使用捕获标记物的三磷酸化寡核苷酸的纯化的制作方法
【专利摘要】本发明涉及使用捕获标记物制备三磷酸修饰的寡核苷酸的方法。该方法可以以高产量和适用于药物应用的纯度合成和纯化三磷酸修饰的寡核苷酸。
【专利说明】使用捕获标记物的三磷酸化寡核苷酸的纯化
[0001]描述
[0002]本发明涉及使用捕获标记物制备三磷酸修饰的寡核苷酸的方法。该方法可以以高产量和适用于药物应用的纯度合成和纯化三磷酸修饰的寡核苷酸。
[0003]发明背景
[0004]Schlee等，Immunity, 2009, 31, 25-34描述了在一条链上携带5’ -O-三磷酸酯部分的钝端双链RNA，通过结合RIG-1解螺旋酶，作为有效的免疫系统的刺激剂。因此，对提供简单且有效的用于制备适用于药物应用的高纯度三磷酸修饰的寡核苷酸的方法存在需求。
[0005]三磷酸酯基团或其类似物与核苷化合物的5’ -OH基团的偶联是本领域公知的。Ludwig J.等，J.0rg.Chem.1989，54，631-635 公开了使用 2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮作为亚磷酸化剂的用于制备核苷和类似物的5’ -O-三磷酸酯的溶液三磷酸化方法。Gaur R.K.等，1992, Tetrahedron Letters, 33, 3301-3304 描述了在固相上使用所述方法，用于合成2’-O-甲基核糖核苷5’-O-三磷酸酯及其Pa-硫代类似物。美国专利6，900, 308B2公开了作为潜在抗病毒化合物的修饰核苷5’ -O-三磷酸酯的固相合成，而美国专利7，285，658,7, 598，230和7，807，653公开了在糖、核碱基和三磷酸酯部分中具有修饰的核苷三磷酸酯类似物。
[0006]W096/40159描述了用于生产加帽的RNA或RNA类似物分子的方法，其中将RNA或RNA类似物寡核苷酸与亚磷酸化剂(如，2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷_4_酮或其环取代的衍生物)反应。将所得到的中间体与磷酸酯或焦磷酸酯或其氧化的或水解的盐反应。通过与激活的m7G三-、二-或单磷酸酯或类似物反应,将二 -或三磷酸化RNA或RNA类似物加帽。
[0007]W02009/060281描述了含有修饰的寡磷酸酯部分的免疫刺激寡核糖核苷酸类似物和用于制备这些化合物的方法。该方法包括在固体支持物上合成寡核苷酸，在合适的溶剂中，并且在碱的存在下，在寡核苷酸的5’ -端，将核苷酸与亚磷酸化剂(如，2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮)反应，将亚磷酸化的寡核苷酸与焦磷酸酯或焦磷酸酯类似物反应，用氧化剂氧化寡核苷酸，并且将寡核苷酸去保护，以产生三磷酸酯-或三磷酸酯类似物-修饰的寡核苷酸。
[0008]W096/40159中使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳只可用于小规模分离。用于较长寡核糖核苷的5’ -单-、二 _、三磷酸化产品的离子交换色谱的分辨力受到限制。所需的变性条件使得分离是个冗长乏味的任务(Sproat，1999 ；Zlatev,2010 ;W02009/060281 )，此外，产品通常受到正-1、正-2序列及其单-和二磷酸酯的污染，导致纯度不足。已知对RIG-1配体的精确末端结构的敏感性，这些纯化方法对药物应用是次最佳的。
[0009]双重靶向策略(siRNA和RIG配体)需要与纯化方法无关的通用序列。
[0010]发明概述
[0011]大规模生产用于潜在临床使用的5’ -O-三磷酸化寡核苷酸及其类似物是高度理想的，并且方便的制备方法也是非常需要的。在本申请中，显示了用捕获标记物(例如，癸胺)可以将固相结合的全保护寡核苷酸的5’-0_环三磷酸酯中间体(参见图1)的环打开，产生对RNA的去保护稳定的Py标记的物质。标记物的性质使得捕获标记的三磷酸酯物质特异性停留在捕获标记物特异性试剂上。如果需要，可以按序除去标记物。该方法可以延伸至包括三磷酸酯部分的类似物，例如，含有替代氧原子的例如(6, Y-亚甲基、氟代亚甲基、二氟亚甲基和亚氨基的类似物。
[0012]捕获标记方法的优势是所需物质的简单纯化和提高的回收，例如，在室温下，通过RP-HPLC或亲和性色谱，任选地紧接着在合适的条件下捕获标记物的切割。
[0013]优选实施方案的详述
[0014]本发明描述了含有捕获标记物的三磷酸寡核苷酸的合成和纯化，包括其类似物。最广泛使用的用于标准5’ -OH寡核苷酸的HPLC纯化的方法是三苯甲基-ON寡核苷酸的反相色谱。
[0015]本发明中所述的方法提供了实际的解决方法，对于5’ -三磷酸化寡核苷酸具有相似的功效。
[0016]因此，本发明的主题是制备式(I)的寡核苷酸的方法，
[0017]
V5 V3 V1
!! !I Il
Z—Y—X—P—VVu—P—W-一P—W1~-ON
I I
▽6 V4 V2I
[0018]其中V:、V3和V5在每种情况中独立地选自O、S和Se ;
[0019]V2、V4 和 V6 在每种情况中独立地选自 OH'OR^SHJR^F'NHyNHRWRt 和 BH3_M+，
[0020]W1 是 O 或 S，
[0021]胃2是0、5、順或殿2，
[0022]胃3是0、5、順、殿2、012、01版1或 C(Hal)2,
[0023]R1、R2和R3选自CV6烷基、C2_6烯基、C2_6炔基、C2_6酰基或环基，各自任选被取代，
[0024]或其中两个R1可以和与其结合的N-原子一起形成环，
[0025]M+是阳离子，
[0026]X 是 NH、NR3、0 或 S，
[0027]Z表示捕获标记物，
[0028]Y表示连接所述捕获标记物与X的键或连接物，和
[0029]ON表示包含至少4个核苷酸或核苷酸类似物结构单元的寡核苷酸，
[0030]所述方法包括下列步骤:
[0031](a)将式(IIa)的化合物与氧化剂反应，
[0032]
W3 W2
Ve-.J I
'声.\、,厂 '驚「喔 Iia
[0033]其中VpWV4'VpHWjP ON如上限定，以获得式(IIb)的化合物
[0034][0035]其中V1J3J5J2J4'V6H W3 和 ON 如上限定，
[0036](b)将氧化的化合物与式(III)的捕获标记物试剂反应，
[0037]Z-Y-XH (III)
[0038]其中X、Z和Y如上所述，以获得包含式(I)的寡核苷酸的反应产物，和
[0039](C)在允许寡核苷酸(I)与所述反应产物中所含的其他物质分离的条件下，将步骤
(b)的反应产物与能够与所述捕获标记物相互作用的试剂接触。
[0040]任选地，该方法进一步包括步骤(d)除去捕获标记物，以获得式(IV)的寡核苷酸，
[0041]
[0042]其中V1J3J5J2J4'V6H W3 和 ON 如上所述。
[0043]在不引起三磷酸酯部分降解的条件下进行该步骤，例如，如以下详细描述的条件。
[0044]在进一步的实施方案中，捕获标记物没有除去或没有完全除去。在这些实施方案中，如此标记的寡核苷酸可以具有实用性，例如，作为药剂的实用性。
[0045]在本申请内容中的术语“寡核苷酸”包括含有多个(例如，至少4个)核苷酸或核苷酸类似物结构单元的化合物。优选地，寡核苷酸包括6-100个，例如，20-40个结构单元。核苷酸或核苷酸类似物结构单元可以包括由亚基间连接连接的核苷酸或核苷酸类似物亚基。核苷酸亚基包括脱氧核糖核苷亚基、核糖核苷亚基和/或其类似物，特别是糖-和/或核碱基-修饰的核苷类似物。此外，寡核苷酸可以包含非核苷酸结构单元和/或更多的末端和/或侧链修饰。
[0046]在优选的糖修饰亚基中，核糖核苷亚基的2’ -OH被选自OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R是Cu烷基、C2_6烯基或C2_6炔基，并且卤素是F、Cl、Br或
I。在进一步优选的糖修饰亚基中，核糖可以是取代的，例如，被另一种糖取代，例如，戊糖，如阿拉伯糖。这种糖修饰可以结合如上所述的2’ -OH修饰，如2’ -氟代阿拉伯核苷亚基中的修饰。再进一步优选的糖修饰亚基包括锁核苷(LNA)或2’，3’-断-核苷(UNA)。在优选的核碱基修饰的核苷结构单元中，替代标准核碱基，使用非标准的，非天然产生的核碱基。非标准的核碱基的实例是5-位的尿嘧啶或胞嘧啶，例如，5- (2-氨基)丙基尿嘧啶或5-溴尿嘧啶；次黄嘌呤；2，6-二氨基嘌呤；8_位修饰的腺嘌呤或鸟嘌呤，例如，8-溴鸟嘌呤；去氮核苷，例如，7-去氮鸟嘌呤或7-去氮腺嘌呤；或O-和N-烷基化核碱基，例如，N6-甲基腺嘌呤，或N6，N6- 二甲基腺嘌呤。更多合适的核碱基类似物可以选自通用核碱基类似物，如5-硝基吲哚。
[0047]亚基间连接可以是磷酸二酯连接或修饰的连接，例如，硫逐磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、硼磷酸酯，或本领域技术人员已知的另一种修饰的连接。
[0048]寡核苷酸可以选自脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和寡核苷酸类似物。脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物可以包括至少一个脱氧核糖核苷或核糖核苷亚基和至少一个修饰的核苷亚基和/或至少一个修饰的亚基间连接，例如，如上所述的。寡核苷酸类似物还可以存在于它们完整的修饰核苷亚基中。
[0049]寡核苷酸可以是单链分子或双链分子。双链寡核苷酸可以包括全部或部分互补链。双链分子可以是钝端的，或包含至少一个悬垂物，例如，5’-或3’-悬垂物。悬垂物如果存在，优选位于分子的远端(相对于三磷酸酯/三磷酸酯类似物基团)。双链寡核苷酸还可以包括发夹-结构，其中在其远端(相对于三磷酸酯/三磷酸酯类似物基团)通过环闭合双链。环可以包含核苷酸和/或非核苷酸结构单元，例如，基于二醇的结构单元，如乙二醇部分，例如，三(乙烯)醇或六(乙烯)醇；丙烷-1,3-二醇；十二烷-1，12-二醇；或3，12-二氧杂_7，8- 二硫十四烧-1, 14- 二醇。
[0050]在优选的实施方案中，双链分子是钝端的，特别是在其近端(相对于三磷酸酯/三磷酸酯类似物基团)。
[0051]寡核苷酸可以包括更多的末端和/或侧链修饰，例如，与其共价连接的细胞特异性靶向实体。那些实体可以促进细胞或细胞特异性吸收，并且包括，例如，脂质、维生素、激素、肽、寡糖及其类似物。靶向实体可以通过本领域技术人员已知的方法例如连接修饰的核碱基或非核苷酸结构单元。
[0052]式(I)或(IV)的寡核苷酸包括三磷酸酯/三磷酸酯类似物基团。在该基团中，V1,V3和V5独立地选自O、S和Se。优选地，V1, V3和V5是O。V2、V4和V6在每种情况中独立地选自 OH'OR^SH'SR^F'NHyNHR^NOOdPMVM+。优选地，V2、V4 和 V6 是 OH。R1 可以是 C^6烷基、C2_6烯基、C2_6炔基、C2_6酸基或环基,例如,C3_8环(杂)烷基、C3_8环(杂)烯基、苯基或c5_6杂芳基基团，其中杂原子`选自N、0和S。此外，两个R1可以和与其结合的N-原子一起形成环，例如，5-或6-元环。R1还可以包括取代基，如卤素(例如，F、Cl、Br或I)、0(卤素)q_2烷基，以及-在环基情况中_(卤素)CV2烷基。M+可以是无机或有机阳离子，例如，碱金属阳离子，或铵或胺阳离子。
[0053]W1可以是0或S。优选地，W1是O。W2可以是O、S、NH或NR2。优选地，W2是O。W3可以是O、S、NH、NR2、CH2、CHHal或C(Hal)2O优选地，W3是O、CH2或CF2。R2可以选自如以上对R1所述的基团。Hal可以是F、Cl、Br或I。
[0054]三磷酸酯/三磷酸酯类似物基团优选连接寡核苷酸的末端。优选地，所述基团与寡核苷酸的5’ -端，特别是其5’ -端糖的5’ -OH-基团连接。
[0055]本发明方法的步骤(a)包括式(IIa)的环状P (V) -P (V) -P (III)物质与氧化剂的反应。可以根据Ludwig等，1989，上文和Gaur等，1992，上文中所述的标准方法来获得式(IIa)的化合物，即，在合适的条件下，例如，在碱(吡啶或二异丙基甲胺)的存在下，在合适的溶剂(如二噁烷或二氯甲烷)中，通过将寡核苷酸的5’ -端OH-基团与三功能的亚磷酸化剂(例如，2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮)反应，并且随后与焦磷酸酯(W3=O)或修饰的焦磷酸酯(W3不同于0，例如，CH2、CCl2、NH或CF2)反应。优选地，使用DMF中的焦磷酸酯或修饰的焦磷酸酯的三-正-丁铵盐。然后在无水条件下，例如，使用过氧化物，如t- 丁基氢过氧化物、枯烯氢过氧化物、(10-樟脑磺酰)哑嗪，来氧化所得到的环状P (III) -P (V)中间体(Ila)。或者，也可以分别使用苯乙酰基二硫化物(V2=S)或硼烷-二异丙基乙胺复合物(V2=BH3),来产生相应的式(IIb)的环状5’ -三磷酸酯/三磷酸酯类似物。该内容还可以参考W096/40159或W02009/060281，按应用将其内容并入本文中作为参考。
[0056]反应步骤(a)可以使用溶液中的寡核苷酸或使用结合固相(例如，有机树脂或玻璃，如CPG)的寡核苷酸来进行。寡核苷酸可以进一步包括保护基团，例如，本领域技术人员公知的糖-或核碱基保护基团。保护基团的优选实例是用于核苷间磷酸二酯或硫逐磷酸酯的2-氰基乙基，用于核糖2’ -羟基的叔-丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基氧甲基或双(乙酰氧乙氧基)甲基，用于核碱基的环外氨基的4-叔-丁基苯氧基乙酰基或苯氧基乙酰基、乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基。更优选地，使用固相结合的寡核苷酸进行步骤(a)。
[0057]根据本发明方法的步骤(b)，将化合物(IIb)与式(III)的捕获标记物试剂反应
[0058]Z-Y-XH (III)
[0059]其中X是选自NH、NR3、0或S的基团。如以上对R1所述的来限定R3。优选地，X是NH 或 S。
[0060]以下通过一系列似是而非的实例来功能性地限定捕获标记物。一般规则为:
[0061]Z必须允许方便的纯化，并且在适合pppRNA稳定性要求的条件下应当可以去除。
[0062]Y表示化学键或连接物，例如，亚烷基，优选地，CV6-亚烷基连接物，更优选地，C2_5亚烷基连接物，或芳亚烷基连接物，任选地包含杂原子或含杂原子基团，如O、S、NH、C=O或C=S，和/或任选地包含C=C 或C = C键。
[0063]在另一个优选实施 方案中，连接物是聚环氧烷连接物，优选地，聚-C2-C6-环氧烷，更优选聚-C2-C3-环氧烷。 连接物的数量平均分子量在30-800g/mol的范围内，优选40-450g/mol，更优选 40-250g/mol。连接物可以是[-CH2CHR4-O-]n，n=l_10，优选 n=l_7，更优选n=2-5，甚至更优选n=3。R4可以是H或(^6-烷基。
[0064]在优选的实施方案中，R4是H。
[0065]在特别优选的实施方案中，连接物具有式-CH2-CH2-[ (O-CH2CH2) ]3_。
[0066]可以使用溶液中的寡核苷酸或使用结合固相(例如，有机树脂或玻璃)的寡核苷酸来进行反应步骤(b)。寡核苷酸可以进一步包含如上所述的保护基团。更优选地，使用固相结合的寡核苷酸来进行步骤(b )。
[0067]根据本发明的捕获标记物Z是在允许分离包含捕获标记物的化合物(例如，寡核苷酸(I))与不含捕获标记物的其他物质的条件下能够与捕获试剂非共价或共价相互作用的部分。优选地，捕获试剂是固定化试剂或能够被固定化的试剂。
[0068]合适的捕获标记物例如是长链(例如，C8_24,优选C13_24)脂族烷基残基，如癸基或十八烷基，或其他脂类/亲脂性残基，如，例如，胆固醇基或生育酚基。在这种情况中，可以通过标准反相色谱，例如，RP-HPLC，或通过疏水性相互作用色谱(HIC)，在固相上捕获和纯化标记的三磷酸酯实体。捕获标记物还可以是全氟烷基实体，例如，4-(1Η，1H, 2H, 2H-全氟癸基)苄基或3-(全氟辛基)丙基残基,用于在Fluorous亲和性支持物(如，从FluorousTechnologies, Inc.可购得)上的修饰寡三磷酸酯的特异性捕获。
[0069]在另一个实施方案中，捕获标记物可以是非共价高亲和性结合对的第一配偶体，如生物素，或生物素类似物，如脱硫生物素，半抗原或抗原，其对捕获试剂具有高亲和性(例如，IO-6Vmol或更低的结合常数)，捕获试剂是高亲和性结合对的第二互补配偶体，例如，抗生物素蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗体。
[0070]在另一个实施方案中，捕获标记物可以是共价结合对的第一配偶体，其可以与捕获试剂形成共价键，捕获试剂是共价结合对的第二互补配偶体，其中共价键可以是可逆的或不可逆的键。在这个实施方案中,捕获标记物成分Z可以反应性化学实体,在Husigen3+2环加成反应的情况中(所谓的Cu (I)催化的点击反应”或其变体，没有Cu (I)通过剧烈的环链释放进行，例如在环辛炔衍生物中)，是能够与含有互补反应基(例如，分别为，炔基或叠氮部分)的捕获试剂共价反应的如叠氮化物或炔基基团。在这种情况中，Z-Y-X的特异性实例是块丙基氣基。
[0071]在另一个实施方案中，捕获标记物成分可以是含有另外的亲核性基团(例如，NH2-Y-XH型试剂中的第二氨基)的化学实体。然后可以使用各种合适的亲电子Z试剂，如胆固醇、氯甲酸酯或生物素N-羟基琥珀酰亚胺活性酯来引入标记基团，同时将寡核苷酸与固相连接，由此显著地延伸了标记反应的范围。
[0072]在优选的实施方案中，捕获标记物是长链烷基残基、全氟烷基实体、叠氮化物或炔
基基团。
[0073]此外，Y可以任选含有二硫键，使得能够收集修饰的三磷酸化寡核苷酸，所述寡核苷酸具有经由连接物部分通过X连接Y-磷的游离巯基部分。
[0074]在本发明的再一个实施方案中，寡核苷酸可以在不同的位置，例如，在3’ -端携带第二捕获标记物。优选地选择第一和第二捕获标记物，使得可以通过两个正交方法来纯化，使得能够收集非常高纯度的材料。例如，第一捕获标记物可以是亲脂性基团，其可以与合适的色谱支持物相互作用，而第二捕获标记物可以是生物素，其与抗生物素蛋白链菌素相互作用。
[0075]通过进行使用用于寡核 糖核苷酸合成的修饰CPG (受控玻璃支持物)的合成来方便地引入第二捕获标记物。
[0076]本发明方法的步骤(C)包括在允许含有捕获标记物的寡核苷酸(I)与反应产物中所含的其他物质分离的条件下将步骤(b)的反应产物与能够与所述捕获标记物Z相互作用的捕获试剂接触。在步骤(c)之前，将固相结合的寡核苷酸(I)与固相分离并且去保护，SP，部分或全部去除保护基团。捕获试剂优选固定在合适的支持物，例如，色谱支持物上。为了提供含有捕获标记物的寡核苷酸(I)与不含捕获标记物的物质的分离，将步骤(b)的反应产物与固相分离并且去保护，如果需要，并接受分离程序，优选基于捕获标记物Z与捕获试剂相互作用的色谱分离程序。在分离步骤的过程中，寡核苷酸(I)的纯度(根据序列的长度和复杂性，对于粗制材料，通常在25-70%范围内)可以提高至90%、91%、92%、93%、94%、95%或更高。对于毒性研究，需要>85%的纯度，而在后期临床试验中，纯度应当在至少90-95%的范围内。因此，本发明提供了一种获得人临床试验所需的高纯度PPPRNA的方法。
[0077]在步骤(C)中，捕获标记物和能够与其相互作用的捕获试剂优选选自(i)疏水性或氟化的基团和对疏水性或氟化的基团具有亲和性的色谱材料，例如，反相材料或氟亲和性材料；(ii)非共价高亲和性结合对的第一配偶体和非共价高亲和性结合对的第二互补配偶体，(iii)共价结合对的第一配偶体和共价结合对的第二互补配偶体，其中第一和第二配偶体形成共价键。
[0078]在纯化步骤(C)后，可以在步骤(d)中将捕获标记物Z与三磷酸修饰的寡核苷酸分离，形成未标记的寡核苷酸(IV)。
[0079]步骤(d)必须适合三磷酸酯末端产物的稳定性要求和核糖核苷酸间键的稳定性要求。当X是NH时，可以包括通过温和的酸性条件的切割，当X是S时，使用银离子切割，当Y-X-P含有-S-S-CH2-CH2-O-P时，通过硫醇(如二硫苏糖醇)切割，导致环硫乙烷的消除。
[0080]在进一步的实施方案中，捕获标记物组完全或部分保留在三磷酸修饰的寡核苷酸上，特别是标记的寡核苷酸适用于药物应用时。在这些实施方案中，试剂Z-Y-XH必须选自Z-残基的亚组，其在功能上适合RIG-1传感器的结构要求。例如，已知Z=癸基-十八烷基，Y=连接，XH=NH组合满足这些要求。
[0081]由于其高纯度，根据本发明产生的三磷酸酯/三磷酸酯类似物修饰的寡核苷酸特别适用于药物应用。在特别优选的实施方案中，寡核苷酸(I)或(IV)是RIG-1解螺旋酶的激活剂。合适的RIG-1激活剂的特定实例公开于Schlee等，2009，上文，按引用将其内容并入本文中作为参考。
[0082]在另一个实施方案中，本发明涉及通过根据本发明的方法可获得的式(I)的寡核苷酸。
[0083]本发明的再另一个主题是用于制备式(I)的寡核苷酸的试剂盒的用途，
[0084]
【权利要求】
1.制备式(I)的寡核苷酸的方法，
2.权利要求1的方法，其中所述捕获标记物和所述能够与其相互作用的捕获试剂选自: (i )疏水性或氟化的基团和对疏水性或氟化的基团具有亲和性的色谱材料，例如，反相材料或氟亲和性支持物； (?)非共价结合对的第一配偶体和非共价结合对的第二配偶体，和 (iii)共价结合对的第一配偶体和共价结合对的第二配偶体，其中所述第一和第二配偶体形成共价键。
3.权利要求1或2的方法，其中三磷酸酯/三磷酸酯类似物基团与寡核苷酸的5’-端连接，特别是与其5’ -端糖的5’ -OH-基团连接。
4.权利要求1-3任一项的方法，进一步包括下列步骤: Cd)除去所述捕获标记物，以获得式(IV)的寡核苷酸，
其中mmm和on如权利要求ι中限定。
5.权利要求1-4任一项的方法,其中所述寡核苷酸选自脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和寡核苷酸类似物。
6.权利要求1-5任一项的方法,其中所述寡核苷酸是单链或双链的。
7.权利要求6的方法，其中所述寡核苷酸是双链的，并且双链体在其远端通过环闭合，其中所述环包括核苷酸和/或非核苷酸结构单元。
8.权利要求6或7的方法，其中所述寡核苷酸是双链的，并且双链体在其近端是钝端。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述寡核苷酸包含与其共价连接的细胞特异性靶向实体。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述寡核苷酸(I)或(IV)是RIG-1的激活剂。
11.式(I)的寡核苷酸，可通过权利要求1-10任一项的方法获得。
12.用于制备式(I)的寡核苷酸的试剂盒的用途，
V5 V3 V.!! !I Il
Z——Y——X——P—w,—P——W,—P——W1-ON
I ' I " I,
V6 V4 V2I 其中VpVyHVpVpmXJ'Z和ON如权利要求1-10任一项中限定， 其中该试剂盒包含: (a)式(III)的捕获标记物试剂 Z-Y-XH (III) 其中X、Z和Y如权利要求1-10任一项中限定，和 (b)能够与所述捕获标记物相互作用的捕获试剂。
13.式(I)的修饰寡核苷酸
V5 V3 V,
^i I.I! Il 11
Z:——Y————P-——:ψ/7:_,P:-_P--:衡:_◎關
I 1-1,
V8 V4 V2I其中
X 是 NH、O、R-O- [P (V1) V2-WJn 或 R-O-P (V3) V4-W2-P- (V1) V2-W1，
n是1-12，优选I或2， Y是键，
Z 是 C13-C24 烷基、Q 或 QNHC2-C24 烷基， Q选自H、氨基酸、氨基酸类似物、C1-C24烷基，优选C12-C24烷基、肽和脂质， R是C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和脂质， R是C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基、C2-C24酰基或环基，并且任选地被取代， 和 V1' V2, V3> V4, V5, V6、W1' W2、W3 和 ON 如权利要求 1-10 任一项中限定，其中 V1, V2, V3>V4, V5, V6、W1^ff2 和 W3 优选地是 O。
14.权利要求13的修饰寡核苷酸， 其中 X是NH或0，和
Z 是 C13-C24 烷基、Q 或 QNHC2-C24 烷基。
15.权利要求13的修饰寡核苷酸， 其中
X 是 R-O-[P(V1) V2-W丄，
n是I或2,和
V1^V2 和 W1 是 O。
【文档编号】C07H21/02GK103492405SQ201280015575
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年3月28日 优先权日:2011年3月28日
【发明者】J·路德维希, M·戈尔德克, B·斯普罗特 申请人:波恩莱茵弗里德里希·威廉大学