白质固定膜的制作方法，其特征在于，包括以下步骤: 提供表面制作有金膜的基底； 清洗所述表面制作有金膜的基底的表面； 将所述表面制作有金膜的基底放入巯基化合物溶液中以使所述巯基化合物固定在所述金膜表面，从而在所述金膜的表面形成巯基自组装分子膜。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述巯基化合物溶液为包含两种巯基化合物的酒精溶液，所述两种巯基化合物的碳链长度为2~20，其中，一种所述巯基化合物溶液包含有疏基和竣基；另一种所述疏基化合物溶液包含有疏基和羟基。
7.根据权利要求6所`述的方法，其特征在于，在所述巯基化合物溶液中所述两种巯基化合物的浓度均为0.1~10豪摩尔/升，所述两种巯基化合物的比例为1:1。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述两种巯基化合物为巯基乙酸和巯基乙醇，或巯基11酸和巯基11醇，或巯基16酸和巯基11醇。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述巯基化合物溶液的温度为40~100°c，所述表面制作有金膜的基底在所述巯基化合物溶液中放置I~5小时。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述金膜的表面形成巯基自组装分子膜后，还包括清洗所述表面制作有金膜的基底，具体包括以下步骤: 将所述基底放入酒精溶液清洗3~6min ； 在含有10~30 (体积分数)％乙酸的酒精溶液中清洗3~6min ； 再次利用酒精溶液清洗3~6min。
11.一种固定蛋白质的方法，用于在非生物材料制作的基底表面固定蛋白质，其特征在于，包括以下步骤: 在所述基底表面制作金膜； 在所述金膜的表面制作权利要求1-4任意一项所述蛋白质固定膜； 借助所述蛋白质固定膜将蛋白质固定在所述金膜的表面。
12.根据权利要求11所述固定蛋白质的方法，其特征在于，借助所述蛋白质固定膜将蛋白质固定在所述金膜的表面，包括以下步骤: 通过含有活化剂的乙磺酸溶液使固定在所述基底表面的所述蛋白质固定膜活化； 用磷酸盐溶液洗涤所述基底3次以上； 将所述基底放入蛋白质溶液中，使所述蛋白质固定膜与所述蛋白质溶液中的蛋白质发生共价反应，从而将所述蛋白质固定在所述基底表面。
13.根据权利要求12所述固定蛋白质的方法，其特征在于，所述蛋白质溶液的浓度为0.01~lmg/ml，所述蛋白质溶液的温度为4~40°C，反应时间为0.5~2小时。
14.根据权利要求12所述固定蛋白质的方法，其特征在于，所述含有活化剂的乙磺酸溶液的浓度为0.5~10mg/ml，所述活化过程是在室温下避光反应10分钟~I小时。
15.根据权利要求12所述固定蛋白质的方法，其特征在于，所述活化剂为3-乙基碳化二亚胺。
16.根据权利要求12所述固定蛋白质的方法，其特征在于，借助所述蛋白质固定膜将蛋白质固定在所述金膜的表面后，还包括: 将固定蛋白质的所述基底在4~40°C的封闭液中放置10分钟~I小时，所述封闭液为含5 (体积分数)％牛血清白蛋白的0.01~0.2摩尔/升的盐酸盐缓冲液，PH = 7.0~7.6。
【文档编号】C07K17/14GK103524622SQ201210232307
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2012年7月6日
【发明者】曲炳郡, 谢立, 雷博 申请人:曲炳郡