专利名称：一种IgE特异性结合多肽及其医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因及其医药用途，具体地说是利用噬菌体展示文库技术筛选出的能与IgE蛋白具有特异性结合能力的多肽及其医药用途。
背景技术：
过敏性疾病在全世界范围内呈逐年增加的趋势，已经成为全球性的公共卫生问题，严重影响人们的生活质量。过敏性疾病患病率已达到某种流行病的程度，在近30年间至少增加了 3倍，预计在今后的20年内，工业化国家50%的人口将染上过敏症。世界卫生组织把过敏性疾病列为“21世纪重点研究和预防的疾病”，并将每年的7月8日列为“世界过敏性疾病日”，以更广泛地普及过敏性疾病的知识。因此，对过敏性疾病的防治已经成为了刻不容缓的重任。目前，临床治疗常用的治疗方法主要为脱敏治疗和相应的生物活性介质拮抗治疗，抗炎和缓解症状是其主要目的，仍缺乏有效的治疗方法。免疫球蛋白E(以下简称IgE)在过敏反应中的关键作用已得到公认，阻止IgE与效应细胞表面高亲和力受体Fe ε RI结合，己经成为抗过敏反应的研究热点。目前，已有文献证实IgE分子重链区C ε 3-C ε 4是与其高亲和力受体Fe ε RI作用的关键区域。近年来，研究人员根据变态反应性疾病发病机制，以C ε 3-C ε 4为靶标设计了多种药物用于抑制IgE介导的I型变态反应(如已上市的Omalizumab (商品名Xolair)等抗IgE抗体、模拟肽以及IgE疫苗等药物)。这些药物上市后，在临床使用中取得了较好的疗效。但目前这类药物品种较少，且其存在价格昂贵、治疗效果个体差异较大、用药时间长、治疗效果不持久等诸多问题。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种IgE特异性结合多肽及其医药用途，以期为临床在预防、治疗、诊断过敏性疾病中提供一种新的用药选择。本发明所提供的一种IgE特异性结合多肽为多肽P20，该多肽含有12个氨基酸残基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。具体为
多肽P20的核苷酸序列为TTGCCTGGTAGGGCGCATGATCCTTGGAA G GTGCCT，其氨基酸序列(N 端一C)为 LPGRAHDPWKVP。本发明在NEB公司噬菌体肽库试剂盒基础上改良了筛选方法，即以C ε 3-C ε 4蛋白为靶蛋白，采用固相筛选法，筛选获得多条C ε 3-C ε 4蛋白高亲和力结合肽(包括多肽Ρ20)。后经竞争性ELISA验证，所获多肽Ρ20可在体外与IgE抗体竞争性结合C ε 3_C ε 4蛋白，体外实验表明该多肽可阻止IgE分子与效应细胞表面高亲和力受体Fe ε RI结合，从而有效抑制了 IgE介导的I型变态反应的发生。以本发明所提供的多肽Ρ20为活性成分，采用药物制剂中的常规技术制备成各种药物制剂，由此实现了本发明在制备治疗和预防IgE介导的过敏性疾病药物中的应用。将本发明所提供的多肽Ρ20用放射性物质、地高辛、荧光标记物、生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等物质进行标记，由此制备成诊断试剂盒，用于检测人体血液中的IgE，由此实现了本发明在制备诊断过敏性疾病试剂盒中的应用。再则，由于本发明多肽P20具有与IgE蛋白特异性结合的能力，其与磁珠、树脂等固相载体相连，或与IgG Fe区、His、GST等蛋白结合，采用亲和层析方法纯化IgE，故其可用于IgE分子的纯化。本发明所提供的多肽P20通常可制备非口服药物剂型时，以本多肽P20为活性成分，按照常规技术制备成喷雾剂、注射液、输液剂等非口服剂型。本发明所提供的多肽P20制备成药物制剂后，给药量可因药物剂型以及给药对象的症状、年龄、体重、性别、治疗时间、治疗效果、给药方法不同而各有不同。药物给药量可以根据只要可以抑制变态反应且产生的副作用在可允许的范围内就无特别限制。含有多肽P20活性成分的药物制剂，可与人体IgE结合，有效阻断过敏反应进程，对免疫球蛋白E (IgE)介导的过敏性疾病有积极的预防和治疗作用。如可用于预防和治疗·过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重过敏反应等疾病。本领域技术人员通常知晓，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。因此，将本发明所提供的多肽P20进行一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或插入得到衍生肽，均属于本发明范畴。如置换和/或缺失和/或插入甘氨酸(G)，丙氨酸(A)，氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)，甲硫氨酸(M)，半胱氨酸(C)，精氨酸(R)，酪氨酸(K)，组氨酸(H)，天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，天冬酞胺(N)，谷氨酸胺(Q))中的一个或几个氨基酸残基得到的衍生肽。上述变异形式还包括上述多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以使氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的化学衍生形式如乙酞化、羧基化、糖基化及磷酸化氨基酸残基的序列。本发明所提供的多肽Ρ20易于制备，且纯化简便，能够用于规模化、工业化生产。
图I带His标签的C ε 3-C ε 4蛋白原核表达及纯化结果。其中M :蛋白 marker ;1 : IPTG 未诱导 pET_17b/BL21 的全菌；2 :IPTG 诱导的pET17b /BL21 的全菌；3 =IPTG 未诱导 pET17b_C ε 3-C ε 4/BL21 的全菌；4 =IPTG 诱导PET17b-C ε 3-C ε 4/BL21 的全菌；5 :IPTG 诱导 pET17b- C ε 3-C ε 4/BL21 的全菌破碎后上清；6 =IPTG诱导pET17b_C ε 3-C ε 4/BL21的全菌破碎后沉淀；7 :纯化后C ε 3-C ε 4蛋白。图2带His标签的C ε 3-C ε 4蛋白Western Blot鉴定结果。其中M :低分子量蛋白marker ; I :抗人IgE抗体；2 :抗His抗体。图3多肽P20与Ce3_Ce4蛋白亲和力鉴定。图4多肽P20的质谱鉴定图谱图5多肽P20的高效液相色谱鉴定图谱
图6 ELISA竞争抑制试验鉴定多肽P20与C ε 3-C ε 4蛋白的结合。图7体外检测多肽Ρ20抑制IgE与其受体Fe ε RI的结合。
具体实施例方式对实施方式以及实施例没有特别说明时，本发明的实施将采用分了生物学常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。实施例I多肽Ρ20的获得
(I)人IgE Ce3_Ce4蛋白的重组表达
文献证实,人IgE抗体中与高亲和力受体以及低亲和力受体结合的位点主要位于C ε 3结构域和C ε 4结构域，C ε 2结构域对于结合常数及热力学参数等没有明显影响。因此，本发明根据所选用载体pET_17b (从Novagen公司购得)及C ε 3_C ε 4基因序列设计引物序列，h.游引物5’ -GCATATGGATTCCAACCCGAGAGGGGTGA GCG CCTACC TAAGC-3’，下游引物5，-CCGGMTTCTTA r.TGGTGGTGGT GGTGGTG TTTACCGGGATTTACAG-3 ’，上下游引物中下划线处为Nde I和EcoR I的酶切位点，双下划线为6个His的基因。利用RT-PCR技术从过敏反应疾病患者外周血淋巴细胞中克隆出人C ε 3-C ε 4基因，构建原核表达载体pET_17b_C ε 3-C ε 4 中，并转化大肠杆菌 E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen),进行诱导表达。 菌体经裂解、2M尿素洗涤后，用8 mo I /L尿素溶解包涵体，经Ni-NAT柱对变性目的蛋白进行纯化，并利用降低尿素梯度的方法对纯化的蛋白进行了复性，其结果如图I所示(图中M :蛋白 marker ；1 IPTG未诱导pET_17b/BL21 的全菌；2 :IPTG诱导的 pET_17b /BL21 的全菌；3 :IPTG未诱导pET17b_C ε 3-C ε 4/BL21 的全菌；4 :IPTG诱导PET17b_ C ε 3-C ε 4/BL21的全菌；5 :IPTG诱导pET17b- C ε 3-C ε 4/BL21的全菌破碎后上清；6 :IPTG诱导pET17b_C ε 3-C ε 4/BL21的全菌破碎后沉淀；7 :纯化后C ε 3-C ε 4蛋白)，转化pET_17b_C ε 3-C ε 4载体大肠杆菌经IPTG诱导后在30kD附近处有一条过量表达蛋白带，与目的蛋白预期值相符。转化pET_17b载体大肠杆菌未发现目的蛋白表达，表明Fe ε 3_4基因在宿主细胞中得到表达且表达产物主要以包涵体形式存在。利用表达蛋白带有6个His标签，经镍柱亲合层析后获得了高纯度的重组C ε 3-C ε 4蛋白。用Western Blotting方法(具体过程参照《分子克隆实验指南(第3版)》)检测重组蛋白的特异性和敏感性。结果如图2所示，重组C ε 3-C ε 4蛋白可与抗人IgE抗体特异性反应。(2)筛选与C ε 3-C ε 4蛋白具有亲和力的噬菌体
购买 New England Biolabs 公司 Ph. D. _12 Phage Display Peptide Library Kit,滴度为 I. 0X1013pfu/ml，随机多样性为 2. 7X109。用 O. I mo I/L 的 NaHCO3 (pH8. 6)溶液稀释C ε 3-C ε 4蛋白至100 μ g/ml，每微孔150 μ I上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润。将平板放在增湿容器中4°C轻微震荡，孵育过夜。倒掉包被液，除去残余溶液。每孔加满封闭液，4°C作用I. 5h。倒掉封闭液，用TBST(TBS+0. l%[v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次，每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液。用100 μ I的TBST缓冲液稀释4Χ 101°的噬菌体(即10 μ I的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动60min。倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。TBST缓冲液洗板15次。用游离靶分子溶液100 μ g/ml溶于TBS中，从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动60min，收集洗脱液，取5μ I进行噬菌体滴度测定，剩余的扩增、纯化后重复上述步骤，进行下一轮筛选。( 3 ) C ε 3-C ε 4蛋白高亲和力噬菌体鉴定
用浓度为100 μ g/ml的上述重组C ε 3-C ε 4蛋白(溶于O. IM的NaHCO3, ρΗ8. 6)包被酶联板，100 μ I/孔，将带有His标签的IL-Ira (白细胞介素I受体拮抗剂)作为阴性对照，同时设置空白对照。4°C密封湿盒中过夜。倒掉包被液，用TBST洗6次，每次间隔3min，每次均将酶联板倒置在纸巾上拍甩除去残液。各孔加满封闭液，4°C湿盒内封闭2h。倒掉包被液，TBST洗涤，方法同上。从第4轮筛选的平皿上随机挑取50个单克隆蓝斑，扩增、纯化后，用TBST稀释为1Χ107ρ \ι/μ 1，向每个样品的阴性对照孔和靶分子包被孔中均加样100μ I。室温振荡孵育2h。倒掉溶液，TBST洗涤，方法同上。用封闭液按I :5000的比例稀释HRP标记的抗-M13单克隆抗体。每孔加入100 μ I稀释后的抗体，室温振荡孵育lh。倒掉溶液，TBST洗涤，方法同上。每孔加IOOyl TMB底物溶液，室温避光作用30min左右。每孔加50 μ I 2mol/L的硫酸溶液终止显色反应。测OD45tl,以OD45tl值高于阴性对照3. O倍以 上者定为阳性克隆。结果如图3所示，50个克隆中有19个单克隆呈现阳性反应，其中P7、P13、P20、P22、P24、P28、P29、P37、P43 的 OD45tl 平均值均在 I. 50 以上，P4、P6、P9、P10、P16、P26、P34、P40.P47.P50的OD450平均值均在I. 07-1. 50之间。空白对照的OD450的平均值为O. 195，阴性对照的OD45tl平均值为O. 355。而其他31个单克隆噬菌体OD45tl平均值低于I. 07未在图中表示出来。由此表明含多肽P20噬菌体克隆可与C ε 3-C ε 4蛋白特异性结合。(4)多肽Ρ20序列测定
将得到的19个与C ε 3-C ε 4蛋白具有结合特性的噬菌体分别放置于含有2mlE. coli2537 (New England Biolabs)菌液的试管中，37°C振荡培养5h，进行单克隆扩增。取出单克隆扩增液，室温离心5min，将500 μ 含噬菌体上清转入一新鲜离心管，加入200 μ I溶于2. 5mol/L NaCl (20% PEG)，颠倒离心管数次混匀温和振荡，室温下放置lSmirufC离心5min,弃上清液，回收噬菌体颗粒沉淀。加入100 μ I TE液(pH 8. 0)振荡重悬浮噬菌体颗粒沉淀(TE液室温浸泡沉淀30min)，加入100 μ I平衡酹，振荡充分混合，室温放置lmin，再振荡。离心3-5min，将上层水相转移至另一个微量离心管中，加入300 μ I无水乙醇与0. 3mmol乙酸钠的混合物(两者之比为25:1)，短暂振荡后室温放置30min。4°C离心lOmin，弃上清，回收单链噬菌体DNA。40 μ I TE (pH 8. 0)溶解DNA，-20°C保存，备用。将噬菌体单链DNA送生工生物工程(上海)有限公司采用双脱氧终止法测序。测序引物(_96g III sequencingprimer):5，-h°CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。对测序结果进行比对分析，DNAstar翻译后获得11条不同序列多肽，其中包含多肽P20序列(SEQ ID NO. 2)。对筛选得到的多肽P20序列进行文献检索和和分析，未发现与已知序列完全相同的序列；NCBI GeneBank Blast搜索，也未发现与其他生物体存在同源序列。(5 )多肽P20的合成及鉴定
由生工生物工程(上海)有限公司利用Fomc固相合成法合成多肽P20，经北京创新通恒LC 3000制备型液相色谱仪纯化多肽，利用岛津公司的LC IOAvp高效液相色谱仪和Waters公司的ZQ-2000质谱仪进行鉴定。其质谱鉴定图谱见图4，液相色谱图见图5。
实施例2 ELISA竞争抑制试验，鉴定多肽P20与Ce 3-Ce 4蛋白的结合性能 用浓度为100 μ g/ml的C ε 3-C ε 4蛋白(溶于O. IM的NaHCO3, pH8. 6)包被酶联板，
100 μ I/孔，4°C密封湿盒中过夜。甩去包被液后各孔加满封闭液，4°C湿盒内封闭l_2h。根据实施例I中单克隆滴度测定结果，分别将亲和力较高的11种单克隆样品用TBST稀释为I X IO8Pfu/ μ I，加入到包被蛋白的孔内，50 μ I/孔，然后再加入用TBS稀释的鼠抗人IgE抗体，50 μ I/孔。阴性对照孔为50 μ I/孔噬菌体+50 μ I/孔TBS ;空白对照孔为100 μ I/孔TBS0 37°C孵育lh，用封闭液按I :5000的比例稀释HRP标记的抗-M13单克隆抗体，室温振荡孵育lh。用TBST洗涤，并倒置酶联板在纸巾上拍甩除去残液。每孔加100 μ I TMB底物溶液，室温避光作用30min左右，进行显色。每孔加50μ1 2mol/L的硫酸溶液终止显色反应。测OD450值，按照下式计算抑制率。抑制率=(未抑制OD值-抑制后OD值)/未抑制OD值 X 100%ο
结果如图6所示，多肽P20能与抗人IgE抗体竞争结合C ε 3_C ε 4蛋白，其抑制率34. 8%。结果证明多肽Ρ20与C ε 3-C ε 4蛋白具有很强的结合能力。实施列3多肽Ρ20抑制IgE与其受体Fe ε RI α结合的体外检测
选择稳定表达人Fe ε RI α的RBL-2H3细胞株为验证细胞，将对数生长期RBL-2H3细胞，用O. 25%胰蛋白酶消化，7Χ103 r/min、30s收集细胞，尽弃上清；PBSS洗涤，计数，调整细胞密度至IX 105/ml ;加入人骨髓瘤IgE至终浓度为50ng/ml，分别加入多肽P20至以下浓度，O μ g/ml、10 μ g/ml>20 μ g/ml>40 μ g/ml>80 μ g/ml、100 μ g/ml,冰上孵育 30min,同时，设置PBSS孵育细胞作为阴性对照；离心，弃上清，PBSS洗涤；加入FITC标记的抗IgE抗体，冰上避光反应45分钟；离心弃上清，洗涤2次，弃尽洗液，300 μ I/样品1%多聚甲醛重悬，流式细胞仪检测细胞荧光率。结果如图7所示，随着加入多肽Ρ20浓度的增加，细胞荧光率逐渐减少，表明多肽Ρ20可与IgE特异结合，抑制IgE与细胞表面Fe ε RI结合。实施例4多肽Ρ20冻干制剂
预处理称取多肽Ρ20 20g，加入聚山梨酯80适量，混匀，加水溶解，加入1600ml注射用水中，调节pH值为6. 5，加注射用水至2000ml，加入O. 01% (g/ml)活性炭，在室温下，搅拌30分钟，脱去活性碳后，用0.22 μ m微孔滤膜过滤，灌装成IOml/支。压半塞。预冻把分装好的药品放入冻干箱内隔板上，_40°C时，预冻5小时。升华干燥抽真空，使真空度低于20Pa，通过隔板下的加热系统缓缓加热，
从_40°C缓慢升温至O°C，升华干燥时间为18小时。再干燥快速升温至30°C，并保持温度7小时。充氮冻干结束后，向冻干室内冲氣气后包装成成品。实施例5 IgE介导过敏病诊断试剂盒
利用多肽P20与IgE特异性结合，按照现有技术中的常规制备方法，制备成诊断试剂盒，用于检测人体血液中的IgE。
权利要求
1.一种IgE特异性结合多肽P20，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根据权利要求I所述多肽P20，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.根据权利要求I或2所述多肽P20在制备治疗和预防IgE介导的过敏性疾病药物中的应用。
4.根据权利要求I或2所述多肽P20在制备诊断过敏性疾病试剂盒中的应用。
5.根据权利要求I或2所述多肽P20在IgE纯化中的应用。
6.权利要求I或2所述多肽P20进行一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或插入，得到的衍生肽以及以多肽P20为基础获得的衍生物。
全文摘要
本发明公开了一种IgE特异性结合多肽以其医药用途，该多肽含有12个氨基酸残基，其核苷酸序列如SEQIDNO.1，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有多肽P20活性成分的药物制剂，可与人体IgE结合，有效阻断过敏反应进程，对免疫球蛋白E(IgE)介导的过敏性疾病有积极的预防和治疗作用。如可用于预防和治疗过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重过敏反应等疾病。
文档编号C07K1/20GK102875656SQ20121038966
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者刘中成, 张艳芬, 时海浪, 赵丽君 申请人:河北大学