专利名称：基于蛋白a亲和模型构建免疫球蛋白g的新型亲和配基多肽库及设计方法的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用分子模拟仿生设计目标蛋白质的亲和配基技术，以及利用亲和色谱技术纯化目标蛋白质，属于生物技术中的计算机模拟和蛋白质分离纯化技术领域。
背景技术：
抗体(免疫球蛋白，Ig)是位于动物血液和组织液中，由B淋巴细胞在对抗原的免疫应答中产生的一类糖蛋白。抗体与抗原具有的高亲和性使其广泛应用于生物学研究和临床治疗领域。特别是随着基因技术和克隆技术的逐渐成熟，单克隆抗体已成为治疗炎症、肿瘤和传染类疾病的有效药物。目前，已有大约20种单克隆抗体药物被FDA批准上市，至少 300个还在研发之中，2006年单克隆抗体类药物的产值达到了 206亿美元。抗体在医疗领域中日益显现的重要性亟需高效、稳定和低廉的生产工艺。由于抗体表达的复杂性以及对医用抗体的高质量要求，抗体纯化已成为整个生产过程的关键步骤。其中IgG是血清中主要的抗体成分，约占血清Ig的75%，也是需求量最大的一类抗体。抗体纯化通常采用盐析、凝胶过滤色谱、疏水作用色谱、离子交换色谱和亲和色谱等分离手段进行多步纯化。其中亲和色谱因能对目标分子进行高效特异性纯化已成为抗体纯化后期最常用的色谱方法之一。亲和色谱是利用亲和配基能与目标分子特异且可逆结合的特性，从复杂的生物样品中分离纯化目标分子，具有选择性强，纯化效率高的优点。亲和色谱法的纯化效果取决于目标分子与配基之间的亲和性。因此，针对特定的目标分子，开发合适的亲和配基是构建一个亲和色谱体系所首要解决的问题。金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)、蛋白G和蛋白L作为亲和配基已广泛用于制备高纯度抗体。这类配基的优点在于特异性高，而缺陷是过高的亲和力需要较苛刻的洗脱条件，容易导致目标蛋白变性和配基脱落，吸附容量较低；此外这类配基的制备也比较困难，价格昂贵，蛋白经固定化后一般会失去部分活性。这些弱点使得上述蛋白类配基的应用受到限制。亲和肽配基的研究始于1986年Geysen对合成肽库的研究,他提出含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定簇。而且在多数情况下，几个关键残基与对应目标分子间的非共价作用构成了复合物结合的主要作用力。这两个观点奠定了亲和肽配基的理论基础。肽配基通常仅由很少的氨基酸组成，不会在产品使用时引起免疫中毒反应。而且其分子量小，即使从固定相上脱落、掺入产品中也很容易从终产物中除去。此外肽配基与蛋白质的作用条件温和，有利于控制分离条件，避免目标蛋白的变性。和蛋白类等具有高亲和力的配基相比，亲和肽配基也具有足够高的亲和力结合目标蛋白。肽配基的构象和理化性质更稳定，能承受分离操作中较强的酸碱洗脱和再生条件，可实现在GMP条件下大规模无菌生产。近些年来涌现出的一批肽配基都对抗体具有较好的分离纯化效果，如TG19318、PeptideH,AlP、A2P、8/7、线性肽配基(HWRGWV 等)。尽管多肽作为亲和配基具有如此多的优越性，但自然界中与目标蛋白有亲和力的多肽数量十分有限。上述所讨论的小分子配基虽然在抗体纯化研究中显现出了很大优势，但与SpA亲和介质相比，也存在着不足，如特异性和亲和力较差等。因此在亲和色谱的实际应用中，配基的筛选和设计至关重要。如何选择合适的多肽序列作为亲和配基，以及如何提高多肽的亲和力和选择性的问题，已成为影响多肽亲和色谱应用的关键。现有的筛选和设计方法主要分为实验筛选和理性设计两类方法。实验筛选是基于组合库技术进行高通量实验筛选，根据构建多肽文库方法的不同，亲和配基的筛选技术主要分为组合化学合成肽库筛选，如上述提到的 TG19318/D-TG19318、P印tide H、MAbSorbentAlP、A2P 和 8/7 ;噬菌体展示肽库筛选，如HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL ;核糖体展示肽库筛选这三类。理性设计主要是基于目标蛋白或已有配基的结构和性质设计新配基。随着计算机技术、计算化学和药物化学的发展，亲和配基的设计已进入以计算机辅助设计为主导的理性设计阶段。计算机辅助配基设计的各种虚拟设计方法包括分子对接，3D-QSAR,药效团模型,分子动力学(moleculardynamics, MD)模拟和从头设计等。分子对接是两个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别的过程。分子对接计算是把配基分子放在目标蛋白结合位点的位置，然后按照几何互补、能量互补和化学环 境互补的原则来实时评价配基与目标蛋白结合的好坏，并找到两个分子之间最佳的结合构象。由于分子对接考虑了目标蛋白与配基相互作用的信息，因此从原理上讲，分子对接是一种基于受体的直接设计方法。近年来随着蛋白晶体结构信息的快速增长以及小分子数据库的不断更新，分子对接已经成为基于结构设计中的最为重要的方法。常用软件有DOCK，Autodock 和 FlexX 等。分子动力学是建立在牛顿力学基础上的一种分子模拟方法，用于研究多粒子体系中各粒子的运动过程。MD模拟的基本步骤可以分为如下四步(1)初始化；(2)计算原子受力；(3)更新原子坐标和速度。根据上一步的原子坐标、速度和受力，即可得到原子在下一时刻的坐标和速度。不断循环进行(2)和(3)步得到体系状态随模拟时间的变化情况；(4)分析轨迹。常用的分子动力学模拟软件主要有GROMACS、NAMD、AMBER和CHARMM等。通过分析MD模拟轨迹可以获得模拟体系的各种性质，包括构象、能量、动力学性质以及配基-目标蛋白质之间的相互作用力等。采用多种理性设计方法，通过设计合理的组合策略可以实现降低成本和更高精度的配基设计。在前期采用一些计算速度快但精度有限的方法以富集可能的候选分子，如分子对接法。随后再采用MD模拟等计算量大但更精确的方法进一步挑选最佳的配基分子。在后期阶段则采用比较耗时和高成本的实验方法做最后验证。
发明内容
本发明的目的在于提出一种基于蛋白A亲和模型构建免疫球蛋白G的新型亲和配基多肽库及设计方法的应用。本发明所述的抗体亲和短肽配基的仿生设计方法是首次建立的，并经验证是有效的。本发明基于蛋白A亲和模型构建免疫球蛋白G的新型亲和配基多肽库，其依据为6个SpA关键残基F132、Y133、H137、E143、R146和K154。为了配基的固定，在多肽序列中间位置添加一个半胱氨酸。该肽库共有以下8种序列FYCHXXXE、FYXHCXXE、FYCHXXR、FYXHCXR、FYXCRXE、YFXCRXE、HXYFCXR 和 HXYFCXK ；其中X代表除去半胱氨酸以外的19种氨基酸。
本发明的新型的亲和多肽设计方法的应用，是在上述肽库的基础上，进一步利用氨基酸定位方法，确定X所代表的氨基酸种类。X所代表的氨基酸种类如下表所示
权利要求
1.基于蛋白A亲和模型构建免疫球蛋白G的新型亲和配基多肽库，在多肽序列中间位置添加一个半胱氨酸Cys的方法，其特征是一共有以下8种序列FYCHXXXE、FYXHCXXE、FYCHXXR、FYXHCXR、FYXCRXE、YFXCRXE、HXYFCXR 和 HXYFCXK ；其中X代表除去半胱氨酸以外的19种氨基酸。
2.如权利要求1所述的多肽库，其特征是构建依据为6个SpA关键残基F132、Y133、 H137、E143、R146 和 K154。
3.以权利要求1和2所述的构建多肽库的设计方法的应用，其特征是在肽库的范围内，利用氨基酸定位法构建候选多肽分子库。
4.如权利要求3所述的设计方法的应用，其特征是根据方法应用得到如下的候选多肽分子库
5.如权利要求4所述的设计方法的应用，其特征是将候选多肽库包含的多肽分子进行分子对接筛选、均方根偏差比较以及分子动力学模拟复筛，获得有可能与hlgG具有较高亲和性的多肽配基FYffHCLDE、FYFCRffE、FYIHCLPE、FYYHCKKE、FYCHWALE、FYCHWQDE、FYCHTIDE、 FYRHCQRE、FYCHHKTE、FYCHLQKE、FYCHRKAE、FYCHNQDE、FYCHRQEE 和 FYNHCASE。
全文摘要
本发明公开了一种基于蛋白A亲和模型构建免疫球蛋白G的新型亲和配基多肽库及设计方法的应用。根据分子力学/泊松-波尔兹曼溶剂可及表面积方法，在已有的人IgG-蛋白A复合物结构的基础上解析获得与人IgG具有较高亲和作用的蛋白A的关键残基，并构建了蛋白A简化亲和模型，在此基础上构建了IgG的亲和多肽分子库。在肽库的基础上，进一步利用氨基酸定位方法，确定X所代表的氨基酸种类。然后，应用分子对接和分子动力学模拟手段逐步筛选候选多肽。最后，通过亲和色谱实验方法，确定能有效分离纯化IgG的多肽亲和配基。
文档编号C07K7/06GK103014880SQ20121056181
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者孙彦, 赵韦韦, 刘夫锋, 史清洪 申请人:天津大学