结合abca1多肽的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及结合天然ABCA1多肽的分离的抗体及其在检测组织样品中的ABCA1多肽中的用途。
【专利说明】结合ABCA1多肽的抗体
[0001]本发明涉及结合ABCAl多肽的抗体及其在检测ABCAl多肽的方法中的用途。
[0002]ATP 结合盒转运蛋白 Al (ATP-binding cassette transporter Al,ABCA1)是依赖ATP的转运蛋白，其介导胆固醇和磷脂向胞外缺乏脂质的HDL颗粒的流出。人ABCAl多肽的氨基酸序列在Seq.1d.N0.1中给出。ABCAl是通过磷脂和载脂蛋白的新生HDL颗粒的装配所必不可少的。ABCAl充当从细胞到载脂蛋白的脂质流出的关键调节物，并且因此参与降低动脉粥样硬化的风险。ABCAl在影响血浆HDL水平方面是关键性的。在肝和小肠中有活性，产生大部分循环的HDL。编码ABCAl的基因的缺陷被证明是家族性低α脂蛋白血症(familial hypoalphalipoproteinemia, FHA)的一个遗传病因。
[0003]市售的抗ABCAl抗体不适用于检测组织样品中的天然ABCAl多肽。
[0004]因此，需要能够检测组织样品中的天然ABCAl多肽的抗ABCAl抗体。
[0005]在第一方面，本发明涉及结合天然ABCAl多肽的分离的抗体。
[0006]在一个具体实施方案中，所述ABCAl多肽是人ABCAl多肽。
[0007]在另一个具体实施方案中，所述抗-ABCAl抗体是单克隆抗体。
[0008]在另一个具体实施方案中，所述抗体通过用表达ABCAl多肽(优选人ABCAl多肽)的全细胞免疫合适的动物来产生。
[0009]在另一个具体实施方案中，所述抗体包含可获自选自由杂交瘤细胞系ABCA1-3/84 (DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCA1-4/18 (DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系的抗体的VH结构域的⑶R3，和可获自选自由杂交瘤细胞系ABCA1-3/84 (DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系ABCA1-3/125 (DSMACC3110)和杂交瘤细胞系ABCAl-4/18(DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞的抗体的VL结构域的⑶R3。
[0010]在另一个一个具体实施方案中，所述抗体包含可获自选自由杂交瘤细胞系ABCA1-3/84 (DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCA1-4/18 (DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系的抗体的VH结构域的CDRl至CDR3，和可获自选自由杂交瘤细胞系ABCA1-3/84 (DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系ABCA1-3/125 (DSMACC3110)和杂交瘤细胞系ABCAl-4/18(DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞的抗体的VL结构域的⑶Rl至⑶R3。
[0011]在另一个具体实施方案中，所述抗体包含可获自选自由ABCA1-3/84(DSMACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系的抗体的VH结构域和VL结构域。
[0012]在另一个具体实施方案中，所述抗体由选自由杂交瘤细胞系ABCA1_3/84(DSMACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系产生。
[0013]在另一方面，本发明涉及选自由杂交瘤细胞系ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCA1-4/18 (DSMACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系。[0014]在另一方面，本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸包含编码可获自选自由杂交瘤细胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCAl-4/18(DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系的抗体的VH结构域的序列。
[0015]在另一方面中，本发明提供分离的核酸，所述分离的核酸包含编码可获自选自由杂交瘤细胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCAl-4/18(DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系的抗体的VL结构域的序列。
[0016]在另一方面中，本发明提供分离的核酸，所述分离的核酸包含编码由选自由杂交瘤细胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCA1-4/18 (DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系产生的抗体的序列。
[0017]在另一方面中，本发明提供包含本发明的核酸的载体和包含本发明的载体的宿主细胞。
[0018]在另一方面中，本发明提供产生抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞以产生所述抗体。
[0019]在另一方面中，本发明提供本发明的抗体在检测动物的组织样品中的ABCAl多肽中的用途。
[0020]在本发明的用途的一个具体实施方案中，所述组织样品是全血。
[0021 ] 在本发明的用途的一个具体实施方案中，所述动物是人受试者。
[0022]在另一方面中，本发明提供检测动物的组织样品中的ABCAl多肽的方法，所述方法包括:`[0023]a)提供所述动物的组织样品，
[0024]b)使用本发明的抗体检测步骤a)的样品中的ABCAl多肽。
[0025]在一个具体实施方案中，所述组织样品是全血。
[0026]在一个具体实施方案中，所述动物是人受试者。
[0027]在一个具体实施方案，步骤b)中的对ABCAl多肽的检测通过流式细胞术进行。
[0028]附图简述
[0029]图1显示术语“染色指数”。蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系 293。
[0030]图2a:在FACS测定中使用商业的抗-ABCAl抗体Novus DyLight488在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为1.54 (荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体稀释:1:200
[0031]图2b:在FACS测定中使用商业的抗-ABCAl抗体ab81950生物素在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为1.24(荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体稀释:1:200
[0032]图2c:在FACS测定中使用商业的抗-ABCAl抗体Novus生物素在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为1.28(荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体稀释:1:200[0033]图2d:在FACS测定中使用商业的抗-ABCA1抗体abl8180在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为1.41 (荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体稀释:1:200[0034]图2e:在FACS测定中使用商业的抗-ABCA1抗体ab66217在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为1.84(荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体稀释:1:200[0035]图3a:在FACS测定中使用本发明的抗-ABCAl抗体ABCA1-3/84在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为8.9 (荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体浓度:0.1 μ g/ml[0036]图3b:在FACS测定中使用本发明的抗-ABCAl抗体ABCA1-3/84在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为10.4(荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体浓度:1 μ g/ml[0037]图3c:在FACS测定中使用本发明的抗-ABCAl抗体ABCA1-3/84在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为10.5 (荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体浓度dOyg/ml[0038]图4a:在FACS测定中使用本发明的抗-ABCAl抗体ABCA1-3/125在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABC Al细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为49.7 (荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体浓度:0.1 μ g/ml[0039]图4b:在FACS测定中使用本发明的抗-ABCAl抗体ABCA1-3/125在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为47.0 (荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体浓度:1 μ g/ml[0040]图4c:在FACS测定中使用本发明的抗-ABCAl抗体ABCA1-3/125在表达ABCAl的FLP293细胞系(FLP293/ABCA1细胞系)中检测ABCAl表面表达；染色指数为46.9 (荧光FLP293ABCA1细胞系/荧光FLP293亲本细胞系);蓝色:表达ABCAl的FLP293细胞系；白色:亲本细胞系293。抗体浓度dOyg/ml。[0041]图5:利用两种不同的LXR激动剂和LPS在⑶14+单核细胞上的ABCAl的增量调节；将全血与LXR激动剂或LPS温育24h。ABCAl的检测通过FACS使用抗-ABCAl抗体ABCA1-3/125 进行。[0042]图6:产生的抗-ABCAl 单克隆抗体 ABCA1_3/84、ABCA1_3/125 和 ABCA1-4/18 的蛋白印迹分析。将以下细胞裂解液用于蛋白印迹法测试产生的抗-ABCAl单克隆抗体的特异性:[0043]第I道:刺激的THPI细胞-裂解液
[0044]第2道:未刺激的THPI细胞-裂解液
[0045] 第3 道:FLP293-hu-ABCAl (表达 ABCAl 的 FLP293 细胞系)
[0046]第4道:FLP293 (阴性对照)
[0047]第5道:MWM(分子量标记)
[0048]第6 道:HEK-293-hu-ABCAl (DB272_in pANITA2) _6His (表达具有 His 标签的人ABCAl蛋白的HEK细胞系)
[0049]图7:ABCA1蛋白的蛋白印迹分析。克隆4表达大量的ABCA1，这由检测到全长蛋白(约240-kDA)和一些较小的种类指示。比较起来，在未转染的FLP细胞系中没有检测到ABCAl蛋白。
[0050]图8 =ABCAlmRNA表达的qPCR分析:在过表达ABCAl的克隆4与亲本系之间相比，持家基因GAPDH的Cp值保持不变(18.00±0.24对比18.56±0.20)。相比之下，在未转染的系中Cp值指示极低的ABCAlmRNA表达(36.00 ±0.73)，而在克隆4-ABCA1系中Cp值指示高水平(21.64±0.48)。使用ddCp方法计算差异指示:与亲本FLP细胞系相比，克隆4表达更多的ABCAl转录产物(21，000倍)。
[0051]图9:在FACS测定中使用本发明的抗-ABCAl抗体ABCA1-4/18在THP-1细胞中检测ABCAl表面表达。用LXR激动剂过夜处理THP-1细胞以诱导ABCAl表达或用对照DMSO进行对照处理。将细胞用I U g/mlABCAl特异性抗体(克隆4/18)或同种型对照染色，之后用PE缀合的抗小鼠IgGl的第二抗体染色。抗-ABCAl抗体ABCA1-4/18产生基础ABCAl信号与同种型对照的良好分离。
[0052]图10:在FACS测定中使用本发明的抗-ABCAl抗体ABCA1-3/125在THP-1细胞中检测ABCAl表面表达。用LXR激动剂过夜处理THP-1细胞以诱导ABCAl表达或用对照DMSO进行对照处理。将细胞用I U g/mlABCAl特异性抗体(克隆3/125)或同种型对照染色，之后用PE缀合的抗小鼠IgGl的第二抗体染色。
[0053]图11:通过蛋白印迹法使用小鼠抗-ABCAlmAb克隆3/84显示ABCAl蛋白的人组织分布。
[0054]图12:利用小鼠抗-ABCAlmAb克隆3/84的在人肝中的ABCAl的免疫组化染色。绿色:位于肝细胞细胞膜中的ABCAl蛋白，以及蓝色:细胞核的DAPI染色。
[0055]本发明实施方案详述
[0056]术语“染色指数”当在本文中使用时被定义如下:
[0057]
染色指数=—^y.1 值炎.1:通度處.达.....ABCAl.......(!MlIJMM^
丨丨丨髓光强度ABCAHlj性的亲木细胞系
[0058]术语“抗体”涵盖不同形式的抗体结构，其包括但不限于完整抗体和抗体片段。本发明的抗体可以是人源化抗体，嵌合抗体，或另外的遗传改造的抗体，只要保持本发明的特征性质。
[0059]“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和形成自抗体片段的多特异性抗体。ScFv抗体在例如 Houston, J.S., Methods in Enzymol (酶学方法)? 203 (1991) 46-96)中进行描述。此外，抗体片段包含这样的单链多肽，其具有Vh结构域的特征，即能够与\结构域一起组装，或具有结合于ABCAl的\结构域的特征，即能够与Vh结构域一起组装形成功能性抗原结合位点并由此提供所述性质。
[0060]术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组分的抗体分子制剂。
[0061]术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fe受体(FcR)结合的特性。也将这种嵌合抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sc1.USA) 81 (1984) 6851-6855 ；US 专利号 5，202，238 和 5，204，244。
[0062]术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见例如，Riechmann，L.等，自然(Nature) 332 (1988) 323-327 ;和 Neuberger，M.S.等，自然(Nature) 314 (1985) 268-270。特别优选的CDR对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形 式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fe受体(FcR)结合的特性。
[0063]用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk, Μ.Α.和van de Winkel7J.G.,当前化学生物学观点(Curr.0pin.Chem.Biol).5 (2001) 368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见例如Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院学报)90 (1993) 2551-2555 Jakobovits,A.等，Nature (自然)362 (I993) 255_258 ；Brueggemann, Μ.等，Year Tmmunol.(免疫学年度)7 (1993) 33-40)。人抗体还可以在卩遼菌体展示文库中产生(Hoogenboom, H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J.D.等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole等和Boerner等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole 等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss, p.77 (1985);和 Boemer, P.等，J.1mmunol.147 (1991) 86-95)。如已经对按照本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或FcR结合的特性，例如通过“类别转换”即改变或突变Fe部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突变)进行。[0064]术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面定群(groupings),诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。
[0065]“可变结构域”(轻链的可变结构域(')，重链的可变结构域(Vh))用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链结构域。可变轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补决定区，⑶R)相连接。构架区采用(6-折叠构象且⑶R可以形成连接折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR—起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。[0066]用于本文时，术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FRi，CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域并且限定抗体的性质。按照Kabat等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service, National Institutes of Health), Bethesda,MD.(1991))的标准定义确定⑶R和FR区域，和/或来自“高变环”的那些残基。
[0067]术语“ABCA1多肽”在本文中使用是指来自任何动物(例如哺乳动物物种，包括人)的天然ABCAl多肽和ABCAl变体。ABCAl多肽可以分离自多种来源，包括人组织类型，或通过重组和/或合成方法制备。人ABCAl多肽的氨基酸序列在Seq.1d.N0.1中给出。
[0068]"分离的"抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95%或99%纯度，如由例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如，Flatman 等，J.Chromatogr.B848:79-87 (2007)。
[0069]“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然的染色体位置不同的染色体位置处。
[0070]“编码抗-ABCAl抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或分离的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
[0071]当在本文中使用时，术语"载体"是指能够使与其相连的另一种核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自身-复制核酸结构的载体以及结合到宿主细胞的基因组中的载体(所述载体已经被引入到所述宿主细胞中)。某些载体能够引导与其操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为"表达载体"。
[0072]可以使用重组方法和组合物例如如在美国专利第4，816，567号中所述的，来制备抗体。在一个实施方案中，提供编码本文所述的抗-ABCAl抗体的分离的核酸。这样的核酸可以编码包含所述抗体的\的氨基酸序列和/或包含所述抗体的Vh的氨基酸序列(例如，所述抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供包含这样的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，被转化以):(1)包含编码包含抗体的'的氨基酸序列和包含抗体的Vh的氨基酸序列的核酸的载体，或者(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的\的氨基酸序列的核酸，而所述第二载体包含编码包含抗体的Vh的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NSO、Sp20细胞)。在一个实施方案中，通过制备抗-ABCAl抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养如以上提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
[0073]为了重组制备本发明的抗体，分离编码抗体的核酸，例如如上所述的，并将其插入到一种或多种载体中用以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法容易地对这样的核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的募核昔酸探针)。
[0074]适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文中所述的原核和真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，尤其是在不需要糖基化和Fe效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如，美国专利号5，648，237,5, 789，199和5，840，523。(也参见 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以分离自可溶级分中的细菌细胞糊，并且可以被进一步纯化。
[0075]从生产单克隆抗体的杂交瘤克隆抗体基因的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以使用聚合酶链反应(PCR)利用免疫球蛋白特异性引物从杂交瘤细胞扩增可变重链和轻链结构域(Vh和Vl)的 遗传信息(Methods Mol Med.2004 ；94:447-58)。然后可以将编码可变重链和轻链结构域(％和八)的核酸克隆在合适的载体中以用于在宿主细胞中表达。
[0076]用于在生物学样品中检测和/或测量多肽的方法在本领域中是已知的，并且包括但不限于，蛋白印迹法，流式细胞术，ELISA或RIA，或多种蛋白质组学技术。例如，在蛋白印迹法中，能够结合变性蛋白的抗体，如多克隆抗体，可以用于检测ABCAl多肽。测量多肽的方法的实例是ELISA。此类蛋白定量是基于能够捕获特异性抗原的抗体，以及能够检测捕获的抗原的第二抗体。
[0077]优选的用于检测天然ABCAl多肽的方法是流式细胞术。流式细胞术方法描述于以下文献中:Handbook of Flow Cytometry Method(流式细胞术方法手册)，J.PaulRobinson(编者)；Flow Cytometry-A Basic Introduction(流式细胞术-基本介绍),Michael G Ormerod(2008)和 Current Protocols in Cytometry(2010), Wiley0
[0078]实施例和方法
[0079]本发明的单克隆抗人ABCAl抗体
[0080]以下三种生产针对人ABCAl的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系已经于2011年I月20日以霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche Ltd.)的名义交托DSMZ-(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,德国微生物和细胞培养物保藏中心)保藏，并且获得以下列出的保藏号:
[0081]ABCA1-3/84 = DSMACC3109[0082]ABCA1-3/125 = DSMACC3110
[0083]ABCA1-4/18 = DSMACC3111
[0084]单克隆抗人ABCAl抗体制备
[0085]ABCAl蛋白在哺乳动物细胞的细胞表面的表达。
[0086]使用表达质粒pANITA2在HEK细胞的细胞表面上表达人ABCAl胞外结构域。表达人ABCAl胞外结构域的、来源于HEK的细胞系通过稳定的转染建立。
[0087]为了获得高表达细胞系，在利用抗-FLAG抗体的表面染色后，通过荧光激活的细胞分选将转染子分离到高表达的细胞集群(pool)中。分选到高表达细胞集群中的细胞的平均荧光强度的判定条件为比所有转染子的平均荧光强度高2.1-4.3倍。
[0088]通过蛋白印迹分析测试表达人ABCAl的细胞系的表达，显示具有预期分子量的蛋白的闻水平的表达
[0089]ABCAl特异性抗体在用转染的HEK细胞免疫的小鼠中的开发
[0090]我们的方法使用稳定转染的哺乳动物细胞(HEK293)，所述细胞在其细胞表面上表达重组抗原。转染的细胞还用于测量血清转化，杂交瘤选择和抗体表征。通过以其天然构象递呈抗原以用于免疫和杂交瘤选择，该过程促进能够结合内源蛋白的抗体的生成。
[0091]通过免疫纯化重组蛋白产生免疫复合物，并且使用这些免疫复合物作为免疫抗原，从而获得免疫原。免疫纯化通过蛋白印迹分析使用抗-His标签单克隆抗体确认。
[0092]将用免疫复合物免疫的小鼠的脾细胞与PAI骨髓瘤细胞融合以产生B细胞杂交瘤。将融合的细胞分配到微滴定培养板孔中。为了确定生产ABCAl特异性抗体的杂交瘤细胞，使用两步筛选方法，所述方法完全不`需要纯化的重组蛋白。首先通过ELISA测试所有培养物的孔用于IgG产生。在第二步中，通过IFA对所有IgG产生为阳性的孔进行结合转染的细胞的抗体的筛选。被点在多孔载玻片上的转染的和未转染的HEK细胞用个体杂交瘤上清液染色并且通过荧光显微术分析。未转染的HEK细胞充当每个样品的阴性对照。
[0093]通过蛋白印迹法检验对产生的单克隆抗体ABCA1-3/84、ABCA1-3/125和ABCA1-4/18的特异性(图6)。THPl =人单核细胞细胞系。
[0094]细胞培养物
[0095]将人胚肾细胞(Flip_In293细胞，Invitrogen)保持在补充以10%胎牛血清、2mML-谷氛酸胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco，s modified Eagle，smedium, DMEM)中。使用Fugene-6 (Roche Biochemicals)转染细胞，如由生产商所述的。
[0096]将人外周血单核细胞(THP-1，ATCC_F-6430)培养在补充以0.05mM2-巯基乙醇(Invitrogen)和 10%热失活 FBS (Invitrogen)的 RPMI_1640Glutamax (Invitrogen)中。细胞浓度不超过1E06个细胞/ml。最大传代数为30。
[0097]质粒:将编码全长人ABCAl的6.5_kb DNA片段亚克隆到XhoI消化的、Klenow加载的质粒PN721中。在序列验证后，回收6.5-kb片段并且进一步将其亚克隆到质粒pCDNA5-FRT (Invitrogen)中。
[0098]制备ABCAl稳定的细胞系
[0099]表达人ABCAl的单克隆的稳定细胞系通过以下方法获得:一起共转染pcDNA5-FRT-ABCAl 和 pOG44 质粒(Invitrogen),使用 Fugene-6 (Roche Biochemicals),在生长培养基中，在不存在zeocin的情况下,根据制造商的建议进行。转染后一天，加入潮霉素B至终浓度50 u g/ml，并且每3-4天更换培养基直至出现潮霉素B抗性菌落。选择个体菌落并且使其进一步在潮霉素B的存在下增殖。通过定量PCR和蛋白印迹分析评估个体克隆的ABCAl表达。基于这些结果，选择克隆4作为基础的高ABCAl表达细胞系。
[0100]ABCAl蛋白表达的蛋白印迹分析:以IO6个细胞/孔将FLP或克隆4细胞在12孔板中培养48小时。在Laemmli缓冲液/核酸酶(benzonase)中裂解细胞并且将变性的样品施用到3-8% Tris-醋酸凝胶并且通过一维凝胶电泳分离。分离的蛋白通过电印迹(electroblotting)转移到膜上。通过与小鼠单克隆Ab ABCAl (Neuromics)以及之后的山羊抗-小鼠IgG-HRP (Abcam#20043)温育来检测ABCAl (图7)。
[0101]人组织的蛋白印迹分析:使用来自Biochain Institute, Inc., Hayward, CA94545,USA的人组织裂解液。以与前文所述相同的方式进行印迹法。通过与小鼠抗-ABCAlmAb (克隆3/84)以及之后的山羊-抗-小鼠IgG-HRP温育来检测ABCAl (图11)。
[0102]ABCAlmRNA表达的定量PCR分析:以5x10s个细胞/孔将FLP或克隆4细胞在96孔板中在37°培养48小时。使用自动化系统根据制造商的说明(Qiagen)分离总RNA。在Lightcycler480仪器(Roche)上使用一步试剂混合物(Qiagen)和探针/引物组(AppliedBiosystems)进行实时定量RT-QPCR从而检测ABCAl和GAPDH mRNA的相对表达。数据表示为平均Ct值(N = 8孔/条件)+/_SD(图8)。[0103]抗体和第2步试剂
[0104]测试其对ABCAl的特异性的市售的单克隆第一抗体来自Abeam?和:Ncwusr (克隆HJl和克隆AB.H10)。测试的兔多克隆抗体来自Abeam? (ab81950)。第二步试剂链霉亲和素 PE 和山羊-Ct -小鼠 IgG PE 来自 Southern Biolcclinolog}'.=
[0105]除了商业抗体以外，评估内部生产的三种鼠抗-ABCAl杂交瘤上清液在流式细胞术中在检测ABCAl方面的表现。通过应用第二试剂(来自Southern Biotechnologylv的链霉亲和素PE、山羊-抗-小鼠IgG PE和IgGlPE)进行检测。纯化两种克隆(克隆ABCA1-3/84和ABCA1-3/125)的杂交瘤上清液，再测试并滴定。在之后的时间点，测试来源于克隆ABCA1-3/18的抗体并且与使用THP-1细胞的ABCA1-3/125进行比较。将以下抗体用于鉴别特异性人血亚群:CD3Pacific blue，克隆UCHT1，CD14PerCP_Cy5.5，克隆M5E2，CD15APC，克隆 HI98，CD16APC-Cy7，克隆 3G8，CD19PE_Cy7，克隆 SJ25CI 和 CD66b FITC,克隆G10F5。所有CD标记特异性抗体获自Becton Ikkmsun'
[0106]FLP293、来源于FLP293的细胞和THP-1细胞的FACS分析
[0107]对于FACS分析，将FLP293细胞用不含钙和镁的D-PBS (Ci丨bco 1:_)清洗并且与
0.02% EDTA (Sigma?)温育。在收获后，将其用冷的d-pbs洗涤两次，之后进行抗体染色。简言之，将0.8-lxlO6个细胞/样品重悬在100 U I含有1:200稀释的第一抗体的BD染色缓冲液/2% FCS(Becton Diekmsoulf )中。温育时间为在+4°C在黑暗中45分钟。将细胞用冷的BD染色缓冲液/2% FCS洗涤一次并且加入100 u I稀释在BD染色缓冲液/2% FCS中的第二步试剂。在于+4°C在黑暗中温育45分钟并且用冷的BD染色缓冲液/2% FCS洗涤两次后，分析所述细胞。以与以上关于FLP293细胞所述的相同的方式处理非粘附的THP-1细胞，但是省去了在含有EDTA的缓冲液中温育。[0108]在FACS Canto II (Becton Dickinson? )上分析细胞。利用 FlowJo 软件
(Tree Star* )进行评估。
[0109]ABCAl全血测定和FACS染色
[0110]对于全血FACS分析，在所有例子中使用内部生产的抗-ABCAl克隆3/125。将全Na-肝素血与指定的激动剂在37°C温育24小时。在温育后，将初级抗-ABCAl特异性抗体以1:800的最终稀释加入到100 μ I的全血中，在冰上，在黑暗中，进行30分钟。
[0111]红细胞用Ix红细胞裂解缓冲液(Becton Diekmsoi/ )裂解并洗涤。随后，加入I:250 稀释的 100 μ I 的次级山羊-a - /Jn 鼠 IgGiPE (Southern Biotechnology?^)并在 +40C温育20分钟，随后是两次洗涤步骤。
[0112]在+4°C在黑暗中加入细胞亚群特异性抗体20分钟，之后在分析前进行洗涤步骤。
[0113]细胞在FACS Canto II (Becton Dickinson?' )上分析。利用 FlowJo 软件(Tree Star* )进行评估。
[0114]免疫组化染色
[0115]对人肝FFPE切片(5mm, Biochain)进行脱/K，利用柠檬酸缓冲液(ThermoScientific)进行超声处理，并且与小鼠抗-ABCAlmAb (克隆3/84, lmg/ml)温育I小时，之后是第二抗体检测(lmg/ml进行I小时，Alexa I'luor? 488驴抗-小鼠IgG(H+L)，Invitrogen, Basel, Switzerland)和 DAPI 染色
[0116]虽然为了清楚理解已经通过说明和实例在一些细节上描述上述发明，但是描述和实施例不应被视为限制本 发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚地并入。
【权利要求】
1.结合ABCAl多肽的分离的抗体，其中所述抗体结合天然ABCAl多肽。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述ABCAl多肽是人ABCAl多肽。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其是单克隆抗体。
4.根据权利要求1至3所述的分离的抗体，其中所述抗体通过用表达所述ABCAl多肽、优选人ABCAl多肽的全细胞免疫合适的动物产生。
5.根据权利要求1至4所述的分离的抗体，其中所述抗体包含可获自选自由杂交瘤细胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCAl-4/18(DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系的抗体的VH结构域的⑶R3，和可获自选自由杂交瘤细胞系ABCA1-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系ABCA1-3/125 (DSMACC3110)和杂交瘤细胞系ABCA1-4/18 (DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞的抗体的VL结构域的⑶R3。
6.根据权利要求1至5所述的分离的抗体，其中所述抗体包含可获自选自由杂交瘤细胞系 ABCA1-3/84 (DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCAl-4/18(DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系的抗体的VH结构域的CDRl至CDR3，和可获自选自由杂交瘤细胞系ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCA1-4/18 (DSM ACC3111)组成的组的杂交瘤细胞的抗体的VL结构域的⑶Rl至⑶R3。
7.根据权利要求1至6所述的分离的抗体，其中所述抗体包含可获自选自由ABCA1-3/84 (DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCA1-4/18 (DSM ACC 3111)组成的组的杂交瘤细胞系的抗体的VH结构域和VL结构域。
8.根据权利要求1至7所述的分离的抗体，其中所述抗体由选自由杂交瘤细胞系ABCA1-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSMACC3110)和杂交瘤细胞系ABCA1-4/18 (DSMACC3111)组成的组的杂交瘤细胞系产生。
9.杂交瘤细胞系，其选自由杂交瘤细胞系ABCAl-3/84(DSMACC3109)、杂交瘤细胞系ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)组成的组。
10.分离的核酸，其包含编码可获自杂交瘤细胞系的抗体的VH结构域的序列，所述杂交瘤细胞系选自由杂交瘤细胞系ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)组成的组。
11.分离的核酸，其包含编码可获自杂交瘤细胞系的抗体的VL结构域的序列，所述杂交瘤细胞系选自由杂交瘤细胞系ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)组成的组。
12.分离的核酸，其包含编码杂交瘤细胞系产生的抗体的序列，所述杂交瘤细胞系选自由杂交瘤细胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、杂交瘤细胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和杂交瘤细胞系ABCAl-4/18(DSM ACC3111)组成的组。
13.载体，其包含根据权利要求10至12所述的核酸。
14.宿主细胞，其包含根据权利要求13所述的载体。
15.产生抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求16所述的宿主细胞以致产生所述抗体。
16.根据权利要求1至8所述的抗体在检测动物的组织样品中的ABCAl多肽中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述组织样品是全血。
18.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述动物是人受试者。
19.检测动物的组织样品中的ABCAl多肽的方法，所述方法包括: a)提供所述动物的组织样品， b)使用权利要求1至8的抗体检测步骤a)的样品中的ABCAl多肽。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组织样品是全血。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述动物是人受试者。
22.根据权利要求19至21所述的方法，其中步骤b)中对ABCAl多肽的检测通过流式细胞术进行。
23.如本文之前、尤其 是关于前述实施例所述的发明。
【文档编号】C07K16/18GK103596976SQ201280029293
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年6月12日 优先权日:2011年6月15日
【发明者】芭芭拉·埃卡贝尔特, 于格·马蒂勒, 埃弗森·诺戈切克, 伯恩哈德·赖斯, 王海燕 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司