具有可控的表面修饰与功能化的稳定的胶体金纳米颗粒的制作方法
【专利摘要】在本发明中公开了用于制备稳定的裸胶体金纳米颗粒的方法。随后可使纳米颗粒经受部分或全部表面修饰。所述方法包括使用块体金作为源材料通过采用自顶向下的纳米制造方法制备处于液体中的胶体金纳米颗粒。通过添加一种或多种类型的配体（每种都包含对金纳米颗粒表面表现出亲和力的官能团以产生缀合体）来进行这些纳米颗粒的表面修饰。由于通过这种方法制备的纳米颗粒的高效率和优异稳定性，所制造的金纳米颗粒缀合体可具有功能性配体的可调整为0和100％之间的任何百分比值的表面覆盖率。
【专利说明】具有可控的表面修饰与功能化的稳定的胶体金纳米颗粒
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于自顶向下制造稳定的胶体金纳米颗粒的方法和通过所述方法制备的稳定的胶体金纳米颗粒的表面修饰和/或功能化。
【背景技术】
[0002]胶体金是金纳米颗粒在分散介质中的分散体，所述分散介质通常为水但还可使用如下面所讨论的其它介质。由于其独特的物理、化学和表面性质如:(i)取决于尺寸和形状的强烈光学消光和散射，其从紫外辐射(UV)波长一直到近红外(NIR)波长为可调的；(ii)用于与功能性配体缀合的大表面区jP(iii)在体内很少或没有长期毒性或其它不利的影响，使它们在生命系统中接受程度高，因此一个世纪以来金纳米颗粒已经吸引了科学家的大量兴趣。胶体金纳米颗粒，在本说明书和权利要求书中也称为金纳米胶体，现正被广泛研究其在各种各样的生物和医学应用中潜在的用途。应用包括作为成像剂、感应剂、基因调节剂、定向给药载体和在光响应性疗法中的使用。在胶体金用于应用前，这些应用中的大部分需要胶体金经历表面修饰(在本发明的说明书和权利要求中也称为表面功能化)。
[0003]目前，通过使用标准的湿化学柠檬酸钠还原四氯金酸(HAuCl4)方法制备绝大部分的金纳米胶体。这种方法导致合成了用带负电荷的柠檬酸根离子封盖(capped)或覆盖的具有5-200nm直径的球形金纳米颗粒。通过提供静电斥力，柠檬酸根离子封盖防止了纳米颗粒聚集。一旦形成并且在它们用于生物和医学应用前，就通常通过功能性配体分子与纳米颗粒的表面的缀合，用柠檬酸钠封盖的金纳米颗粒必须经历进一步的表面功能化。
[0004]用于形成胶体金的其它湿化学方法包括Brust法、Perrault法和Mart in法。Brust法依赖于氯金酸与甲苯中的四辛基溴化铵和硼氢化钠的反应。Perrault法使用氢醌来还原包含金纳米颗粒种子(seed)的溶液中的HAuCl415Martin法利用由NaBH4还原水中的HAuCl4,其中稳定剂HCl和NaOH以精确比例存在。所有的湿化学方法都依赖于首先用强酸将金(Au)转换成原子式HAuCl4，然后使用这种原子式在自下向上型的过程中积累纳米颗粒。所有的方法都需要稳定剂的存在以防止金纳米颗粒聚集并且从溶液沉淀。一旦形成稳定的纳米颗粒，在纳米颗粒可用于它们许多潜在的应用前还必须进行表面功能化。这些表面修饰还不能导致金纳米颗粒的胶体悬浮和沉淀的不稳定。已发现配体交换反应是用于包括金纳米胶体的各种无机胶体纳米颗粒的表面修饰的特别有力的方法，并且它们被广泛用于制备具有各种芯部材料和官能团的有机和水溶性纳米颗粒。
[0005]进行包括胶体金颗粒的配体交换反应的最困难的方面之一是在反应期间保持金的胶体悬浮液的稳定。如大量的报道协议Woehrle, G.H.，Brown, L.0.，和Hutchison, J.E., J.Am.Chem.Soc., Vol.127 (2005), 2172-2183 ；Liao, H.,和 Hafner J.H., Chem.Mater., Vol.17 (2005), 4636-4641 ；0jea-Jimenez, 1.和 Puntes, V., J.Am.Chem.Soc.,Vol.131(2009)，13320-13327所反映的，为了确保完成配体交换反应并且为了避免金纳米颗粒的沉淀，如参考金表面上的配体覆盖区(footprint)的文献值发现的,在纳米颗粒的表面上通常有必要使用比形成单层所需的量非常大的过量，有时候超过10倍过量的配体。在金纳米胶体中留下过量的未反应的游离配体是不期望的，因为它可能会干扰或改变所形成的金纳米颗粒缀合体的预期功能。然而，移除过量的游离配体而不引起聚集或导致金纳米颗粒缀合体的明显损失是不容易的。当从湿化学制备的胶体金开始时，产生具有多于一种类型的与之结合的配体的金纳米颗粒也是非常困难的。因为必须以这样大的过量即通常超过基于覆盖区分析形成单层所需的量1000%的过量添加配体，所以用目前的胶体金系统不可能制备要么每个纳米颗粒具有确定数目的配体(这对于许多应用和基础研究是有益的)，要么具有多种配体的金纳米颗粒。最后，由于缀合效率低，因而配体交换反应不是用于将珍贵的生物分子如适体或载体缀合至金纳米颗粒上的好方法。
[0006]在本发明中，我们提供了自顶向下的制造方法以解决上述问题。在本说明书和权利要求书中，自顶向下的制造方法是指这样一种方法，其从液体中的块体材料而不是如在湿化学法中的原子形式的金开始，并且在液体中制造稳定的胶体纳米颗粒悬浮液。在本发明的一种优选的自顶向下的方法中，所述方法从液体中的块体金材料开始并且在胶体金悬浮液中制备纯净、裸露、稳定的金纳米颗粒。所制备的纳米颗粒是裸露的，因为所述方法不需要任何稳定剂，也不涉及任何柠檬酸还原。所制备的金纳米颗粒可经历表面修饰并且可通过修饰配体将表面覆盖量调节为0-100%的任何百分比值。所述方法还使我们制造了与具有不同功能例如传感、成像、改善溶解性和防止非特异性结合的多种类型的配体缀合的金纳米颗粒。所述方法不需要大量过量的配体来防止金纳米颗粒的聚集，因此适合使用供应不足或非常昂贵的配体。由于纳米颗粒都是裸露的，因而缀合反应不涉及如现有技术方法中的稳定剂如柠檬酸盐的任何竞争或取代。因此，对于金纳米颗粒即使是具有低亲和力的配体也可用于缀合反应。
【发明内容】
[0007]本发明涉及一种用于制备具有在至少一个尺寸上为1-200纳米的尺寸的稳定裸金纳米胶体的方法，可以使用一种或多种配体使所述金纳米胶体经受部分或全部表面修饰以用于生物、医疗和其它应用。
[0008]一方面，本发明涉及包含以可控制的表面覆盖率与至少一种配体缀合的金纳米颗粒的稳定的化学或生化试剂。
[0009]另一方面，本发明涉及包含与两种或更多种不同的配体缀合的金纳米颗粒的稳定的化学或生化试剂。
[0010]又一方面，本发明还提供了一种通过利用在硫醇化聚乙二醇(PEG)与纳米颗粒缀合期间吸光度的变化来表征胶体金纳米颗粒的表面化学性质的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1示意性地示出了用于根据本发明自顶向下制备处于液体中的金纳米颗粒的基于激光的烧蚀系统；
[0012]图2示出了通过湿化学法制备的具有20纳米的平均颗粒直径的可商购的柠檬酸盐-封盖的金纳米颗粒制剂的UV-Vis吸收光谱；
[0013]图3A示出了根据本发明通过在去离子水中激光烧蚀块体金靶制备的稳定的裸胶体金制剂的UV-Vis吸收光 谱，图3B示出了在插图中的稳定的裸胶体金制剂的透射电子显微镜(TEM)图片和根据 本发明形成的稳定的裸胶体金纳米颗粒的颗粒尺寸分布的柱状图；
[0014]图4A示出了与不同量的硫醇化聚乙二醇(PEG)混合的可商购的胶体金颗粒的UV-Vis吸收光谱，图4B示出了根据本发明与不同量的硫醇化PEG混合而制备的胶体金的UV-VIS吸收光谱；
[0015]图5A示出了源自图4A和图4B的数据，以图表形式说明在与硫醇化PEG表面功能化期间通过监测在520nm处金纳米胶体的局部表面等离振子共振的吸光度变化来表征的金纳米颗粒的胶体稳定性，图5B示意性地示出了根据本发明制备的金纳米颗粒的表面上硫醇化PEGO % -100%的表面覆盖率；
[0016]图6A示出了在1% NaCl的存在下根据本发明在硫醇化PEG与金纳米颗粒的不同比例下制备的聚乙二醇化金纳米颗粒的胶体稳定性，所述胶体稳定性由在520纳米处金纳米颗粒的局部表面等离振子共振的吸光度表征；
[0017]图6B示出了通过根据本发明在硫醇PEG与金纳米颗粒(NP)的不同比例下制备的聚乙二醇化金纳米颗粒的动态光散射(DLS)测量的尺寸增长；
[0018]图7A示出了若丹明(Rhodamine)标记的PEG与根据本发明制备的Au纳米颗粒的各种混合物的荧光光谱，并且图7B示出了这些混合物在570nm处的荧光强度与混合溶液中若丹明标记的PEG分子的数目与Au纳米颗粒的数目之间的初始输入比的函数关系；
[0019]图8示出了以下从顶部迹线到底部迹线的硫醇化PEG20kDa、原始的柠檬酸盐封盖的BBI Au纳米胶体溶液、聚乙二醇化的BBI Au纳米胶体溶液、聚乙二醇化的Au纳米胶体溶液的傅立叶变换红外光谱法(FTIR)光谱，其中根据本发明制备胶体金纳米颗粒，虚线表示硫醇化PEG20kDa的特征峰；和
[0020]图9示出了通过监控在520nm处金纳米胶体的局部表面等离振子共振的吸光度变化，根据本发明制备的胶体金纳米颗粒在不同量的柠檬酸盐的存在下与硫醇化PEG的表面修饰期间的胶体稳定性。
【具体实施方式】
[0021]一个世纪以来金纳米胶体已经吸引了科学家浓厚的兴趣，并正被广泛研究其在各种各样的医学和生物应用中潜在的用途。例如，潜在的用途包括表面增强光谱、生物标记和检测、基因调节和用于治疗人类癌症的诊断或治疗试剂。它们在广泛的应用中的多功能性源自它们独特的物理、化学和表面性质如:(i)由于在通过电磁场激发时它们的自由电子的局部表面等离振子共振，在可见光和近红外(NIR)波长处的取决于尺寸和形状的强烈光学消光和散射；(ii)用于与功能性配体缀合的大表面区jP(iii)在体内很少或没有长期毒性或其它不利的影响，使它们在生命系统中接受程度高。
[0022]从原子或块体相似物不可获得的这些新的物理、化学和表面性质解释了为什么没有简单地选择金纳米胶体作为基于分子的系统的替代品而是作为在生物和医疗应用中提供显著优点的新颖结构。
[0023]正如上面所讨论的，通过标准的柠檬酸钠还原反应制备了绝大部分的金纳米胶体。这种方法允许合成用带负电荷的柠檬酸根离子封盖的具有5-200nm直径的球形金纳米颗粒。就速率、最终尺寸、几何形状而言，封盖控制了纳米颗粒的生长并且通过静电斥力使纳米颗粒稳定而不聚集。[0024]虽然这种湿化学制备的金纳米胶体在合成态溶液中可稳定多年，但是在盐的存在下它们立刻不可逆地聚集。在提高的盐浓度的存在下，屏蔽了源自柠檬酸盐的静电斥力并且金纳米颗粒可容易地彼此靠近得足以处于范德华力的范围内，这将引起纳米颗粒团聚。因此，合成态柠檬酸盐-封盖的金纳米胶体在恶劣的生物环境中如在强酸、强碱、或浓缩盐的存在下是不稳定的，因此在生物和医学领域中它们不适合于上面提到的应用。
[0025]对于它们预期的生物和医学应用中的大部分前提是，通过功能性配体分子与金纳米颗粒的表面缀合将合成态柠檬酸盐-封盖的金纳米颗粒进一步表面修饰。对于任何生物或医学应用，出于至少两个原因金纳米颗粒的表面功能化是重要的。首先是对纳米颗粒与它们的环境相互作用的控制，这在纳米颗粒表面处是自然发生的。适当的表面功能化是在生理条件下提供纳米颗粒的稳定性、溶解性、以及物理和化学性质的保持性的关键步骤。第二，配体分子向芯部金纳米颗粒中固有发现的那些提供了其它和新颖的性质或功能。这些缀合的金纳米颗粒汇集了芯部材料和配体壳体两者的独特性质和功能，用于实现金纳米颗粒闻度特异性祀向所关注的位点、超灵敏检测和有效治疗的目标。
[0026]现在，用于无机胶体纳米颗粒的表面修饰的主要策略包括配体交换、配体修饰和额外的涂层。在这些策略中已证明配体交换反应是将功能纳入纳米颗粒上特别有力的方法，并且被广泛地用于制备具有各种芯部材料和官能团的有机纳米颗粒和水溶性纳米颗粒。在配体交换反应中，纳米颗粒的表面上原始的配体分子与其它配体交换以向纳米颗粒提供新的性质或功能。在大多数情况下，进入的配体分子比离开的配体与纳米颗粒表面结合更加强烈，这允许在反应期间保持纳米颗粒的胶体稳定性。原则上，虽然通过理论这很好理解和说明，但是涉及纳米颗粒的配体交换反应的完整范围、精确过程和微观属性尚未确定并且仍需研究和讨论。这些反应是复杂的，因为纳米颗粒、缀合配体、添加剂、源自纳米颗粒合成的残余物和溶剂的属性均在 配体交换反应中发挥重要作用。
[0027]带着优化这样的方法的目的，广泛地研究了影响通过经由配体交换反应的湿化学法制备的金纳米胶体的表面功能化的因素。不同的化学官能团如硫醇、胺和膦对金纳米颗粒的表面具有高亲和力。认为硫醇显示了对金表面最高的亲和力约为200kJ/mol，因此通过使用具有通过硫醇-Au键与金纳米颗粒的表面结合的硫醇基团的配体分子，发生了大部分的金纳米颗粒的表面功能化。
[0028]与现有的使用湿化学法的自底向上制造方法相比，本发明通过自顶向下的纳米制造方法制备了金纳米胶体。本发明的自顶向下的制造方法从液体中的块体材料开始，然后通过对材料施加物理能量而在液体中将块体材料破碎成纳米颗粒。物理能量可为机械力、热、通过电弧放电的电场能、磁场能、离子束能、电子束能或块体材料的激光烧蚀。本发明的方法制备了纯净、裸露和稳定的胶体金，这避免了残留的化学前体、稳定剂和还原剂的湿化学问题。
[0029]本发明允许制备只有部分待制造的表面修饰的稳定金纳米胶体，其中通过对金表面具有一定亲和力的官能团，缀合体配体分子直接与金纳米颗粒的表面结合。此外，本发明允许稳定的金纳米颗粒缀合体具有直接结合到其待制造的表面的一种或多种不同的功能性配体。此外，可将制造的金纳米颗粒缀合体的表面上功能性配体的表面覆盖量调整为O和100%之间的任何百分比值。所有这些独特的性质是可获得的，因为本发明制备了在液体中是稳定的裸金纳米颗粒，产生它们无需稳定剂。[0030]在用于金纳米颗粒的表面功能化的分子中，聚乙二醇(PEG)或更具体地硫醇化聚乙二醇(SH-PEG)是较重要并且广泛使用的物质之一。如在本说明书中其它地方所讨论的，通常通过在与适体连接的硫醇官能团处结合，许多其它的配体可用于使本发明的包括适体的胶体金制剂功能化。
[0031]PEG是由-CH2-CH2-O-的重复单元组成的线型聚合物。取决于分子量，相同的分子结构也被称为聚(环氧乙烷)或聚氧乙烯。该聚合物在许多有机溶剂中以及在水中是非常易溶的。在缀合到金纳米颗粒的表面上后，为了使熵最大化，PEG链具有折叠成卷或弯曲成具有远大于具有相应分子量的蛋白质的直径的蘑菇状结构的高倾向。用PEG表面修饰金纳米颗粒通常被称为“聚乙二醇化”，并且在本说明书和权利要求书中PEG与金纳米颗粒的结合将被称为聚乙二醇化。由于通过在相互作用的金纳米颗粒之间提供硬脂酸屏障(stearicbarrier),金纳米颗粒的表面上的PEG层可有助于稳定水环境中的金纳米颗粒,聚乙二醇化的金纳米颗粒在高盐浓度下是更加稳定的。
[0032]另外，已知PEG中的乙二醇官能团与水分子相互作用良好并且因而当将PEG分子缀合到金纳米颗粒的表面上时，PEG链之间的空间可吸引水分子以产生围绕金纳米颗粒的水分子亲水层。这导致具有较少“黏性”的惰性亲水表面，这在通过基于增强渗透和保持机制的被动靶向或在靶向部分和执行其预期功能的协助下的主动靶向而到达它们所关注的靶向位点前，防止聚乙二醇化的金纳米颗粒被来自全身血液循环的人体网状内皮系统(RES)识别和消除。PEG链还提供了用于向根据本发明制备的聚乙二醇化的金纳米颗粒添加其它定位或信号发送功能的反应性位点。这些反应性位点可用于结合用于检测和信号发送功能的荧光标记物。
[0033]由于聚乙二醇化是目前增强金纳米颗粒的稳定性和溶解性、延长循环时间、使非特异性结合最少化并改善对所关注的位点的特定靶向的非常有效的手段，因此下面公开了根据本发明制备的金纳米颗粒与SH-PEG的缀合作为这些金纳米颗粒的表面修饰的一个实例。然而，所讨论的策略和本发明的金纳米颗粒与SH-PEG缀合的结果具有通用属性，并以同样的方式应用到包含对金表面表现出亲和力的至少一种官能团的其它配体分子与这些纳米颗粒的结合。
[0034]本发明中的第一步骤是发现可通过在没有稳定剂的悬浮介质中原位的自顶向下的制造方法产生裸金纳米颗粒的稳定的胶体悬浮液。胶体金颗粒在518-530纳米(nm)的波长范围内表现出吸收峰。如应用至根据本发明制备的胶体金制剂的术语“稳定”意味着在储存时由裸胶体金制剂的局部表面等离振子共振引起的吸收强度变化不超过如明显地在相同浓度下制备裸胶体金制剂后立即测量值的正或负10%。通常，如果胶体金制剂变得不稳定，随着时间的推移，金纳米颗粒开始聚集并且从悬浮液沉淀，从而导致在518-530nm处的吸光度降低。此外，“稳定”意味着在2纳米或更小的局部表面等离振子共振中存在最小的红移或变化。如应用至根据本发明制备的胶体金纳米颗粒的术语“裸”或“裸露”颗粒是没有表面修饰或除了如在液体中 所描述的产生以外的处理的纯金。裸金纳米颗粒也没有在任何稳定剂的存在下，它们仅仅是处于不包含任何纳米颗粒稳定剂如柠檬酸盐的制备液中。本发明的方法优选包括:形成裸纳米颗粒；然而如果需要，这并不排除使用稳定剂如柠檬酸盐。本发明的一个独特的方面是，这样的稳定剂的存在虽然可容忍但不是需要的。所有以前的方法需要使用稳定剂和表面活性剂，并且在本说明书中讨论了与这一要求相关的问题。沉淀在液体中发生是必要的，使得随着产生纳米颗粒而形成胶体悬浮液。通过首先产生干燥的粉末状金纳米颗粒然后将它们添加至悬浮介质并预期产生胶体金是不可能产生胶体金的。不添加一种或多种表面活性剂或其它稳定剂如在上述的湿化学成形方法中使用的，干燥的金纳米颗粒粉末将不在悬浮介质中分散。只有通过遵从本发明的方法，才能原位制备稳定的裸金纳米颗粒胶体。可用于本发明中的自顶向下的纳米制造方法有很多种。然而，都需要在悬浮介质的存在下发生由块体材料产生纳米颗粒。在一种实施方案中，所述方法包括一步法，其中在悬浮介质中发生将物理能量源如机械能、热、电场能即电弧放电、磁场能、离子束能、电子束能、或激光能施加至块体金。块体源处于悬浮介质和所施加的物理能量中，因此产生的纳米颗粒随着它们的形成而立即悬浮在悬浮介质中。在另一种实施方案中，本发明是两步法，其包括以下步骤:1)通过使用如本领域已知的光、电子束、聚焦离子束、纳米压印或纳米球平板印刷在基材上制造金纳米颗粒阵列；和2)使用物理能量方法之一将金纳米颗粒阵列从基材移除至悬浮液中。Tabor，C.，Qian, ff.，和El-Sayed, M.A., Journal of Physical Chemistry C, Vol111(2007), 8934-8941 ；Haes, A.J.; Zhao, J.; Zouj S.L ; Own, C.S.; Marks, L D.; Schatzj G.C.; Van Duynej R.P.Journal OfPhysical Chemistry B，Voll09 (2005)，11158。在这两种方法中使用物理能量方法之一通过在悬浮介质中产生纳米颗粒来原位形成胶体金。
[0035]在本发明的至少一种实施方案中，通过在作为悬浮介质的去离子水中块体金靶的脉冲激光烧蚀来制备金纳米胶体。图1示意性地示出了用于根据本发明使用脉冲激光烧蚀制备复杂化合物的纳米颗粒的胶体悬浮液如液体中的金的基于激光的系统。在一种实施方案中，激光束I由超快脉冲激光源产生(未示出)并且由透镜2聚焦。激光束I的来源可为脉冲激光或如下面所讨论的提供合适的脉冲持续时间、重复频率、和/或功率水平的其它激光源。随后，聚焦 的激光束I从透镜2通往用于引导激光束I的导向机构3。或者，可将透镜2放置在导向机构3与块体材料的靶材4之间。导向机构3可为本领域中已知的任何导向机构，包括压电镜、声光反射器、旋转多边体、振动镜或棱镜。优选地，导向机构3为能够使激光束I受控制且快速的运动的振动镜3。导向机构3将激光束I引导至祀材4。在一种实施方案中，靶材4是块体金靶。将靶材4浸没至悬浮液5的表面以下从几毫米到优选小于I厘米的距离。将靶材4放置在容器7中，容器7另外但不必要在其顶部具有可移动的玻璃窗口 6。任选地,将O形环式密封件8放置在玻璃窗口 6与容器7的顶部之间，以防止液体5从容器7中泄漏。另外但不必要的，容器7包括进口 12和出口 14，以便液体5可在靶材4上方通过并且因而可重新循环。将容器7任选地放置在可产生具有靶材4和液体5的容器7的直线运动的移动平台9上。液体5流用于将由靶材4产生的纳米颗粒10带出容器7作为胶体悬浮液而收集。靶材4上方的液体5的流动还冷却了激光焦点体积。液体5可为对激光束I的波长在很大程度上为透明的任何液体，并且充当用于靶材料4的胶体悬浮介质。在一种实施方案中，液体5是具有大于0.05M0hm.cm、并且优选大于IMOhm.cm的电阻率的去离子水。因此，该系统允许在悬浮液中原位产生胶体金纳米颗粒，从而形成胶体金悬浮液。形成的金纳米颗粒立即稳定地悬浮在液体中，并且因而不需要分散剂、稳定剂、表面活性剂或其它材料来维持胶体悬浮液处于稳定状态。该结果是出人意料的，并允许产生包含裸金纳米颗粒的独特胶体金悬浮液。
[0036]通过块体金靶材在去离子水中的脉冲激光烧蚀使用以下激光参数制造金纳米胶体:脉冲能量为IOuJ (微焦耳)，脉冲重复频率为100kHz，脉冲持续时间为700飞秒并且烧蚀靶材上的激光点尺寸为约50 μ m (微米)。对于根据本发明的Au纳米胶体的制备，使用来自AlfaAesar的16mm (毫米)长、8mm宽和0.5mm厚的矩形的Au祀材。为方便起见，可将Au靶材料附接至较大片的块体材料如玻片、另一种金属基材或Si基材。
[0037]更通常地，对于本发明激光烧蚀参数如下:脉冲持续时间为约10飞秒至约500皮秒，优选为约100飞秒至约30皮秒；脉冲能量为约I μ J至约100 μ J ;脉冲重复频率为约IOkHz至约IOMHz ;并且激光点尺寸可小于约100 μπι。靶材料在至少一个尺寸上具有大于在靶材料的表面处的激光点的点尺寸的尺寸。
[0038]通过一些可商购的分析仪器和技术表征胶体金纳米颗粒的两种样品，包括UV-VIS吸收光谱、动态光散射(DLS)、透射电子显微镜法(TEM)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)。一种样品是可商购的湿化学制备的柠檬酸盐-封盖的胶体金制剂，并且第二个样品是根据本发明制备的胶体金。用Shimadzu UV-3600UV-VIS-NIR分光光度计记录UV-VIS吸收光谱。使 用 Nano_ZS90Zatasizer (Malvern Instrument, ffestborough, MA)进行 DLS 测量。在配有ATR-金刚石的PerkinElmer spectrumlOOFT-1R光谱仪上记录红外光谱。在IOOkV的加速电压下使用透射电子显微镜(TEMJE0L2010F，Japan)显现金纳米颗粒。在室温约25°C下进行所有的测量和方法。
[0039]图2显示了通过湿化学法制备的具有20nm的平均颗粒直径的可商购的柠檬酸盐封盖的球形金纳米颗粒胶体制剂(指定为BBI Au纳米胶体)的UV-VIS吸收光谱。从TedPella Inc.，Redding, CA购买该样品并且使用该样品无需进一步纯化。如可看出的该Au纳米胶体的局部表面等离振子共振的最大值在520nm处。
[0040]图3A示出了根据本发明通过在去离子水中激光烧蚀制备的稳定的裸胶体金纳米颗粒制剂的UV-VIS吸收光谱。根据本发明的胶体金纳米颗粒制剂的局部表面等离振子共振的最大值与BBI Au纳米胶体的最大值相同，都在520nm处。图3B示出了如来自插图所示的TEM图像测量的超过300个颗粒的样品的费雷特(Feret)直径的柱状图。通过测量来自有代表性的TEM图像的超过300个纳米颗粒的芯部尺寸，确定本发明的胶体金制剂中的纳米颗粒的平均费雷特直径为20.8nm，这非常接近BBI Au纳米胶体。
[0041]根据本发明制备的胶体金的形状、尺寸和光学性质与BBI Au纳米胶体的那些相同。因此，与通过湿化学法制备的金纳米颗粒相比，由本发明使用脉冲激光烧蚀接着聚乙二醇化所产生的金纳米颗粒的胶体稳定性观察到的显著改进(将在下面显示)应该不是由尺寸、形状或光学性质的差异所致的。
[0042]使用来自Sigma Aldrich产品编号63753-250MG的具有20千道尔顿(kDa)的分子量的硫醇化PEG (SH-PEG)，无需进一步纯化。通过将不同量的硫醇化PEG添加至胶体金样品中来进行金纳米颗粒的聚乙二醇化。通过使它们测量的消光(uv - vis)光谱数据与20nmAu颗粒的消光系数(8X IO8mOr1CnT1)相关联而确定的在混合溶液中具有20kDa的分子量的硫醇化PEG分子的数目与Au纳米颗粒的数目的最终比例从10变化至4000。混合后，在室温下将各溶液保持原状至少24小时，以在表征Au纳米颗粒在聚乙二醇化下的胶体稳定性之前提供用于通过Au-硫醇结合将PEG分子缀合到Au纳米颗粒表面上的足量时间。
[0043]通过测量UV-VIS吸收光谱评价在聚乙二醇化下的两种胶体Au纳米颗粒制剂的胶体稳定性，这被认为是最合适的方法，因为制剂在约520nm处存在Au纳米颗粒的强烈的局部表面等离振子共振。在聚乙二醇化下金纳米颗粒的聚集和/或沉淀将由在约520nm处吸收的减少来反映。
[0044]图4A和4B显示了在与不同浓度下的硫醇化PEG混合然后使其静置至少24小时后的各种金纳米胶体的UV-Vis吸收光谱。图4A是使用湿化学BBI Au纳米胶体的样品，并且图4B是使用根据本发明制备的Au纳米胶体的样品。图4A和4B之间的差异是非常明显的。对于BBI Au纳米胶体的聚乙二醇化，取决于PEG分子的数目与Au纳米颗粒的数目的比例，在约520nm处的吸光度变化很大，从约为0.45的对照值的减少表示颗粒的聚集/沉淀。与BBI Au纳米胶体相比,对于根据本发明制备的Au纳米胶体的聚乙二醇化,与充当对照样品的未添加PEG的Au纳米胶体相比，与不同量的硫醇化PEG混合诱发了光谱中可忽略的变化。根据本发明制备的聚乙二醇化的Au纳米胶体的所有光谱几乎与对照样品相同。在所有这些样品的光谱中没有可检测的红移或局域表面等离振子共振的减少。在约520nm处缺乏强度的任何损失揭示了在聚乙二醇化过程期间根据本发明制备的胶体金的优异胶体稳定性。
[0045]在图5A中总结了图4A和4B中显示的实验结果，其中各样品在520nm处的吸光度表示为没有聚乙二醇化的各自的对照样品的百分比。实心正方形是BBI Au纳米胶体样品并且实心星形是根据本发明制备的Au纳米胶体。BBI样品的数据表明:只要你一启动添加硫醇化PEG，胶体金就开始沉淀并且继续直至在每个AU纳米颗粒200个硫醇化PEG的比例下你完成沉淀。从每个Au纳米颗粒500个硫醇化EPG到每个Au纳米颗粒2000个硫醇化EPG，沉淀量开始降低并且最终吸光度回到没有PEG的水平。通过对比的方式，对于根据本发明制备的胶体金，与对照样品相比在PEG分子与Au分子的任意比例下在520nm处的吸光度没有显著改变。因此，在聚乙二醇化过程期间从根据本发明制备的胶体金没有沉淀纳米颗粒。这表明与以前的湿化学胶体金相比通过本发明的方法制备的胶体金所提供的另一个显著的优点。
[0046]由于在聚乙二醇化期间配体交换反应的基本机制非常复杂，因而并不清楚为什么在BBI Au纳米胶体的聚乙二醇化期间发生不可逆的聚集/沉淀。一种可能的解释可为在配体交换反应期间原始的表面活性剂柠檬酸根离子离开纳米颗粒表面的时间与纳米颗粒与新表面活性剂硫醇化PEG结合的时间之间存在时间间隙。如果这个时间间隙与进入的新表面活性剂的浓度成反比，则提高进入的新表面活性剂的浓度将缩短该时间间隙，这将降低纳米颗粒聚集的可能性。这可以解释随着硫醇化PEG分子的浓度增加观察到BBI Au纳米胶体的胶体稳定性的恢复。
[0047]由于在根据本发明制备的胶体金的聚乙二醇化期间完美地保持了胶体稳定性，因而该方法允许制备在其上具有确定数目(以从1%或更少到对于在金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的数目的量的缀合的PEG分子的稳定的聚乙二醇化的Au纳米胶体。图5B示意性地示出了在金纳米颗粒的表面上0% -100%的硫醇化PEG的表面覆盖率。将所述颗粒理想化为光滑的球体，并且每一个示意的PEG图不仅仅代表单一的PEG分子而且代表一组PEG分子。
[0048]使用硫醇化PEG分子作为用于描述根据本发明制备的胶体金中表面修饰的分子与金纳米颗粒缀合的实例。事实上，可将包含对金表面表现出亲和力的至少一种官能团如硫醇基团、胺基团或膦基团的任何功能性配体与使用上面描述的方法制备的金纳米颗粒的表面缀合。该方法允许制备具有部分或全部表面修饰的稳定的金纳米胶体，并且可将金纳米颗粒表面上配体的表面覆盖率调整为O和100%之间的任何百分比值。
[0049]可确定在具有20nm的平均直径的根据本发明制备的胶体金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的硫醇化PEG20k的数目。由于电荷屏蔽效应，通过本发明的方法和通过湿化学法两者制备的合成态金纳米胶体在提高的盐浓度下将形成聚集体。在高水平的NaCl存在下通过在纳米颗粒之间提供硬脂酸排斥力，金纳米颗粒表面上的PEG分子层可改进金纳米颗粒的稳定性，并且当用PEG分子层完全涂覆Au纳米颗粒表面时该稳定性接近最大值。因此，监测根据本发明制备的聚乙二醇化的胶体金纳米颗粒在NaCl存在下的稳定性可用于确定在金纳米颗粒表面上形成完整的单层所必要的PEG分子的最小量。在为40-5000的硫醇化PEG与金纳米颗粒的比例存在下,使根据本发明制备的胶体金纳米颗粒的样品聚乙二醇化。将NaCl添加到每个样品至最终浓度为I重量％ (1%)，以引发聚集/沉淀。图6A显示了在520nm处聚乙二醇化的Au纳米胶体的吸光度,表示为不添加NaCl而获得的对照样品的百分比。显示聚乙二醇化的Au纳米颗粒的稳定性开始下降(表明聚集)，然后增加并且在为300的PEG/Au比例下接近最大值。提高每个Au纳米颗粒超过300到至多5000的PEG/Au比例并不进一步提高胶体悬浮液的稳定性。这表明在根据本发明制备的具有20nm的直径的裸金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的PEG分子的最小数目为 200-300。
[0050]还使用动态光散射(DLS)通过监测在聚乙二醇化后纳米颗粒的尺寸增加验证了在根据本发明制备的具有20nm的平均直径的胶体金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的硫醇化PEG20kDa分子的最小数目。随着更多的PEG分子缀合到其表面上，纳米颗粒长得更大。由于其广泛的可用性、样品制备和测量的简单性、Inm至约2μπι的相关尺寸范围测量、测量速度和对于流体出生(fluid-born)的纳米颗粒的原位测量能力，许多人认为使用DLS是用于测量平均纳米颗粒尺寸的标准方法。图6B显示了在硫醇PEG与Au纳米颗粒的指定比例下聚乙二醇化的根据本发明制备的胶体金纳米颗粒的实心圆形的总尺寸和实心星形的尺寸增长的结果。显示了总尺寸和尺寸的增长在为约300比I的PEG/Au比例下接近最大值，并且在高达这个数的约10倍的水平下使用PEG对增加纳米颗粒几乎没有额外的效果。再次，DLS测量证实了在根据本发明制备的具有20nm的平均直径的胶体金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的最小的PEG分子与Au的比例为200-300。该结果与如图6A所报道的使用1% NaCl的稳定性测试的结果一致。
[0051]第三种方法用于确定在根据本发明制备的胶体金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的硫醇化PEG分子的最小数目。再次，胶体金纳米颗粒具有20nm的平均直径。在该测量中，使用荧光标记的PEG分子。硫醇化PEG为IOkDa并且用若丹明将其标记。众所周知，金纳米颗粒猝灭来自与其表面结合的荧光分子的几乎所有荧光。因此，预期在若丹明标记的PEG与Au纳米颗粒的低比例下应存在非常少的荧光，因为它们将被结合并因此被猝灭。随着若丹明标记的PEG与Au纳米颗粒的比例增加，它应该到达存在游离的若丹明标记的PEG的点，因为Au纳米颗粒上所有的结合位点均被占用。在该比例下应该开始检测荧光。在该测量中在图7A中所示的一系列比例下将若丹明标记的PEG与根据本发明制备的胶体金纳米颗粒混合。图7A显示了与若丹明标记硫醇化PEGlOK分子缀合的金纳米颗粒的几种溶液的荧光光谱。可看出，如果初始输入的PEG/Au比例为每个Au纳米颗粒大于300个PEG，则仅从金纳米颗粒-若丹明标记的PEGlOk缀合体的溶液检测到荧光。该结果表明只有PEG/Au比例大于300，在溶液中才存在游离的未结合的PEG分子。当PEG/Au比例为200时我们没有观察到任何荧光，这表明添加至金纳米胶体的所有若丹明标记的PEGlOkDa分子与纳米颗粒的表面结合。在图7B中还绘制了对于所有的比例在570nm处的荧光峰值强度。再次，这表明直至比例为200-300才观察到荧光并且此后其呈线性增加。这再次证实了在具有20nm的直径的根据本发明制备的胶体金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的PEG分子的最小数目为200-300。
[0052]他人使用硫醇封端的寡核苷酸确定了金纳米颗粒的表面上的硫醇的覆盖区尺寸。Hill, H.D.，Millstone, J.E.，Banholzer, M.J.，和 Mirkin, C.A.，ACSNano, Vol.3 (2009)，418-424。覆盖区值取决于金纳米颗粒的直径。对于20nm的纳米颗粒尺寸，它为7.0+/-lnm2。因此，对于具有20nm的直径的球形金纳米颗粒，通过参考该文献值在金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的硫醇封端的分子的最小数目为约180+/-20，这非常接近来自上面描述的三个其它测量的结果。
[0053]如上所述用于确定在根据本发明制备的胶体金纳米颗粒的表面上形成完整的单层所必要的硫醇封端的分子的最小数目的所有这三种方法是重要的。对于其它配体可进行相同的方法以确定它们的覆盖区尺寸。已知该最小数目，可产生缀合反应:其中将表面覆盖量设置在0-100%的覆盖率的任何水平下从而使能够可调节缀合。可添加配体的混合物并且确定在最终缀合的Au纳米颗粒上应该出现的比例。此外，还可添加足够的配体以确保完全覆盖，而不具有以前需要的大量过量的配体。因此，对于使用非常稀有或昂贵的配体，该方法变得可行。优选地，如通过包括上面描述的那些方法的任何方法所确定的，在配体交换反应期间所使用的所有配体的总量不超过在根据本发明制备的Au纳米颗粒上形成完整的单层所需的量的200%以上，从而提供不大于200%过量的非缀合的游离配体。例如如果确定为300:1的初始配体与 Au纳米颗粒的比例提供完整的单层，则在配体交换反应中使用的所有配体的总量不超过900:1。优选地，过量的游离配体的量比在颗粒上形成单层所需的量大不超过20%。这允许可调的0-100%、优选1% -100%的配体覆盖率并且使用稀有或昂贵的配体。显然，由于用于覆盖的较大表面区，所需的初始比例将是具有需要较高的初始比例的较大颗粒的Au纳米颗粒的尺寸的函数。因此，本说明书还提供了用于确定Au纳米颗粒的这个面积的几种方法。
[0054]FTIR光谱也用于确认硫醇化PEG20kDa与胶体金纳米颗粒的表面的结合。如图8的顶部迹线所示，硫醇化PEG20kDa的FTIR光谱示出了一系列的峰并且图中的虚线显示在两种聚乙二醇化的样品中发现了这些相同的峰，但在原始的柠檬酸封盖的BBI Au纳米颗粒中没有发现。自顶向下的迹线如下:硫醇化PEG20kDa、原始的柠檬酸盐封盖的BBI Au纳米胶体溶液、聚乙二醇化的BBI Au纳米胶体溶液和聚乙二醇化的Au纳米胶体溶液，其中根据本发明制备胶体金纳米颗粒。在这个实验中，对于两种聚乙二醇化的样品PEG分子与Au纳米颗粒的比例均为2000比I。如图5A中的数据所示，这个比例足以确保如由在520nm处的吸光度测量的样品的总覆盖率和最大稳定性。根据本发明制备的聚乙二醇化的Au纳米胶体的FTIR光谱和聚乙二醇化的BBI Au纳米胶体的FTIR光谱之间的主要区别处于1500cm_1-1750cm_1的范围内。在这个范围内，根据本发明制备的聚乙二醇化的Au纳米胶体仅示出在约1661CHT1处的一个峰。然而，聚乙二醇化的BBI Au纳米胶体示出两个峰:一个峰在约1661CHT1处，并且另一个峰在约1584CHT1处，这是柠檬酸盐的特征峰。在原始的柠檬酸盐封盖的BBI Au纳米胶体的光谱中以大得多的水平看见在约1584CHT1处的相同的峰。该数据表明通过使用硫醇化PEG分子驱动至完成的配体交换反应不能完全移除BBI Au纳米颗粒上原始的柠檬酸盐表面活性剂。它还充当标记物用于识别非柠檬酸盐形成的Au纳米胶体例如根据本发明制备的，其为没有表面结合所制备的配体的裸纯Au纳米胶体。
[0055]还研究了在聚乙二醇化反应期间柠檬酸盐对根据本发明制备的胶体金纳米颗粒的胶体稳定性的影响。这通过监测在聚乙二醇化反应期间在520nm处的吸光度完成。如图4B和图5A所示，如果Au纳米颗粒的表面是裸露的(当根据本发明制备时它们是裸露的)，该吸光度应该有最小的变化。吸光度任何显著的减少表明Au纳米颗粒正在聚集，而显著的增加表明胶体稳定性的提高。在图9呈现的数据中，在I微摩尔(μΜ)-1毫摩尔(mM)的指定水平下在柠檬酸盐存在下进行聚乙二醇化。如所示的，在聚乙二醇化期间在PEG与Au纳米颗粒的低比例下所有测试水平的柠檬酸盐引起稳定性的降低。随着PEG与Au的比例增加，即使在最高水平的柠檬酸盐下仍最终恢复了稳定性。这表明基于硫醇基团的缀合可用于表征胶体金纳米颗粒的表面化学性质和/或通过改变含硫醇的配体的浓度并且测量UV-VIS吸收光谱的变化来检测胶体溶液中的化学添加剂或杂质的存在。使用硫醇化PEG生成数据，但预期其它的硫醇化配体显示类似的结果，尽管在光谱中的不同位置处光谱可具有吸收峰。
[0056]因为本发明允许制备裸露的稳定的胶体金纳米颗粒并且因为可以测量表面积从而确定对于0-100%的任何覆盖率所需的第一配体的量，所以根据本发明制备的胶体金纳米颗粒可用于使具有与第一配体不同的功能的第二类型的配体与相同的纳米颗粒缀合。因此，可通过采用该方案来制造与两种或更多种具有不同功能的不同配体缀合的稳定的胶体金纳米颗粒。
[0057]在本说明书描述的数据中，使用了硫醇化PEG20kDa分子或硫醇化的若丹明标记的PEGlOkDa分子，仅出于说明目的选择这些。本发明并不限于具有硫醇化PEG分子的使用。由于本发明制备了裸露的稳定的胶体金纳米颗粒，因此可使用具有可与Au颗粒表面结合的基团的任何配体如建议的硫醇、胺或膦基团。此外，由于Au纳米颗粒是裸露的，因此可使用甚至不常用的配体即对Au表面具有低亲和力的那些。这是因为本发明允许直接的配体结合，而不需要“交换”来发生。在稳定剂分子和所需的配体之间不需要具有竞争反应，整个金表面是自由的并且对于与配体结合为可获得的。这也使得根据本发明制备的胶体金纳米颗粒对用于结合适体和其它稀有或昂贵的配体是非常有吸引力的。适体可为如本领域已知的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或氨基酸序列。本胶体金还可用于与抗体、酶、蛋白质、肽和稀有或昂贵的其它报道材料或配体材料结合。配体可包括任何荧光标记物，其具有可与Au纳米颗粒缀合的基团或与该基团结合。这并不排除交换反应，但不同于湿化学制备的胶体金，其不是必要的反应。此外，具有不同的官能团和一个或多个臂和200Da-100, 000，OOODa的分子量的包含单官能、均官能、杂官能PEG的各种PEG分子也可用于表面修饰反应。在使用杂官能PEG的情况下,可使用于不用来与Au纳米颗粒结合的官能团例如羧基基团COOH和胺基基团NH2与其它配体上的其它官能团结合。对于待添加至Au纳米颗粒的其它功能，这打开了广泛的可能性。
[0058]与通过湿化学法制备的聚乙二醇化的胶体金纳米颗粒相比，由于使用根据本发明制备的纳米颗粒的聚乙二醇化过程的高效率和优异稳定性，通过本自顶向下的纳米制造方法制造的Au金纳米颗粒的聚乙二醇化将形成具有改进的生物相容性的金纳米颗粒缀合体。因此，预期它们具有较长的全身血液循环时间，这确保了将更多的这些纳米颗粒输送到所关注的目标位点用于成像、诊断、药物输送和疾病的光响应治疗。
[0059]在本说明书中，浓度一直在胶体Au纳米颗粒上，然而由于对于许多其它金属可使用聚乙二醇化方法，因此预期还可将本自顶向下的制造方法施加至其它金属，然后可使用本文所描述的方法将其部分或全部表面修饰。例如，金属和材料可选自但不限于Cr、Mn、Fe、Co、N1、Pt、Pd、Ag、Cu、硅、CdTe 和 CdSe0
[0060]本文所描述的表面修饰不限于仅对具有1-200纳米的直径的球形胶体Au纳米颗粒的应用。原则上，这种方法还适用于具有其它形状和结构(包括棒、棱镜、盘、立方体、核-壳结构、笼、骨架和框架)的胶体Au纳米颗粒，其中它们具有至少一个l_200nm的尺寸。此外，本发明所描述的表面修饰方法还适用于具有用金仅部分地覆盖的外表面的纳米结构。
[0061]虽然在其中液体为去离子水的实施方案中说明了所示的自顶向下的制造和表面修饰的方法，但是还可在其它液体中进行所描述的方法。例如，可在水、甲醇、乙醇、丙酮和其它有机溶剂中进行聚乙二醇化表面修饰。同样，在这些相同的液体和其它的液体中可发生胶体纳米颗粒形成的步骤。
[0062]可使用的除了 PEG以外的聚合物的实例包括聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸癸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、枝状聚合物(dentrimer)分子、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)^L酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚羟基丁酯(PHB)。
[0063]在至少一种实施方案中，通过在去离子水中块体金靶的激光烧蚀接着聚乙二醇化来制备胶体金纳米颗粒，并且通过FTIR光谱表征聚乙二醇化的产物，其中所述产物在1500cm-1和1750CHT1之间的范围内表现出单一可检测的峰。
[0064]在至少一种实施方案中，本发明包括一种制备具有表面修饰的稳定的胶体金纳米颗粒的方法，其包括以下步骤:使用块体金作为源材料，通过自顶向下的纳米制造方法制备金纳米颗粒在胶体悬浮液中的稳定的胶体金纳米颗粒制剂；通过将具有与金纳米颗粒结合的至少一种官能团的至少一种配体添加至胶体金纳米颗粒来进行金纳米颗粒的表面修饰，其中基于纳米颗粒上结合的配体的覆盖区，配体的总量不超过向全部裸金纳米颗粒提供结合的配体单层所需的量的三倍，并且将至少一部分量的配体与金纳米颗粒结合。
[0065]在至少一种实施方案中，本发明是包含金纳米颗粒和至少一种配体的胶体金纳米颗粒的溶液，所述配体具有至少一个对金纳米颗粒具有亲和力的官能团，并且其中金纳米颗粒是稳定的并分散在溶液中，并且其中基于纳米颗粒上结合的配体的覆盖区，所述配体以等于或小于与向全部裸金纳米颗粒提供结合的配体的100%单层所需的量等效的配体数目的三倍的量存在。
[0066]在一种实施方案中，本发明是一种用于表征胶体金溶液中多个金纳米颗粒的表面化学性质和检测与金纳米颗粒结合的配体的存在的方法，其包括监测胶体金溶液的UV-VIS吸收光谱的变化，同时将不同量的与金纳米颗粒结合的含有硫醇基团的配体添加至胶体金溶液。
[0067]在一种或多种实施 方案中，自顶向下的纳米制造方法包括将包含机械能、热能、电场电弧放电能、 磁场能、离子束能、电子束能或激光能中的至少一个的物理能量源施加至胶体悬浮液中的块体金。
[0068]在一种或多种实施方案中，自顶向下的纳米制造方法包括激光烧蚀胶体悬浮液中的块体金。
[0069]在一种或多种实施方案中，自顶向下的纳米制造方法包括两步法，其包括:第一，通过使用光、电子束、聚焦离子束、或纳米球平版印刷在基材上制造金纳米颗粒阵列；第二，从基材将金纳米颗粒阵列移除至胶体悬浮液中。
[0070]在一种或多种实施方案中，金纳米颗粒具有至少一个约Inm至约200nm的尺寸。
[0071]在一种或多种实施方案中，金纳米颗粒的形状包含球、杆、棱镜、盘、立方体、核-壳结构、笼、框架或其混合中的至少一种。
[0072]在一种或多种实施方案中，胶体悬浮液包含水、甲醇、乙醇、丙酮或其它有机液体。
[0073]在一种或多种实施方案中，配体包含聚合物、脱氧核糖核酸核酸序列、核糖核酸序列、适体、氨基酸序列、蛋白质、肽、酶、抗体、荧光标记物或其混合物中的至少一种。
[0074]在一种或多种实施方案中，配体包含两种或更多种不同的配体。
[0075]在一种或多种实施方案中，与金纳米颗粒结合的官能团包含硫醇基团、胺基团、膦基团或其混合物。
[0076]在一种或多种实施方案中，与金纳米颗粒结合的配体的量包含在金纳米颗粒上形成配体单层所必要的量的1-100%。
[0077]在一种或多种实施方案中，通过以下方法中的至少一种确定覆盖区:如由在配体与纳米颗粒缀合期间的动态光散射确定的流体力学直径的增加、在I重量％的NaCl存在下在配体与纳米颗粒缀合期间在520纳米处的吸光度、通过荧光标记的配体与纳米颗粒的缀合的荧光光谱分析、通过参考文献值或通过这些方法的混合。
[0078]在一种或多种实施方案中，以包含金纳米颗粒上配体1% -100%的单层覆盖率范围内的表面覆盖率的量使溶液中的金纳米颗粒与所述至少一种配体缀合，并且金纳米颗粒的溶液包含游离的配体，其没有与金纳米颗粒缀合，基于纳米颗粒上结合的配体的覆盖区，以等于或小于与溶液中金纳米颗粒上100%的单层覆盖率所必要的量的两倍相等的配体数目的量存在。
[0079]在一种或多种实施方案中，纳米颗粒包含表面修饰的金纳米颗粒，其中以包含金纳米颗粒上配体从1%到小于100%的单层覆盖率范围内的表面覆盖率的量使金纳米颗粒与所述至少一种配体缀合。
[0080]在一种或多种实施方案中，金纳米颗粒的溶液包含游离的配体，其没有与金纳米颗粒缀合，基于纳米颗粒上结合的配体的覆盖区，以等于或小于与溶液中金纳米颗粒上20%的单层覆盖率相等的配体数目的量存在。
[0081]在一种或多种实施方案中，在25°C的室温下持续至少24小时，胶体金纳米颗粒的溶液是稳定的，由与配体缀合的金纳米颗粒的聚集和/或沉淀引起的局部表面等离振子共振可检测的红移和局部表面等离振子共振强度的降低分别为小于2纳米和小于10%。
[0082]在一种或多种实施方案中，配体包含具有200道尔顿-100，000，000道尔顿的分子
量的硫醇化聚乙二醇。
[0083]在一种或多种实施方案中，配体包含具有不同的官能团和一个或多个臂的单官能、同官能或杂官能PEG中的至少一种。
[0084]在一种或多种实施方案中，金纳米颗粒的溶液包含与PEG配体缀合的金纳米颗粒，并且如由FTIR光谱表征的在1500CHT1和1750CHT1之间的范围内显示出单一的可检测的峰。
[0085]在一种或多种实施方案中，以包含金纳米颗粒上配体1-100%的单层覆盖率范围内的表面覆盖率的量，金纳米颗粒的溶液包含与两种或更多种不同的配体缀合的金纳米颗粒。
[0086]因此，虽然本文仅具体描述了某些实施方案，但是显而易见:可对其作出许多修改而不脱离本发明的精神和范围。另 外，使用首字母缩写词仅仅是用于增强本说明书和权利要求书的可读性。应当注意，这些首字母缩写词并不旨在减少所使用的术语的一般性，并且它们不应该被解释为将权利要求的范围限于所描述的实施方案。
[0087]预期本发明仅由接下来的权利要求所限制，而不是由如本文上面所述的具体实施方案和它们的变体及组合所限制。
【权利要求】
1.一种制备具有表面修饰的稳定的胶体金纳米颗粒的方法，其包括以下步骤: a)使用块体金作为源材料，通过自顶向下的纳米制造方法制备金纳米颗粒在胶体悬浮液中的稳定的胶体金纳米颗粒制剂； b)通过将具有与所述金纳米颗粒结合的至少一种官能团的至少一种配体添加至所述胶体金纳米颗粒来进行所述金纳米颗粒的表面修饰，其中基于所述纳米颗粒上结合的所述配体的覆盖区，所述配体的总量不超过向全部所述裸金纳米颗粒提供结合的配体单层所需的量的三倍，并且使至少一部分所述量的配体与所述金纳米颗粒结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述自顶向下的纳米制造方法包括将包含机械能、热能、电场电弧放电能、磁场能、离子束能、电子束能或激光能中的至少一种物理能量源施加至所述胶体悬浮液中的所述块体金。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述自顶向下的纳米制造方法包括激光烧蚀胶体悬浮液中的所述块体金。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述自顶向下的纳米制造方法包括两步法，其包括:首先通过使用光、电子束、聚焦离子束、或纳米球平版印刷在基材上制造金纳米颗粒阵列，和其次从所述基材将所述金纳米颗粒阵列移除至胶体悬浮液中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述金纳米颗粒具有至少一个约Inm至约200nm的尺寸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述金纳米颗粒的形状包含球、杆、棱镜、盘、立方体、核-壳结构、笼、框架或其混合中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶体悬浮液包含水、甲醇、乙醇、丙酮或其它有机液体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体包含聚合物、脱氧核糖核酸核酸序列、核糖核酸序列、适体、氨基酸序列、蛋白质、肽、酶、抗体、荧光标记物或其混合物中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体包含两种或更多种不同的配体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中与所述金纳米颗粒结合的所述官能团包含硫醇基团、胺基团、膦基团或其混合物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中与所述金纳米颗粒结合的所述配体的所述量包含在所述金纳米颗粒上形成所述配体的单层所必要的量的1-100%。
12.根据权利要求1的方法，其中通过以下方法中的至少一种确定所述覆盖区:如由在配体与所述纳米颗粒缀合期间的动态光散射确定的流体力学直径的增加、在I重量％的NaCl存在下在配体与所述纳米颗粒缀合期间在520纳米处的吸光度、通过荧光标记的配体与所述纳米颗粒的缀合的荧光光谱分析、通过参考文献值或通过这些方法的混合。
13.一种包含金纳米颗粒和至少一种配体的胶体金纳米颗粒的溶液，所述配体具有至少一种对所述金纳米颗粒具有亲和力的官能团，并且其中所述金纳米颗粒是稳定的并分散在所述溶液中，并且其中基于所述纳米颗粒上结合的所述配体的覆盖区，所述配体以等于或小于与向全部所述裸金纳米颗粒提供结合的配体的100%单层所需的量相等的所述配体数目的三倍的量存在。
14.根据权利要求13所述的胶体金纳米颗粒的溶液，其中以包含所述金纳米颗粒上所述配体1% -100%的单层覆盖率范围内的表面覆盖率的量使所述金纳米颗粒与所述至少一种配体缀合，并且其中所述溶液包含游离的配体，其没有与金纳米颗粒缀合，基于所述纳米颗粒上结合的所述配体的覆盖区，以等于或小于与所述溶液中所述金纳米颗粒上100%的单层覆盖率所必要的量的两倍相等的配体数目的量存在。
15.根据权利要求13所述的胶体金纳米颗粒的溶液，其包含表面修饰的金纳米颗粒，其中以包含所述金纳米颗粒上所述配体从1%到小于100%的单层覆盖率范围内的表面覆盖率的量使所述金纳米颗粒与所述至少一种配体缀合。
16.根据权利要求13所述的溶液，其中所述溶液包含游离的配体，其没有与金纳米颗粒缀合，基于所述纳米颗粒上结合的所述配体的覆盖区，以等于或小于与所述溶液中所述金纳米颗粒上20%的单层覆盖率相等的配体数目的量存在。
17.根据权利要求13所述的溶液，其中所述胶体金纳米颗粒的溶液在25°C的室温下持续至少24小时是稳定的，由与所述配体缀合的金纳米颗粒的聚集和/或沉淀引起的局部表面等离振子共振的可检测的红移和局部表面等离振子共振强度的降低分别为小于2纳米和小于10% ο
18.根据权利要求13所述的溶液，其中所述金纳米颗粒具有至少一个约Inm至约200nm的尺寸。
19.根据权利要求13所述的溶液，其中所述金纳米颗粒的形状包含球、杆、棱镜、盘、立方体、核-壳结构、笼、框架或其混合中的至少一种。
20.根据权利要求13所述的溶液，其中所述溶液包含水、甲醇、乙醇、丙酮或其它有机液体中的至少一种。
21.根据权利要求13所述的溶液，其中所述配体包含聚合物、脱氧核糖核酸核酸序列、核糖核酸序列、适体、氨基酸序列、蛋白质、肽、酶、抗体、荧光标记物或其混合物中的至少一种。
22.根据权利要求13所述的溶液，其中所述至少一种官能团包含硫醇基团、胺基团、膦基团或其混合物。
23.根据权利要求13所述的溶液，其中所述配体包含具有200道尔顿-100，000，000道尔顿的分子量的硫醇化聚乙二醇。
24.根据权利要求13所述的溶液，其中所述配体包括具有不同的官能团和一个或多个臂的单官能、同官能或杂官能PEG中的至少一种。
25.根据权利要求13所述的溶液，其中所述溶液包含与PEG配体缀合的金纳米颗粒，并且如由FTIR光谱表征的在1500CHT1和1750CHT1之间的范围内显示出单一的可检测的峰。
26.根据权利要求13所述的溶液，其以包含所述金纳米颗粒上所述配体1-100%的单层覆盖率范围内的表面覆盖率的量包含与两种或更多种不同的配体缀合的金纳米颗粒。
27.一种稳定的胶体金纳米颗粒溶液，其通过权利要求1所述的方法制造。
28.一种用于表征胶体金溶液 中多个金纳米颗粒的表面化学性质和检测与金纳米颗粒结合的配体的存在的方法，其包括监测胶体金溶液的UV-VIS吸收光谱的变化，同时将不同量的与金纳米颗粒结合的含有硫醇基团的配体添加至胶体金溶液。
【文档编号】C07F1/12GK103917546SQ201280011023
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年3月1日 优先权日:2011年3月2日
【发明者】钱卫, 村上真, 市川雄贵, 车勇 申请人:亿目朗美国股份有限公司