诊断类风湿性关节炎的方法
【专利摘要】本发明涉及用于诊断类风湿性关节炎(RA)的瓜氨酸合成肽的应用。
【专利说明】诊断类风湿性关节炎的方法
发明领域
[0001]本发明涉及用于诊断类风湿性关节炎(RA)的瓜氨酸合成肽的应用。特别地，本发明涉及与RA患者的血清中存在的自身抗体特异性反应的肽序列的应用。
[0002]当前技术水平
[0003]类风湿关节炎(RA)在广泛的炎性关节疾病中占有突出位置。通过在小关节和大关节中产生系统性和破坏性炎症，RA导致疼痛和关节衰竭，最终导致畸形和残疾。RA的特点是出现多种自身抗体。最为人熟知的RA生物标志物是针对免疫球蛋白IgG同种型Fc区的IgG、IgA或IgM类抗体:类风湿因子(RF)。约70?80%的RA患者为RF血清阳性，但在慢性感染、淋巴增殖性疾病、其它类风湿疾病和近20%的老年健康个体中也发现了 RF。因此，鉴于RF对RA的特异性有限，人们探寻了其它更具特异性的抗体。APF(抗核周因子)抗体和AKA(抗角蛋白抗体)明确显示具有高度疾病特异性。
[0004]后来发现由APF抗体和AKA识别的抗原是通过将精氨酸修饰成瓜氨酸残基在翻译后生成的含有瓜氨酸的蛋白质。RA中含有瓜氨酸表位的这一发现加速了对该高度特异性RA生物标志物的鉴定。抗瓜氨酸蛋白/肽抗体(ACPA)是几乎专一存在于RA中的生物标志物家族[G.J.Pruijn等.Arthritis Res.Ther.2010，12，203]。因为具有高疾病特异性，最近ACPA被包括在了用于RA的分类和诊断的血清学标准中[D.Aletaha等.Ann.Rheum.Dis.2010, 69，1580]。已经使用不同的瓜氨酸肽和蛋白质来设立识别ACPA的特异且灵敏的RA 诊断试验[US20020143143、US20070087380、EP1946109、US20070148704、TO2009007846、W02009000077、W02007017556、EP1456662、W01999028344、W02008132264、W02010115745、W02010117694、US2011065609]。在与RA相关联的所有蛋白质中，以下瓜氨酸序列已被用于诊断试验:血纤蛋白[C.Masson-Bessiere 等.J.1mmunol.2001, 166, 4177]、胶原蛋白 II [H.Burkhardt 等.Eur.J.1mmunol.2005, 35, 1643]、波形蛋白[E.R.Vossenaar 等.ArthritisRheum.2004，50，3485]、丝聚蛋白[US20090028885、US7445903、US6890720]，以及病毒蛋白[C.Anzilotti 等.J.Rheumatol.2006，33，647 ；W02004087747]。首个使用合成瓜氨酸肽(CP)的 ELISA 源自丝聚蛋白[G.A.Schellekens 等.J.Clin.1nvest.1998，101，273]。为了增加所述测试的灵敏度，将CP修饰成环瓜氨酸肽(CCP)的结构，其中，优选暴露所述化氨酸部分以供抗体结合[W01998022503]。在所谓的CCP1测试中[G.A.Schellekens等.Arthritis Rheum.2000, 43, 155]，可在68%的RA患者血清中检测到抗体，采用单一CCP的特异度为98%。近期研究表明，第二代CCP测试，CCP2 [J.Avouac等.Ann.Rheum.Dis.2006, 65，845]，是非常灵敏且特异的，其显示68% (39?94%范围)的灵敏度和95%(81?100%范围)的特异度。最近，IN0VA开发出了第三代试验[L.Lutteri等.Clin.Chim.Acta2007, 386，76]并宣称该试验是新型且更灵敏的抗CCP ELISA，其保持98%的特异度。这些ELISA测试全部市售可得(荷兰阿纳姆的ED公司(Euro-Diagnostica);苏格兰敦提的轴盾公司(Axis-Shield);美国圣地亚哥的IN0VA公司)。
[0005]最近，使用源自EB(Epstein-Barr)病毒的蛋白质 EBNA1 (VCP1)和 EBNA2 (VCP2)的瓜氨酸序列能够建立以相当于CCP2和CCP3测试报道的特异度和灵敏度为特点的诊断试验[F.Pratesi 等.Arthritis Rheum.2006, 54, 733 ；C.Anzilotti等.J.Rheumatol.2006, 33, 647 ；F.Pratesi 等.Clin.Exp.1mmunol.2011, 164, 337 ；W02004087747 ；EP2325195]。有趣的是，基于CCP2、CCP3、VCP1和VCP2的测试的性能比较表明，不同的瓜氨酸序列能检测同组患者内ACPA的不同亚组。这些结果证实，与XG或XnonG单元(X=瓜氨酸)具有唯一作用的假设[EP1693673]不同，在抗CP表位形成中的瓜氨酸残基周围的氨基酸序列起重要作用。
[0006]EBNA1 肽
[0007]基于脱亚胺EBNA1 (35-58)的瓜氨酸肽是国际申请W02004087747的目的，其中描述了其在检测RA血清中抗体的应用。该申请还公开了多抗原肽的应用[MAP J.P.Tam PNASU.S.A.1988，85，5409]，包括所述脱亚胺EBNA1 (35-58)作为免疫学试验中用于ACPA检测的包被抗原的至少4种拷贝。在50%的RA血清和少于5%的正常和疾病对照血清中检测出了与所述EBNA1 (35-58)序列相对应的肽(病毒瓜氨酸肽1，VCP1)的特异性抗体，所述抗体包含替代精氨酸的瓜氨酸[F.Pratesi等.Arthritis Rheum.2006, 54, 733]。在627例血清样品中测定抗VCP1抗体的频率，所述血清样品中，300例来自RA患者且327例来自对照，包括结缔组织疾病、慢性关节炎和健康供体。在45%的RA血清对比少于5%的对照中发现抗VCP1 抗体[C.Anzilotti 等.J.Rheumatol.2006, 33, 647]。
[0008]EBNA2 肽
[0009]RA涉及遗传和环境影响，并且早就怀疑病毒促使RA的发展。若要成为在RA中起病因作用的可能候选者，病毒必需在体内普遍、持续存在，显示直接或间接的关节取向，并且能够改变宿主免疫应答。所述EB病毒(EBV)显示这些特点。因此，EBV和RA之间的潜在关联成为 了近三十年的研究焦点[Κ.H.Costenbader 等.Arthritis Res.Ther.2006, 8, 204]。已知RA患者对于潜伏和复制型的EBV蛋白，尤其对于EBNA1具有升高的抗体水平。此外，RA患者的外周血EBV负载比对照高。许多研究阐明EBV在RA滑膜炎中可能的病因作用[S.Sawada等.Autoimmun.Rev.2005, 4, 106]。这些研究引导了使用病毒源性CP来探究RA患者内免疫应答的想法。采用源自脱亚胺肽EBNA2 (338-358) (GQSRGQSRGRGRGR G R G R G K G, SEQ ID N0.4)的瓜氨酸肽获得最佳结果。
[0010]在RA患者血清样品中，于67/104例(64%)中发现抗VCP2 (式XII的MAP) IgG抗体，于48/104例(46%)中发现IgM，且于41/104例(40%)中发现IgA，并于少于5%的正常健康对象和疾病对照中发现这些抗体[Pratesi等.Clin.Exp.1mmunol.2011, 164, 337 ；EP2325195]。
[0011]与RA诊断相关联的另一类蛋白质由组蛋白代表。
[0012]H4 肽
[0013]组蛋白是核小体的组分，并且分为以下五类:H1、H2A、H2B、H3和H4。源自H1和H2B的序列被用于检测系统性红斑狼疮、RA和系统性硬化病中的自身抗体[W003044054]。尽管已知这些蛋白质是天然脱亚胺蛋白质，并且通常是经修饰的[K.Arita等.PNAS2006, 103，5291 ;A.J.ff.Zendman 等.Anal.Biochem.2007，369，232]，至今没有将组蛋白瓜氨酸序列与RA联系起来。然而，描述了基于使用经修饰组蛋白(如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化)但非瓜氨酸化的微阵列的抗体检测[W007132177]。
[0014]全蛋白H4的表位作图显示不同瓜氨酸化的N末端部分，H4 (1-50)，与该分子的抗原部分相关联[EP10168270.6]。具体而言，H4 (1_50)的瓜氨酸化C末端部分具有高反应性，并且能用于识别RA血清中的ACPA。使用H4(l-20)在28%RA患者内发现抗H4IgG抗体，使用H4 (14-34)在65%RA患者内发现该抗体，且使用H4 (30-50)在60%RA患者内发现该抗体。
[0015]值得注意的是，所述抗体抗瓜氨酸化H4序列对RA具有高度特异性，因此属于ACPA家族，并且不存在于其它自体免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮、系统性硬化病)中，其中，与之相反的是，检测到了抗组蛋白抗体[W003044054 ；R.Hesselstrand等.,
【权利要求】
1.用于体外诊断对象类风湿性关节炎的方法，所述方法包括通过以下方式检测生物样品中类风湿性关节炎特异性抗体的步骤:a)在合适条件下使所述生物样品与至少两种肽反应以产生肽-抗体复合物，其中-至少一种肽由长度为至少15个氨基酸且包含在以下序列中的序列组成:
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述生物样品与至少两种肽反应，其中-至少一种肽由以下序列组成:
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使所述生物样品与至少两种肽反应，其中-至少一种肽由以下序列组成:
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使所述生物样品与至少两种肽反应，其中-至少一种肽由以下序列组成:
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使所述生物样品与以下物质反应:a)两种肽，其中-一种肽由长度为至少15个氨基酸且包含在以下序列中的序列组成:
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于-所述由长度为至少15个氨基酸且包含在SEQ ID N0.1序列中的序列组成的至少一种肽选自下组:
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述至少一种肽选自下组:-GAKCitHRKVLCitDNIQGITKPAI (SEQ ID N0.1 的氨基酸 14 ~氨基酸 34，其中
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述由长度为至少8个氨基酸且包含在SEQ ID N0.2序列中的序列组成的至少一种肽选自下组:-GQSRGQSCitGRGRGRGRGRGK G(SEQ ID N0.2，其中 X2=Cit 且X1=X3=X4=X5=X6=X7=Arg)；-GQSRGQSRGRGCitGRGRGRGK G(SEQ ID N0.2，其中 X4=Cit 且X1=X2=X3=X5=X6=X7=Arg)；-GQSRGQSCitGRGCitGRGRGRGK G(SEQ ID N0.2，其中 X2=X4=Cit 且X=X3=X5=X6=X7=Arg)；-G Q S Cit G Q S Cit G R G Cit G R G R G R G K G(SEQ ID N0.2，其中 XfXfXfCit且 X3=X5=X6=X7=Arg)；
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述由长度为至少12个氨基酸且包含在SEQ ID N0.3序列中的序列组成的至少一种肽选自下组:-G Xi G X2 G X3 G X4 G X5 G G(SEQ ID N0.3的氨基酸6~氨基酸17)，其中所述氨基酸X1-X9独立地选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X5中至少一个是瓜氨酸残基；-G Xi G X2 G X3 G X4 G X5 G G G X6 P G(SEQ ID N0.3 的氨基酸6 ~氨基酸21)，其中所述氨基酸独立地选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且&-χ5中至少一个是瓜氨酸残基;-G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G(SEQ ID N0.3 的氨基酸 6 ~氨基酸 17，其中xrx5全部是瓜氨酸残基)；-G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G(SEQ ID N0.3 的氨基酸6 ~氨基酸21，其中X1-Xe全部是瓜氨酸残基)；-G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G(SEQ ID N0.3,其中X1-Xe全部是瓜氨酸残基，式XV)。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使所述生物样品与以下组合反应:-G A K Cit H Cit Κ V L Cit D N I Q G I T Κ P A I (SEQ ID N0.1 的氨基酸 14 ~氨基酸34,其中X2=X3=X4=Cit和/或-Κ P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I (SEQ ID N0.1 的氨基酸31 ~氨基酸 50,其中 X5=X6=X7=X8=X9=Cit和-G Q S Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G(SEQ ID N0.2，其中全部是瓜氨酸残基和/或-G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G(SEQ ID N0.3,其中全部是瓜氨酸残基。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽是以下多抗原肽形式:(妝)4Κ2ΚβΑ或(妝)4Κ2Κβ A-C,其中βΑ是β _丙氨酸残基，并且C是半胱氨酸残基。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，至少一种肽选自下组:
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使所述生物样品与以下组合反应:所述组为:
14.用于诊断类风湿性关节炎的试剂盒，所述试剂盒含有前述权利要求中任一项中定义的至少两种肽。
【文档编号】C07K14/47GK103748468SQ201280024964
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年5月24日 优先权日:2011年5月25日
【发明者】F·普拉泰西, F·罗利, I·宝里尼, A·M·帕皮尼, M·C·阿尔卡洛, P·米廖里尼, P·罗维霍, M·切利 申请人:托斯卡纳生物标志有限公司