一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法，包括将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，得到初级产物I；在结合条件下，将初级产物I经阴离子/疏水复合填料的交换层析，得到中级产物II；将中级产物II经疏水层析，得到纯化的高纯度重组人血清白蛋白目标物。用本发明的层析方法分离纯化后得到的重组人血清白蛋白纯度达99.9999％，内毒素含量达到我国药典规定的标准。
【专利说明】一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白(OsrHSA)可用于临床应用的方法。
【背景技术】
[0002]人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人体血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60%左右。每升人血含有HSA约40g。HSA除存在于血浆中外，还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。在人的正常生理条件下，HSA具有维持血浆胶体渗透压、营养和促进伤口愈合的作用，而且其作为载体物质，参与诸多疏水性生物分子如激素、生物学活性物质及药物在血液中的运输。因此，HSA是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。
[0003]目前，临床上使用的HSA主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，这种制备途径存在以下缺点:一方面血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求；另一方面血液自身也可能存在问题,例如可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的HSA存在巨大的担忧。
[0004]随着现代DNA重组和合成技术的发展，研究人员对重组人血清白蛋白(OsrHSA)的生产和应用产生了极大的兴趣。迄今为止，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产OsrHSA,例如利用原核生物如大肠杆菌(Latta, M.et al., Bio/Technology, 5:1309-1314，(1987))、枯草芽孢杆菌(Saunders, C.ff.etal, J.Bacteriol.169:2917-2925,(1987))，真核生物如酵母(W0 00/44772，EP0683233A2，US 5612196)、动物细胞培养等生产OsrHSA。但这些方法因表达水 平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。
[0005]本发明人的中国专利申请N0.201010606635.8公开了一种从水稻种子中提取OsrHSA的方法，在该方法的基础上，本发明进一步对去除OsOsrHSA的内毒素含量和提高纯度到> 99.9999%的工艺进行研究，从而得到本发明的新技术方案，在此，将申请N0.201010606635.8公开的内容全文引入本发明的【背景技术】。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种从转基因水稻种子的蛋白粗提液中分离纯化重组人血清白蛋白的层析方法，纯化后得到的重组人血清白蛋白纯度达99.9999 %，内毒素含量达到我国人血清白蛋白的药典标准。
[0007]本发明的技术方案为:
[0008]一种用分离纯化重组人血清白蛋白(OsrHSA)的层析方法
[0009]包括以下步骤: [0010]I)将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，得到初级产物I ;
[0011]2)在结合条件下，将初级产物I经阴离子交换层析，得到中级产物II ；
[0012]3)将中级产物II经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白目标物。
[0013]其中，所述阳离子交换层析的填料为Capto-MMC或Bestarose DiamondMMC ;所述阴离子交换层析的填料为Capto-Adhere或Bestarose Diamond MMA ;所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose HP或Phenyl Bestarose HP ;所述缓冲液包括洗杂缓冲液、平衡缓冲液I和平衡缓冲液II，其中洗杂缓冲液加入10-20%的乙醇，优选10%，平衡缓冲液I加入0-10%的乙醇，平衡缓冲液II加入5-15%，优选10%。
【专利附图】
【附图说明】[0014]图1是三种不同条件的Capto-MMC层析纯化效果与载量测定图；
[0015]其中，M为分子量标记，L为提取液样品，Ml为对照组，M2为试验组1，M3为试验组2，FT为上样穿透液，M3FT为M3试验组的上样流穿液，600、660和730分别为上样600mL、66OmL和730mL时的流穿液,wash为含OsrHSA组分的洗杂液,Elution为含OsrHSA组分的洗脱液。
[0016]图2是Capto MMC与Bestarose Diamond MMC进行初级纯化的纯度比较图；
[0017]其中，GE-MMC即为 Capto-MMC，Best-MMC 即为 Bestarose Diamond MMC, Elu 表示两种填料进行初级纯化的洗脱液；M为分子量标记，FT为上样穿透液，wash为OsrHSA洗杂液，Elu为含OsrHSA组分的洗脱液，S为提取液样品，CIPl为填料再生I洗脱液，CIP2为填料再生2洗脱液。
[0018]图3是UNO Sphere S加醇与不加醇层析的纯化效果比较图；
[0019]其中，CK为对照组;UE为试验组(样品和平衡液中加10%乙醇)；M为分子量标记；Load为样品；FT为上样穿透液；Elution为两种条件下洗脱的目标峰收集液CIP为填料再生。
[0020]图4是Capto-Adhere与Bestarose Diamond MMA在穿透条件下进行中级纯化的比较SDS-PAGE图谱；
[0021]其中，M为分子量标记，MMC为样品，FT为含OsrHSA组分的穿透液，CIP为填料再生。
[0022]图5是Capto-Adhere与Bestarose Diamond MMA在结合条件下进行中级纯化的比较；
[0023]其中，M为分子量标记，L为样品，FT为上样穿透液，Elu为含OsrHSA组分的洗脱液，C为填料再生。
[0024]图6是Phenyl Sepharose HP和Phenyl Bestarose HP疏水层析进行最终纯化比较；
[0025]其中，M为分子量标记，Ad为上样样品，FT为含有OsrHSA组分的穿透液，CIP为填料再生)
[0026]图7是水稻种子蛋白质纯化前后的杂质检测图；
[0027]其中，左图为水稻种子人血清白蛋白纯化前后的杂质检测SDS-PAGE对比图；右图为水稻种子人血清白蛋白纯化前后的采用全水稻种子杂质抗体进行杂交的WesternBlotting检测图…为分子量标记。
[0028]图8是本发明一个实施例中分离纯化OsrHSA的SDS-PAGE图谱。
[0029]其中，A为 Capto-MMC 层析，B 为 Capto-Adhere 层析，C 为 Phenyl HP 层析；L 为上样液，FT为流穿液，W为洗杂液，Elu为洗脱液，C为填料CIP。
【具体实施方式】
[0030]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0031]以下实施例中使用的试剂和仪器，除特别说明以外，均为普通市售。
[0032]【实施例1】OsrHSA得取液的制备
[0033]参考本发明人的中国专利N0.200510019084.4的方法制备含有OsrHSA的转基因水稻，并参考本发明人的中国专利N0.201010606635.8的方法从水稻种子中提取OsOsrHSA，得到澄清的OsrHSA提取液。
[0034]【实施例2】阳离子交换层析进行初级纯化的条件筛选
[0035]方法:参考本发明人中国专利申请号N0.201010606635.8的方法进行；
[0036]分组:试验组和对照组
[0037]1.用Capto MMC阳离子交换层析进行初级纯化及加醇去除内毒素工艺
[0038]以下利用Capto MMC阳离子交换层析进行初级纯化，并在试验组的缓冲液中添加乙醇以去除OsrHSA提取液中的内毒素，对照组(Ml)则不加乙醇。
[0039]试验组I (M2):平衡液和样品中加10%乙醇，具体工艺条件为:
[0040]装柱:将Capto MMC填料约30mL装于XK16/400mm层析柱中，用0.5NNa0H清洗30min灭热原；
[0041]平衡:用200mL平衡缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10% (v/v)无水乙醇，乙酸调至PH4.5)以300cm/h流速平衡层析柱，直到pH达到4.5并稳定；
[0042]上样:向含有OsrHSA的澄清提取液样品中添加10% (v/v)无水乙醇和Ilg/LNaCl，用NaOH调ρΗ4.5 ；以600cm/h的流速上样，样品电导为20_21mS/cm，pH为4.5 ;
[0043]再平衡:上样结束后，用IOOmL平衡缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10%(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5，注射用水配制)以300cm/h流速，再次平衡层析柱；
[0044]洗杂:用200mL洗杂缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 58.5g/L，乙酸调至ρΗ4.8，注射用水配制)以300cm/h流速洗脱杂质；
[0045]洗脱:用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠2.67g/L，磷酸氢二钠2.82g/L，NaCl 23.4g/L，pH6.3-6.4，注射用水配制)洗脱目标峰，得到含OsrHSA的组分。
[0046]试验组2(M3):平衡液和样品中加10%乙醇，洗染液中加20%乙醇，具体工艺条件为:
[0047]装柱:将Capto MMC填料约30mL装于XK16/400mm层析柱中(柱高21cm)，用0.5NNaOH清洗30min灭热原；
[0048]平衡:用200mL平衡缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10% (v/v)无水乙醇，乙酸调至PH4.5)以300cm/h流速平衡层析柱，直到pH达到4.5并稳定；
[0049]上样:向含有OsrHSA的澄清提取液样品中添加10% (v/v)无水乙醇和Ilg/LNaCl，用NaOH调ρΗ4.5 ；以600cm/h的流速上样，样品电导为20_21mS/cm，pH为4.5 ;
[0050]再平衡:上样结束后，用IOOmL平衡缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10%(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5，注射用水配制)以300cm/h流速，再次平衡层析柱；
[0051]洗杂:用200mL洗杂缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 120g/L,20% (v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.8,注射用水配制)以300cm/h流速洗脱杂质；
[0052]洗脱:用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠2.67g/L，磷酸氢二钠2.82g/L，NaCl 23.4g/L，pH6.3-6.4，注射用水配制)洗脱目标峰，得到含OsrHSA的组分。
[0053]结果:纯度及载量测定如图1所示:对照组和两个试验组在纯度上无明显差异，洗杂液中加醇洗有利于17-26KD杂带的去除；Capto-MMC加醇洗对载量没有影响，3组试验中的FT显示载量均高于30mL提取液/mL填料。
[0054]内毒素情况:如表1所示，Capto-MMC加醇洗层析对内毒素的去除有良好的效果，与对照试验相比，平衡液和提取液样品中加10% (v/v)乙醇，洗杂液中加20%乙醇进行Capto-MMC层析对内毒素的去除效果最佳,约为对照试验的3.6倍。
[0055]表1Capto-MMC加醇洗试验的内毒素情况比较
[0056]
【权利要求】
1.一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，得到初级产物I ; 2)将初级产物I经阴离子交换层析，得到中级产物II； 3)将中级产物II经疏水层析，得到高纯度的重组人血清白蛋白目标物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述阳离子交换层析的阳离子/疏水复合填料为 Capto-MMC 或 Bestarose Diamond MMC。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述阴离子交换层析的阴离子/疏水复合填料为 Capto-Adhere 或 Bestarose Diamond MMA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中疏水层析的填料为PhenylSepharoseHP> Phenyl Sepharose FF> Phenyl Bestarose HP 或 Phenyl Bestarose FF0
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括洗杂缓冲液、平衡缓冲液I和平衡缓冲液II ;其中洗杂缓冲液含体积比为10-20%的无水乙醇，平衡缓冲液I含体积比为0-10%的无水乙醇，平衡缓冲液II含体积比为5-15%的无水乙醇。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述洗杂缓冲液含15%的无水乙醇，平衡缓冲液II含10%的无水乙醇。
7.如权利要求5所述的方法，其中洗杂缓冲液含有:无水乙酸钠2g/L，15%无水乙醇，用NaCl调节电导至83mS/cm,用乙酸调节pH至pH4.6-5.0。
8.如权利要求5所述的方法，其中平衡缓冲液I为:无水乙酸钠2g/L，NaC115g/L，乙酸调至 pH4.2-4.8。
9.如权利要求5所述的方法，其中平衡缓冲液II为:无水乙酸钠2g/L，NaC115g/L,10%无水乙醇，乙酸调至pH4.2-4.8。
【文档编号】C07K14/765GK103880947SQ201210559390
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】杨代常, 施波, 施倩妮, 欧吉权, 刘静茹 申请人:武汉禾元生物科技有限公司