专利名称：一种c-反应蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种C 一反应蛋白及其制备和应用。
背景技术：
C 一反应蛋白(C-reactive protein)是穿透素(pentraxin)家族的一个成员。 C 一反应蛋白是由肝脏产生，在人类中它是一个经典的急性期反应蛋白，在炎症反应等急性条件下其浓度在血清中可升高上千倍，因此在临床上被用作疾病的指示。在免疫学上，C 一反应蛋白是一种模式识别受体，为天然免疫系统的重要组成成分。C 一反应蛋白能在钙离子存在的条件下特异性结合磷酸胆碱基团，从而与各种细菌结合。C 一反应蛋白与细菌的结合可诱发系列免疫调控反应，包括激活补体、促进细胞的吞噬等，因此C 一反应蛋白在疾病的免疫防控中具有应用价值。目前，C 一反应蛋白已在多种鱼类中发现，但是其功能和应用性研究尚缺乏。发明内容
本发明目的在于提供一种C 一反应蛋白及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种C 一反应蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。
C 一反应蛋白的制备方法，
I)质粒pCsCRP的构建·
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒T-Simple5进行连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养2 - 8h,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSCRP ；
将pTSCRP用Sma I酶切，回收0. 6kb片段，连接于pET259，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCsCRP ；
2) C —反应蛋白的制备
将上述步骤I)的质粒pCsCRP转化BL21 (DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pCsCRP ;将BL21/pCsCRP用终浓度为O. 5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的C 一反应蛋白。
所述步骤I)中 Fl 为 5’ -CCCGGGGCCACCATGCTACAAGATATGTCAGGAAAGA -3’ ;R1 为 5 ，-CCCGGGGTAGCACTGTGTTACTCTATC-3’。
C 一反应蛋白的应用，所述C 一反应蛋白与细菌结合作为制备激活外周血白细胞的药物中的应用。所述C 一反应蛋白与革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌结合。
所述革兰氏阴性细菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、大肠杆菌 (Escherichia coli)或鳗弧菌(Vibrio anguil larum);革兰氏阳性细菌为海豚链球菌 (Streptococcus iniae)。
本发明具有如下优点本发明的C 一反应蛋白能够与革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌结合并且对外周血白细胞具有显著的激活能力。所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜能。
图1为本发明实施例提供的纯化得到的C 一反应蛋白电泳图谱(其中，纯化得到的 C 一反应蛋白为泳道2 ;泳道1:分子量marker)。
图2为本发明实施例提供的C 一反应蛋白激活外周血白细胞能力检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；酵母转化按 Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS — PAGE)按照 Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannua1. Cold Spring Harbor Laboratory Pres s2001o
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
本发明的C 一反应蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No.1 为:
MEYKMAFLLMLVMLTSWVAALQDMSGKMFTFPIAPNRAYVKLITGTQEFKAVTICHRSFTDLRRDHALF SMATPSHYNSFLLFWDNTNKELEPHVMDKKAECAGLDYKMNMWHSICTTffDSTSGIVQIffFNGffPSIRKYSVTGQIQ SSSFVIILGQEQDSHGGGFDQSQSFVGMMTDVHMWNYVLSGCEIRNYSDERNFTPGNVISWKALEFEIVDKVLVEDR VTQCY
(a)序列特征
长度228
类型氨基酸序列
籲链型单链
拓扑结构线性
(b)分子类型蛋白质
(C)假设否
(d)反义否
( e )最初来源半滑舌鳎
结构特点该蛋白含有一个信号肽(由氨基酸I 一 20组成)和一个穿透素功能域 (由氨基酸21 — 226组成)。
实施例2
C 一反应蛋白的制备方法
I)质粒pCsCRP的构建
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为 94。C60s预变性模板DNA，然后94。C40s，55。C60s，72。C60s，5个循环后改为 94。C40s，66° C60s, 72° C60s, 30 个循环后再在 72。C 延伸反应 7 — lOmin。PCR产物用天根的PCR产物纯化试剂盒纯化后与质粒T-Simple (购于北京全式金生物技术有限公司) 于室温连接2 - 8小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)、 Xgal (40ug/ml)、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSCRP。
将pTSCRP用Sma I酶切，回收O. 6kb片段。将表达载体pET259(pET259构建过程 #JALZheng, ff. J. , Hu, Y. H. , Sun, L., 2010. Cloning and ana lysis of a ferritin subunit from turbot (Scoph tha Imus maximus). Fish. Shellfish. Tmmunol · 28, 829 - 836)用 Swa I酶切后回收5. 4kb片段，将其与回收的0. 6kb片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCsCRP。
所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水。所述 Fl 为 5’ -CCCGGGGCCACCATGCTACAAGATATGTCAGGAAAGA-3’ ；R1 为 5 ，-CCCGGGGTAGCACTGTGTTACTCTATC-3’。
2) C —反应蛋白的表达和制备
将步骤I)的质粒pCsCRP转化BL21 (DE3)(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含有卡那霉素(3 0ug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pCsCRP。将 BL21/pCsCRP在含有卡那霉素的LB培养基中于37°C培养OD6tltl为0. 6，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到0. 5mM, 18°C继续摇动培养8小时，而后用GE Healthcare (美国)公司的N1-NTA金属亲和层析填料(nickel-nitrilotriacetic acid)亲和层析柱纯化重组蛋白(层析条件用4 - 5ml洗涤液洗柱两次，随后用0. 5 -1ml洗脱缓冲液洗柱，收集所有洗脱液)。将重组蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE)分析，发现其分子量与表SEQ ID No.1中序列的分子量一致(参见图1)。将纯化的蛋白经质谱分析，证实其为具有 SEQ ID No.1中氨基酸序列的C 一反应蛋白。
上述洗涤液成分为50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM 咪唑(imidazole), ρΗ8· 0;上述洗脱缓冲液成分为50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8. 0.
实施例3
C 一反应蛋白的细菌结合作用
I)细菌悬液制备。在LB培养基中分别培养革兰氏阴性细菌迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)(保存于 CGMCC,编号为 CGMCC2330)、大肠杆菌(Escherichia coli) (DH5a，购于“天根生化科技(北京)有限公司”)、鳗弧菌(Vibrio anguil larum)(保存于CGMCC，编号为CGMCC6250保藏日期2012年6月21日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)以及革兰氏阳性细菌海豚链球菌(Sti^ptococcus iniae)(保存于CGMCC，编号为CGMCC1984)至OD600为O. 8，离心(5000g，4。C离心IOmin)收集菌体，重新悬于包被液(包被液为O. 159% Na2CO3, O. 293% NaHCO3, pH9. 6)至 108CFU/ml。
2)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。将 96 孔 ELISA板用包被液处理lh，随后用PBS洗三次。将上述步骤I)的各种细菌悬液加入ELISA 板(每孔lOOul)。将ELISA板于4°C保温15h，每孔加入200ul3%(重量/体积比)的脱脂奶粉，于37°C保温lh。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入IOOul上述实施例2步骤2) 制备所得C 一反应蛋白或者PBS(对照)。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入IOOul鼠抗His抗体(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37°C保温lh。将ELISA板用PBS 洗三次，随后每孔加入IOOul羊抗鼠IgG - HRP抗体(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37°C保温lh。将ELISA板用PBS洗三次，再用TMB试剂盒(购于北京“天根生化科技有限公司”)显色，随后在450nm测定吸光值。C 一反应蛋白与细菌的结合指数计算如下 ELISA反应中含有的细菌的吸光值/含有PBS的细菌的吸光值。通常结合指数大于2即被认为是有意义的(positive reading)。
结果表明，C 一反应蛋白与鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌、大肠杆菌和海豚链球菌的结合指数分别为4、3. 1,2. 8和2. 3。说明C 一反应蛋白能够与革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌发生显著结合。
所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl, 0. 02 % KCl, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0. 024% NaH2PO4,余量为水。
实施例4
C —反应蛋白对外周血白细胞的激活能力检测
I)细菌混合液制备。在LB培养基中培养鳗弧菌至OD6tltl为0. 8，离心(5000g，4° C 离心IOmin)收集菌体,重新悬于L-15培养基(购于美国Thermo Scientific HyClone公司)至107CFU/ml。将IOOul细菌悬液与上述实施例2步骤2)制备的C 一反应蛋白或者 PBS (对照)混合，即得细菌混合液。
2)外周血白细胞激活检测。外周血白细胞的制备按照Li等方法(Li YXj Sun JSj Sun L. An inflammatory CC chemokine of Cynoglossus semilaevis is involved in immune defense against bacterial infection. Fish Shellfish Immunol2011 ;31:446-52.)。将细胞置于含有L_15培养基的96 —孔细胞培养板(IO5个细胞/孔)。在细胞中加入上述步骤I)的细菌混合液，随后加入100ullmg/ml nitroblue tetrazolium(购于上海Sangon公司)，25° C保温2h,将细胞用PBS洗三遍,加入IOOul甲醇，25° C保温2min。将细胞用甲醇洗三遍，随后加入100 μ 12Μ KOH和120 μ I dimethyl sulfoxide (购于上海Sangon公司)。将细胞在630nm波长测量吸光值。结果表明，含有 C 一反应蛋白的样品的吸光值显著高于对照样品(参见图2)，说明C 一反应蛋白对外周血白细胞具有显著的激活能力。
综上所述，C—反应蛋白能够结合细菌并且激活外周血白细胞，因此在细菌性疾病的防控方面具有应用潜力。
权利要求
1.一种C 一反应蛋白，其特征在于C 一反应蛋白为序列表SEQ IDNo.1中的氨基酸序列所示。
2.—种权利要求1所述C 一反应蛋白的制备方法，其特征在于 1)质粒PCsCRP的构建 以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒T-Simple进行连接,连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养2 - 8h,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSCRP ； 将pTSCRP用SmaI酶切，回收O. 6kb片段，连接于pET259，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCsCRP ； 2)C —反应蛋白的制备 将上述步骤I)的质粒pCsCRP转化BL21 (DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pCsCRP ;将BL21/pCsCRP用终浓度为O. 5mM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的C 一反应蛋白。
3.按权利要求2所述的C一反应蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤I)中Fl为5’ -CCCGGGGCCACCATGCTACAAGATATGTCAGGAAAGA-3’；R1 为 5’-CCCGGGGTAGCACTGTGTTACTCTATC-3，。
4.一种权利要求1所述的C 一反应蛋白的应用，其特征在于所述C 一反应蛋白与细菌结合作为制备激活外周血白细胞的药物中的应用。
5.按权利要求4所述的C-反应蛋白的应用，其特征在于所述C 一反应蛋白与革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌结合。
6.按权利要求5所述的C一反应蛋白的应用，其特征在于所述革兰氏阴性细菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、大肠杆菌(Escherichia coli)或獲弧菌(Vibrioanguillarum);革兰氏阳性细菌为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种C－反应蛋白及其制备和应用。C－反应蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。制备方法以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物连接表达载体后得质粒pCsCRP，将其转化BL21(DE3)，获得转化子BL21/pCsCRP，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为C－反应蛋白。本发明的C－反应蛋白能够与革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌结合并且对外周血白细胞具有显著的激活能力。所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜能。
文档编号C07K14/435GK103012576SQ20121044243
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者孙黎, 李墨非 申请人:中国科学院海洋研究所