一种兔抗牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备方法

专利名称：一种兔抗牛α_s -酪蛋白多克隆抗体的制备方法
一种兔抗牛Cts-酪蛋白多克隆抗体的制备方法技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种兔抗牛a s-酪蛋白多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
近年来，人们对乳品质的要求越来越高，乳蛋白作为衡量乳品质的重要指标，其合成的营养调控已成为奶牛营养学研究的热点。乳蛋白大部分是由奶牛乳腺上皮细胞从头合成和分泌的，80%的乳蛋白由酪蛋白组成，而牛乳中的酪蛋白主要由a s-酪蛋白 (a s-casein)组成(约45%_55%),因此研究调控a s-酪蛋白的合成具有重要意义。检测牛乳或乳腺细胞合成分泌的酪蛋白最常用的方法主要包括ELISA法和Western-blot法，而这两种方法均需用到酪蛋白抗体，目前没有商品化的奶牛as-酪蛋白抗体，因此本发明通过免疫新西兰兔来制备兔抗牛a s-酪蛋白多克隆抗体，旨在为研究奶牛Cis-酪蛋白合成的调控提供有效的试验材料。为得到纯度较高、特异性较强的抗体，本发明通过饱和硫酸铵和蛋白A树脂对抗血清进行两次纯化，纯化后得到的抗体用Western-blot法鉴定其与a s-酪蛋白纯品及乳腺组织中a s-酪蛋白的有无特异性反应。发明内容
本发明的目的是建立一种兔抗牛a s-酪蛋白多克隆抗体的制备方法，为鉴定奶牛乳腺组织合成的a s-酪蛋白提供试验材料。
为实现上述目的，具体的实施方案为
选用健康新西兰大白兔每两周免疫一次奶牛a s-酪蛋白，待血清达到抗体效价后，对兔进行颈动脉放血并分离血清，利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体。分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)法鉴定纯化后抗体的纯度和特异性，最后用Western-blot法鉴定该抗体其与奶牛乳腺组织合成的a s-酪蛋白的反应性。
本发明步骤如下
步骤(I).免疫动物用a s_酿蛋白纯品对免疫动物(新西兰大白兔)实施每两周一次的免疫程序，初免使用弗氏完全佐剂，以后使用弗氏不完全佐剂。
步骤(2).取动脉血取免疫动物动脉血，离心分离血清，超低温冰箱保存备用。
步骤(3).抗体纯化用饱和硫酸铵法对血清进行初步纯化，然后用蛋白A树脂进一步纯化得抗体。
抗体纯度鉴定=SDS-PAGE分离纯化后的抗体，凝胶成像系统拍照观察其条带，据此判断纯化后抗体的纯度。
抗体效价测定=ELISA测定抗体效价，酶标板用a s-酪蛋白纯品包被，取不同稀释度的纯化后的抗体进行孵育，二抗孵育后，加入底物溶液和终止液在酶标仪上测定并读取吸光值。
抗体特异性鉴定Western-blot法鉴定纯化后的抗体与a s-酪蛋白及乳腺组织合成的as-酪蛋白的反应性，SAS-PADE电泳结束后进行切胶，转膜，封闭，一抗、二抗孵育， DAB显色剂显色，扫描观察结果。
尽管蛋白A树脂纯化多克隆抗体得到的免疫球蛋白纯度较高，但这种树脂价格昂贵，而且多次反复使用后与免疫球蛋白的结合活性降低，因此，为了提高蛋白A树脂的使用寿命和节约成本，本发明先用饱和硫酸铵对抗体进行粗提纯后再用蛋白A树脂进行亲和层析纯化，最终得到了纯度较高的抗体，而且能够特异性与as-酪蛋白发生抗原抗体结合反应，并成功用于鉴定奶牛乳腺组织中as-酪蛋白的合成。


图I是SDS-PAGE结果。图 2 是 Western-blot 结果。图3是抗体在检测奶牛乳腺组织a s-酪蛋白合成上的应用。
具体实施方式
I材料与方法
I. I试验材料
a s-酪蛋白标准品(美国Sigma公司，纯度彡70%);弗氏完全佐剂(美国Sigma公司)；弗氏不完全佐剂(美国Sigma公司)；蛋白A树脂(美国Genscript公司)；羊抗兔IgG HRP (武汉博士德公司)；猪源明胶(美国Amresco公司)；DAB显色剂(上海生工生物工程公司)；RIPA裂解液(上海碧云天公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司)
I. 2试验动物及饲养
试验动物选用4只健康纯种新西兰大白兔(购自南京金陵种兔厂)，饲养前对兔舍进行彻底清扫和消毒，采用单笼饲养，每日饲喂颗粒饲料(饲料成分不含酪蛋白)3次，自由饮水。待兔适应饲养环境约一周后，耳缘静脉采血约ImL进行ELISA测试其血清是否与 a s-酪蛋白有反应性，无反应性的合格兔子按免疫程序进行免疫。
L 3免疫程序
免疫程序见表1，每次免疫前将弗氏佐剂与a s-酪蛋白溶液按I: I彻底混合乳化后，采用皮下多点注射法，每只兔注射ImL乳化液(含800 μ g a s_酪蛋白)。免疫结束后的第 57天耳缘静脉采血，参考杨苗等(2010)的方法ELISA检测抗血清效价，效价达到1:10000 时立即准备放血。
表I a s-酪蛋白免疫程序
权利要求
1.一种兔抗牛a s-酪蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，选用健康新西兰大白兔每两周免疫一次奶牛a s_酪蛋白，待血清达到抗体效价后，取兔动脉血并分离血清，利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体。
2.根据权利要求I所述兔抗牛as-酪蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法具体步骤为 步骤(I).免疫动物用a s_酿蛋白纯品对健康新西兰大白兔实施每两周一次的免疫程序，初免使用弗氏完全佐剂，以后使用弗氏不完全佐剂； 步骤(2).取动脉血取经免疫兔的动脉血，离心分离血清，超低温冰箱保存备用； 步骤(3).抗体纯化用饱和硫酸铵法对血清进行初步纯化，然后用蛋白A树脂进一步纯化得抗体； 步骤(4).抗体纯度鉴定=SDS-PAGE分离纯化后的抗体，凝胶成像系统拍照观察其条带，据此判断纯化后抗体的纯度。
全文摘要
本发明提供了一种兔抗牛αs-酪蛋白多克隆抗体的制备方法，为鉴定奶牛乳腺组织合成的αs-酪蛋白提供试验材料。本发明选用健康新西兰大白兔每两周免疫一次奶牛αs-酪蛋白，待抗血清达到效价后，对兔进行颈动脉放血并分离血清，利用饱和硫酸铵法(盐析)结合蛋白A树脂(亲和层析)纯化抗体，分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)法鉴定纯化后抗体的纯度和特异性。抗血清经过饱和硫酸铵和蛋白A树脂两步纯化不仅得到了纯度较高的抗体，而且延长了蛋白Ａ树脂的使用寿命，节约了成本。纯化得到的抗体可以特异性结合奶牛αs-酪蛋白，为进一步研究奶牛αs-酪蛋白合成的调控提供了有效的科研工具。
文档编号C07K16/06GK102977211SQ201210471998
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者王洪荣, 庞学燕, 季昀, 喻礼怀, 王梦芝 申请人:扬州大学