一种GA₄和/或GA₇的分离纯化方法

专利名称：一种GA₄和/或GA₇的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种GA4和/或GA7的分离纯化方法，具体涉及萃取、反萃取、减压浓缩、结晶分离，属于生物分离领域。
背景技术：
赤霉素(Gibbeerllins,简称GAs)是一种天然的植物生长调节剂,对植物生长具有多种生理功能，可以调节植物生根、发芽、生长以及开花结果等过程，因此在农作物生产及蔬菜种植中有着广泛应用。现已发现的赤霉素达百余种，但它还不能完全由化学法合成，目前工业化生产的赤霉素均是由微生物发酵获得。GA3是菌种发酵积累的主要产物，也是所有赤霉素中生理活性最强，应用最广泛的。至今GA3的发酵、分离检测技术已经发展得相当成熟。随着研究的深入，逐步发现GA3应用上的局限性。例如6^在使胚轴生长的 过程中会降低植物的抗倒伏性，在提高果树座果率的同时会引起过度生长，影响果实的形状等。新型赤霉素产品的开发成为当前研究的热点，GA4+7以其较高的活性和独特的优势成为目前最有潜力的品种。GA4+7的研究还处于起步阶段，GA4+7的生产能力仍处于较低水平，其价格是GA3的几十倍。对菌种进行诱变或利用基因工程手段进行改良后的菌种生产效价有所提高，但仍不能得到单一的GA4+7，发酵液中存在各种赤霉素混合物，给后期的分离纯化带来了困难。GA4与GA7均是19碳赤霉素，其化学结构上仅有一个双键之差，化学性质非常相近，所以一般的检测方法也很难将其区分开。当前建立一种有效的GA4和/或GA7的分离纯化和检测方法将具有很好的应用前景。

发明内容
本发明的目的是提供一种GA4和/或GA7分离纯化方法，该分离方法能得到纯度较高的GA4和/或GA7,经由HPLC定量测试后发现其纯度高于96%。本发明的技术方案为一种GA4和/或GA7的分离纯化方法，其具体步骤如下(I)将含GA4和/或GA7的溶液用酸调pH4. O 7. 0，加入有机溶剂振荡萃取，得萃取液；将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，分别得到有机相A与溶液；(2)将步骤(I)中分层得到的溶液用酸调PH2. O 3. 0，再加入有机溶剂振荡萃取，得萃取液；将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相B;(3)将步骤(I)和(2)所得的有机相A与有机相B混合，得有机相混合液，加入用酸调pH4. O 6. O的蒸馏水振荡萃取，得萃取液；将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相C;(4)向有机相C中加入吸附剂吸附，过滤后得滤液；( 5 )将步骤(4 )得到的滤液减压浓缩，待液体全部旋干后，收集固体物质；(6)将收集的固体物质溶解到有机混合物中，低温下重结晶；过滤收集晶体。 优选步骤(I)中所述的含GA4和/或GA7溶液为含有GA4和/或GA7的赤霉菌发酵液或者是含有GA4和/或GA7的赤霉素混合物溶液；其中赤霉菌发酵液或者是赤霉素混合物溶液中GA4和/或GA7的质量百分含量为5% 90% ;步骤(I)和(2)中加入的有机溶剂均为Cl-ClO的醇、Cl-ClO的酯或Cl-ClO的酮；步骤(I)和(2)中萃取时有机溶剂与步骤(I)中的含GA4和/或GA7溶液的体积比均为I : (3 5);步骤(3)中有机相混合液与蒸馏水体积比为I: (3 5)。更优选步骤(I)和(2)中加入的有机溶剂均为乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基乙基酮、戊酮、正丁醇或正戊醇。优选步骤(I)、(2)和(3)中调pH的酸均为HCl或H2SO4 ;步骤(I )、(2)和(3)中振荡萃取的条件均为摇床转速120 160rpm,萃取时间O. 5 I. 5小时。优选步骤(4)中加入的吸附剂为活性碳、皂土或硅酸盐；吸附剂的加入质量与有机相C体积的比为I 3g/100ml ;吸附时间为O. 5 lh。优选步骤(5)中减压浓缩过程转速为50 90rpm，温度为25 35°C，真空度为
O.07 O. IMPa0
优选步骤(6)中的有机混合物为乙酸乙酯与乙醚混合物，其中乙酸乙酯与乙醚的体积比为I: (2 5);所述的低温为-20 -30°C。本发明中HPLC检测条件为RPC18，250X4mm柱，流动相为60%乙腈和1%丙酮及5mmol/L NH4H2PO4, pH2. 5，柱温 25°C，流速 I. Oml/min,紫外波长 205nm 进行检测。有益效果(I)利用溶剂萃取、反萃取、减压浓缩及结晶技术分离纯化GA4和/或GA7,该工艺简单，设备要求低，处理量大，适合于大规模放大生产。通过萃取与反萃取技术，有效提高了GA4和/或GA7提取率及纯度。(2)该工艺过程能特异的分离到GA4、GA7或GA4+7，若混合物中仅含GA4或GA7,则可以得到GA4、GA7，若含GA4与GA7的混合物则可得到GA4+7。(3)提取到的产品用HPLC及溶点辅助纯度检测方法。先检测提取物溶点，进行粗略纯度的判断，再进行HPLC检测，提高了效率，节约了检测成本。
具体实施例方式以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。实施案例I量取600ml赤霉菌发酵液，经检测后GA4+7的质量占赤霉菌发酵液质量的5%，用HCl调pH4. O，加入200ml乙酸乙酯，120rpm下振荡萃取O. 5h，得萃取液。将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，分别得到机相A与溶液。将溶液用HCl调pH2. O，再加入200ml乙酸乙酯，120rpm下振荡萃取0.5h，得萃取液，将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相B。将所得的有机相A与B混合，得有机相混合液400ml，加入用HCl调pH4. O的蒸馏水1200ml，120rpm下振荡萃取O. 5h,得萃取液，将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相C400ml;向有机相C中加入4g活性碳，吸附O. 5h后过滤收集滤液。将滤液在50rpm，温度为25°C，真空度为O. 095MPa下减压浓缩直到液体全部旋干，收集固体物质。将固体物质溶解于体积比I :5的乙酸乙酯与乙醚混合物中，放于_20°C结晶，过滤收集晶体。测定晶体的溶点为206. 9-209. 2°C，晶体溶解后用RPC18，250 X 4mm柱，流动相为60%乙腈和1%丙酮及5mmoI/LNH4H2PO4, pH2. 5，柱温25 V，流速I. Oml/min,紫外波长205nm进行检测，GA4 为 27%, GA7 为 69%,杂质为 4%。
实施案例2量取600ml赤霉素混合溶液，经检测后GA4的质量占赤霉素混合溶液质量的70%，用H2SO4调pH5. 5，加入150ml戊酮，140rpm下振荡萃取lh，得萃取液。将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，分别得到机相A与溶液。将溶液用H2SO4调pH2. 5，再加入150ml戊酮，140rpm下振荡萃取lh，得萃取液，将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相B。将所得的有机相A与B混合，得有机相混合液300ml，加入用H2SO4调pH5. O的蒸馏水1200ml, 140rpm下振荡萃取Ih,得萃取液，将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相C300ml;向有机相C中加入6g阜土,吸附45min后过滤收集滤液。将滤液在70rpm,温度为30°C，真空度为O. 085MPa下减压浓缩直到液体全部旋干，收集固体物质。将固体物质溶解于体积比I :3的乙酸乙酯与乙醚混合物中，放于_25°C结晶，过滤收集晶体。测定晶体的溶点为207. 1-208. 2°C，晶体溶解后用RPC18，250 X 4mm柱，流动相为60%乙腈和1%丙酮及 5mmol/LNH4H2P04，pH2. 5，柱温 25°C，流速 I. Oml/min,紫外波长 205nm 进行检测，GA4 为 98%，杂质为2%。实施案例3量取600ml赤霉菌混合溶液，经检测后GA7的质量占赤霉菌混合溶液质量的90%，用HCl调pH7. O，加入120ml 丁醇，160rpm下振荡萃取I. 5h,得萃取液。将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，分别得到机相A与溶液。将溶液用稀HCl调pH3. O,再加入120ml丁醇，160rpm下振荡萃取1.5h，得萃取液，将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相B。将所得的有机相A与B混合，得有机相混合液240ml，加入用H2SO4调pH6. O的蒸馏水1200ml，160rpm下振荡萃取I. 5h,得萃取液，将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相C240ml;向有机相C中加入7. 2g硅酸盐，吸附Ih后过滤收集滤液。将滤液在90rpm，温度为35°C，真空度为O. 075MPa下减压浓缩直到液体全部旋干，收集固体物质。将固体物质溶解于体积比I :2的乙酸乙酯与乙醚混合物中，放于_30°C结晶，过滤收集晶体。测定晶体的溶点为207. 4-208. 2V，晶体溶解后用RPC18，250 X 4mm柱，流动相为60%乙腈和1%丙酮及5mmoI/LNH4H2PO4, pH2. 5，柱温25 V，流速I. Oml/min,紫外波长205nm进行检测，GA7 为 98. 6%，杂质为 I. 4%ο
权利要求
1.一种GA4和/或GA7的分离纯化方法，其具体步骤如下 (1)将含GA4和/或GA7的溶液用酸调pH4.O 7. O，加入有机溶剂振荡萃取，得萃取液；将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，分别得到有机相A与溶液； (2)将步骤(I)中分层得到的溶液用酸调pH2.O 3. O，再加入有机溶剂振荡萃取，得萃取液；将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相B; (3)将步骤(I)和(2)所得的有机相A与有机相B混合，得有机相混合液，加入用酸调PH4. O 6. O的蒸馏水振荡萃取，得萃取液；将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后，得有机相C; (4)向有机相C中加入吸附剂吸附，过滤后得滤液； (5)将步骤(4)得到的滤液减压浓缩，待液体全部旋干后，收集固体物质； (6)将收集的固体物质溶解到有机混合物中，低温下重结晶；过滤收集晶体。
2.根据权利要求I所述的分离纯化方法，其特征在于步骤(I)中所述的含GA4和/或GA7溶液为含有GA4和/或GA7的赤霉菌发酵液或者是含有GA4和/或GA7的赤霉素混合物溶液；其中赤霉菌发酵液或者是赤霉素混合物溶液中GA4和/或GA7的质量百分含量为5% 90% ;步骤(I)和(2)中加入的有机溶剂均为Cl-ClO的醇、Cl-ClO的酯或Cl-ClO的酮；步骤(I)和(2)中萃取时有机溶剂与步骤(I)中的含GA4和/或GA7溶液的体积比均为I :(3 5);步骤(3)中有机相混合液与蒸馏水体积比为I: (3 5)。
3.根据权利要求I所述的分离纯化方法，其特征在于步骤(I)和(2)中加入的有机溶剂均为乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基乙基酮、戊酮、正丁醇或正戊醇。
4.根据权利要求I所述的分离纯化方法，其特征在于步骤(I)、(2)和(3)中调pH的酸均为HCl或H2SO4 ;步骤(1)、(2)和(3)中振荡萃取的条件均为摇床转速120 160rpm，萃取时间O. 5 I. 5小时。
5.根据权利要求I所述的分离纯化方法，其特征在于步骤(4)中加入的吸附剂为活性碳、皂土或硅酸盐；吸附剂的加入质量与有机相C体积的比为I 3g/100ml ;吸附时间为O.5 lh。
6.根据权利要求I所述的分离纯化方法，其特征在于步骤(5)中减压浓缩过程转速为50 90rpm，温度为25 35°C，真空度为O. 07 O. IMPa0
7.根据权利要求I所述的一种GA4和/或GA7的分离纯化方法，其特征在于步骤(6)中的有机混合物为乙酸乙酯与乙醚混合物，其中乙酸乙酯与乙醚的体积比为I: (2 5);所述的低温为-20 -30°C。
全文摘要
本发明公开了一种GA4和/或GA7的分离纯化方法,属于生物分离领域。主要包括萃取、反萃取、减压浓缩、结晶分离、溶点检测及高效液相色谱检测。解决了目前赤霉素GA4和/或GA7分离纯化困难、高效检测技术空缺、设备要求高、工艺复杂等问题。本发明根据GA4和/或GA7与其它GA在不同有机相与水相的分配系数的不同，建立了萃取体系，经减压浓缩和结晶分离后用快速的溶点检测粗略判断纯度再结合高效液相色谱定量检测。简化了分离过程、提高了检测精度、节约了成本、工艺简单、易操作、适合工业化生产。
文档编号C07D307/93GK102942547SQ20121046447
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者杨文革, 胡永红, 李佼佼, 唐容容 申请人:南京工业大学