表面涂布假单胞菌菌毛蛋白肽的结构的制作方法
【专利摘要】本发明涉及方法和组合物，其中使D型或逆-倒位假单胞菌菌毛蛋白肽，任选具有共价连接到所述肽的聚乙二醇部分，结合到基底。所公开的方法和组合物可用于减少摩擦系数，抑制非假单胞菌的生物膜形成，用于减少针对材料的炎性反应，用于减少金属腐蚀，并可用于生物传感器应用中。
【专利说明】表面涂布假单胞菌菌毛蛋白肽的结构
发明领域
[0001 ] 本发明涉及采用D型或逆-倒位(retro-1nverso) IV型铜绿假单胞菌(P.aeruginosa) (T4P)菌毛蛋白肽的材料涂层的领域,所述菌毛蛋白肽任选缀合到聚乙烯部分；并涉及其方法和应用。
[0002]直量
细菌的IV型菌毛是宿主群集(colonization)和毒力(对于许多革兰氏阴性菌而言)所必需的，并且还可能在一些革兰氏阳性菌的发病机理中起作用。IV型菌毛从细菌表面伸出并介导与生物和非生物表面的特异性附着。负责这种结合的菌毛结合结构域在位于该蛋白的C-末端区的12-17 二硫环区(disulfide-loop)内编码，而仅含有该区的合成肽例如由来自铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白的残基128-144组成的二硫环肽已显示与生物和非生物表面结合。
[0003]本发明人和同事们最近已经证明，菌毛蛋白衍生的蛋白纳米管(PNT)以高亲和力结合到不锈钢，并且该结合事件显示出是C-末端端结合的(tip-associated),通过对应于IV型菌毛蛋白肽结合结构域的合成肽竞争性抑制PNT结合来进行(Yu，B.等人，J.Bionanoscience, 1:73-83 (2007)。随后本发明人和同事们进一步证明，衍生自C-末端受体结合结构域的菌毛蛋白肽，当结合到非生物表面(例如不锈钢、锡、铝、钛、铬、塑料、玻璃、硅酸盐、陶瓷及其混合物)时，能够抑制该涂布的表面上细菌生物膜的形成(U.S.20080287367)。
[0004]最近，本发明人已发现，含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白C-末端受体结合蛋白的二硫环的合成菌毛蛋白肽与一些金属的结合显著增强金属的某些纯粹的表面性质，即，独立于生物膜形成的性质，且在一些金属中改变表面的电子性质，以一定方式使其可用于例如生物传感器应用中(USSN 12/899,958)。
[0005]发明概沭
一方面，本发明包括处理管道以减少流过该管道的流体的摩擦拽力的方法，即通过向所述管道引入携带缀合物的液体的步骤，所述缀合物是以下的缀合物:(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量有效地通过使菌毛蛋白肽附着于管道壁而减少流过管道的流体的摩擦拽力。
[0006]所述菌毛蛋白肽缀合物可以是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。所述肽缀合物中的聚乙二醇部分可具有介于0.2-500 kDal之间的分子量。所述菌毛蛋白肽可以具有确定为SEQ ID NO: 10的序列，包括确定为SEQ ID NO: 3、4或9的示例性序列。
[0007]所述菌毛蛋白肽缀合物所附着的管道内表面可以是金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面。示例性的金属包括不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金。
[0008]附着于管道内壁的菌毛蛋白肽缀合物的量或表面密度可足以降低可腐蚀的金属例如不锈钢的腐蚀速率，和/或足以减少流体的摩擦拽力，所述流体例如引入管道中的含砂浆液。
[0009]可通过在正常操作期间将所述肽缀合物定期加入到引入管道中的流体中，将菌毛蛋白肽缀合物引入管道中。
[0010]另一方面，本发明包括具有用缀合物涂布的一个或多个暴露的金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面的制品，所述缀合物是以下的缀合物:(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量足以减少所述一个或多个暴露表面的摩擦系数。示例性的菌毛蛋白肽如上所述。
[0011]所述制品的一个或多个暴露表面可以是金属表面，例如不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金的表面，并且涂布所述表面的肽缀合物可以足以降低所述表面的腐蚀速率，和/或足以减少流过所述管道的流体的摩擦拽力的量存在。
[0012]在一个实施方案中，所述制品是宽度尺寸为100微米或更小的微流体通道，其内壁表面用肽缀合物涂布并且涂布该表面的肽缀合物以足以减少流体流过所述通道的摩擦拽力的量存在。
[0013]在第2个实施方案中，所述制品包括砂颗粒，其外表面用足量的所述肽缀合物涂布，以减少该涂布的 颗粒浆液流过管道的摩擦拽力。
[0014]在第3个实施方案中，所述制品是具有活动件的机器，其涂布肽的表面是彼此移动接触的。
[0015]在第4个实施方案中，所述制品是具有用所述肽缀合物涂布的暴露的金属表面的电子器件或元件。
[0016]在第5个实施方案中，所述制品是具有不锈钢或钛表面的矫形植入器件，并且涂布该表面的所述肽缀合物以足以抑制该涂布表面上生物膜形成的量存在。
[0017]再一方面，本发明包括一种制品，所述制品包括(i)具有暴露的表面的元件，所述表面可在普通使用条件下被非假单胞菌细菌用作生物膜形成的基底，和(ii)与所述表面结合的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制这类非假单胞菌细菌的生物膜形成。示例性的被抑制的细菌包括利斯特氏菌{Listeria、或葡萄球菌{Staphylococcus)。
[0018]再一方面，本发明包括在处理具有暴露的晶粒边界区的表面的金属材料的方法中为了降低所述材料的腐蚀速率的改进。所述改进包括:使所述材料中的暴露的表面边界区与D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽接触，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制所述材料的腐蚀速率。示例性的金属包括不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金。示例性的菌毛蛋白肽和菌毛蛋白肽缀合物如上所述。
[0019]结合到所述金属的肽或肽缀合物的量可有效使暴露的晶粒边界区的电子功函变化至少0.3 eV EFW单位并使暴露的晶粒边界区的硬度增加至少20%，所述硬度通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击(striking)金属表面产生的纳米压痕来测定。当金属是不锈钢时，结合的肽或结合的肽缀合物的量可有效使涂布表面的腐蚀速率降低至少约30%，所述腐蚀速率通过穿过表面的腐蚀电流来测定。
[0020]当金属材料是多孔或网状的时，可实施接触步骤以使菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。当金属材料具有暴露的晶粒边界区时，接触步骤可有效使菌毛蛋白肽与所述晶粒边界区选择性地结合，由此通过优先保护在其晶粒边界区处的表面来增强金属表面的硬度和腐蚀抗性。
[0021]还公开的是抑制对设计成植入受试者内的医疗器件的炎性反应的方法。所述方法包括:在植入所述器件之前，用合成菌毛蛋白肽涂布所述器件的暴露的表面，所述合成菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环，(?)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两个末端侧的0-10个额外残基，和(iii)由逆-倒位(RI)型的D-氨基酸组成，和任选具有共价连接于所述肽上的聚乙二醇部分。优选的肽和肽缀合物如上所述。
[0022]另一方面，本发明包括用于检测分析物的生物传感器器件。所述器件包括:(a)导电金属基底，其具有(i)生物传感器表面(ii)与所述基底表面结合的D型(RI)合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，和(iii)直接或间接地共价连接于所述菌毛蛋白肽的受体，和(b)用于检测响应分析物相关配体与表面结合的受体的结合的穿过基底表面的电学性质变化的检测器。
[0023]所述生物传感器基底可以由不锈钢形成，并且结合在其上的菌毛蛋白肽可以是D型菌毛蛋白肽，任选缀合到聚乙二醇部分。在一个实施方案中，可以使用菌毛蛋白肽的组合，例如，使用PEG-D-菌毛蛋白肽缀合物以减少与样品化合物的非特异性相互作用，和R1-菌毛蛋白肽(有或没有PEG部分)以将靶配体连接到生物传感器表面，或者直接通过配体与肽的共价连接或通过间接方式，如下所述。
[0024]所述受体可以通过卷曲螺旋E/Κ螺旋对而共价连接于菌毛蛋白肽，所述螺旋对中的一个共价连接于菌毛蛋白肽，而另一个则连接于受体上。
[0025]再一方面，本发明包括使化合物共价连接于由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底的一个或多个暴露表面的方法，所述方法通过以下步骤:(a)使所述基底的一个或多个暴露表面与D型合成菌毛蛋白肽接触，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，由此使所述菌毛蛋白肽共价地结合到一个或多个暴露表面，和(b)在所述接触和结合之前或之后，使所述化合物共价连接于所述菌毛蛋白肽，或者，连接于PEG-菌毛蛋白-肽缀合物中的PEG部分。优选的菌毛蛋白肽和肽缀合物如上所述。
[0026] 当基底表面具有暴露的晶粒边界区时，所述接触步骤有效使所述化合物优先定位在暴露的晶粒边界区处。当所述材料是多孔或网状的时，所述接触步骤可有效使所述菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。[0027]还公开的是基底，其表面结合有(i) D型合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，和(ii)化合物，所述化合物直接或间接地共价连接于所述菌毛蛋白肽或连接于PEG-菌毛蛋白肽缀合物中的PEG部分。
[0028]所述基底可以是金属，例如不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金，并且可以用作生物传感器电响应元件，其中所述化合物是通过共价键直接连接于所述菌毛蛋白肽或通过Κ/E螺旋的/螺旋对间接连接于所述菌毛蛋白肽的分析物受体分子，其中所述螺旋中的一个共价连接于所述菌毛蛋白肽，而另一个螺旋共价连接于所述化合物。不锈钢基底可由于与其表面结合的菌毛蛋白肽而具有改变的电子功函。
[0029]当阅读以下详述以及附图时，本发明的这些和其它目标和特征将会更加显而易见。
[0030]附图简沭
图1A-1D显示多个细菌属/种/菌株中IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合结构域的序列；
图2A和2B的图显示对未涂布的不锈钢或用L型K122-4(2A)和PAO (2B)菌毛蛋白肽涂布的不锈钢进行的粘合力(adhesive force)测量；
图3A和3B的图显示未涂布的不锈钢或用L型K122-4 (3A)和PAK (3B)菌毛蛋白肽涂布的不锈钢的电子功函(EWF)；
图4显示在两个月时期内得到的涂布和未涂布的不锈钢的EWF测量结果；
图5显示在800 nM负荷下涂布肽的和未涂布的不锈钢的力位移(force-dispIacement)曲线；
图6A和6B显示在20 μΝ (6Α)和50 μΝ (6Β)负荷下进行的纳米压痕试验的结果；
图7Α和7Β是在增加负荷下的涂布肽的(7Α中是ΡΑ0，7Β中是Κ122-4)和未涂布的不锈钢的位移测量图；
图8Α和8Β是未涂布的(8Α)和涂布Τ4Ρ17菌毛蛋白肽(8Β)的不锈钢基底与AFM尖端之间的电流的导电率AFM表面图；
图9Α-9Β是涂布的和未涂布的不锈钢表面的腐蚀特性的测量，显示涂布菌毛蛋白的不锈钢的腐蚀电流(Icorr)显著小于未涂布的不锈钢的腐蚀电流(9Α)，涂布菌毛蛋白的和未涂布的不锈钢的腐蚀电位(Ecorr)没有显著区别(9Β)；
图1OA和IOB的图显示涂布菌毛蛋白的不锈钢的腐蚀速率显著低于未涂布的不锈钢(10Α)，与未涂布的不锈钢相比，抗极化性显著更高(IOB)；
图11显示，当菌毛蛋白肽与另一个肽(在此例子中，亮氨酸-拉链型E螺旋或E/Κ卷曲螺旋)缀合时，与金属表面结合的菌毛蛋白肽的腐蚀抑制作用可逆转；
图12A-12C的照片显示未涂布的(12Α)、用菌毛蛋白肽涂布的(12Β)或用具有连接于菌毛蛋白的螺旋-螺旋双链体的菌毛蛋白肽涂布的不锈钢样品上的腐蚀的视觉效应；
图13显示，在采用增加量的外源肽的竞争性结合分析中，已结合的菌毛蛋白肽没有被从不锈钢表面置换；
图14是未涂布的和涂布Κ-122-4菌毛蛋白肽的不锈钢样品的XPS图；图15A和15B显示涂布L-型和D-型菌毛蛋白肽两者的不锈钢样品的粘合力测量结果(15A)和涂布相同的L-型和D-型菌毛蛋白肽的不锈钢样品的EWF力测量结果(15B)；
图16A和16B显示菌毛蛋白肽(D-型)与不锈钢支架(16A)和与玻璃表面(16B)紧密结合的能力；
图17A和17B的柱形图显示与不锈钢样品结合的L-氨基酸和D-氨基酸菌毛蛋白对蛋白酶消化的相对抗性；
图18A和18B的示意图显示根据本发明的一个实施方案构建的生物传感器器件的运
行；
图19说明生物传感器中的分析物结合步骤，其中，分析物结合试剂R通过菌毛蛋白肽直接连接于生物传感器表面；
图20说明生物传感器中的分析物结合步骤，其中，分析物结合试剂R通过菌毛蛋白肽卷曲螺旋复合物连接于生物传感器表面；
图21显示本发明的生物传感器中的不同检测构型；
图22A和22B是结合分析物与受体结合之前和之后在生物传感器器件中记录的循环伏安法图，其中，22B是图22A中矩形面的放大图；
图23A和23B说明根 据本发明的一个更一般性实施方案构建的分析物检测器件；
图24A-24D是柱形图，显示T4P17菌毛蛋白肽与不锈钢(24A)、冠状支架(24B)、Foley(乳胶)导管(24C)和中央静脉(硅酮)导管(24D)的结合；
图25A和25B是蛋白质印迹(25A)和柱形图(25B)，显示D-菌毛蛋白肽涂层对针对未涂布的和涂布菌毛蛋白的钛或不锈钢表面的PBMC免疫反应的影响；
图26A和26B显示蛋白质印迹(26A)和柱形图(26B)，显示D-菌毛蛋白肽涂层对针对未涂布的和涂布菌毛蛋白的钛或不锈钢表面的人巨噬细胞免疫反应的影响；
图27A-27D显示用多种形式的K122-4菌毛蛋白肽涂布的不锈钢的特征，K-122-4的borg sEWF，对于EWF (27A和27B)、纳米压痕(27C)和腐蚀速率(27D)；
图28A-28C是显示未涂布的钛或者涂布D型、逆-倒位或D型-PEG菌毛蛋白肽的钛的电子功函(EWF)的图；
图29显示在未涂布的或者涂布D型、逆-倒位或D型-PEG菌毛蛋白肽的钛表面上的表面显微压痕作用；
图30A-30E显示以指定的力水平在钛板上的大块(bulk)显微压痕作用；
图31A和图31B显示在钛板上测定的粘合力(图31A)，以及在不锈钢板上测定的腐蚀速率(31B)，这两者是对于未涂布的或涂布PEG-D型菌毛蛋白肽的板而言；
图32A-32E是未涂布的钛(31A)、涂布PEG-D型菌毛蛋白肽的钛(32B)、涂布逆-倒位型的菌毛蛋白肽的钛(32C)、涂布D型菌毛蛋白肽的钛(32D)、以及涂布逆-倒位和D型菌毛蛋白肽的组合的钛(32E)的代表性的摩擦系数图；
图33A-33F表示比较L-菌毛蛋白肽、R1-菌毛蛋白肽和D型肽与不同材料结合的数据，所述材料包括不锈钢(33A，部分1-9和28B)、钛(33C，部分A和B)、聚氨酯(33D)、聚砜(33E，部分A和B)和硅酮(33F)；
图34显示当施加50 mA电流达10分钟时，结合对照(bound control, Ig)肽、L型菌毛蛋白肽(L)、RI菌毛蛋白肽(RI)和D型菌毛蛋白肽从不锈钢表面的相对损失；图35A-3?的图显示无害利斯特氏菌{Listeria innocua)的不同菌株(35A)和单核细胞增生利斯特氏菌{Listeria monocytogenes)的3个菌株(35B-3OT)的细菌对涂布D型菌毛蛋白肽、RI菌毛蛋白肽或D+RI菌毛蛋白肽的不锈钢板、或未涂布的对照的生物膜抑制程度；
图36A-36F的图显示不同种的葡萄球菌{Staphylococcus')细菌对涂布D型菌毛蛋白肽、RI菌毛蛋白肽、或D+RI菌毛蛋白肽的不锈钢板、或未涂布对照的生物膜抑制程度；和图37A-37C显示施加到不锈钢的非常小一滴PEG-D-菌毛蛋白肽的细菌抑制作用。
[0031]发明详沭 I.定义
“菌毛”是在许多细菌的表面上发现的毛状附器。
[0032]菌毛蛋白是用于菌毛的蛋白亚基的通称。
[0033]“IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白”或“T4P菌毛蛋白肽”或“菌毛蛋白肽”是指铜绿假单胞菌细菌用于产生能动力的菌毛结构，通过使菌毛的末梢附着于生物的或非生物的表面并收缩菌毛以便拖动细菌向前来实现。所有IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛都含有C-末端受体结合区，其氧化形式含有可归类为12-残基环或17-残基环的二硫环。图1显示其C-末端菌毛蛋白区已测序的多个细菌种的二硫环区。
[0034]“衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环”是指其氨基酸序列对应于已知的细菌二硫环氨基酸序列的二硫环，所述已知的细菌二硫环氨基酸序列例如通过SEQ ID N0:4确定的铜绿假单胞菌菌株PAK序列，或者作为两个或更多个不同的细菌种和/或细菌菌株之间二硫环序列中的一个或多个氨基酸变化的置换形成的序列之一，例如SEQ ID NO: 10中含有的序列之一，其作为四个铜绿假单胞菌菌株PAK、PA0、PA82935和K-122-4的二硫环序列的组合形成。
[0035]“合成肽”指通过固相或重组肽合成而形成的肽。
[0036]“由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底”意指由不锈钢、锡、铁或钛或这些金属中的两种或更多种的混合物形成的金属基底，或用不锈钢、锡、铁或钛或它们的混合物涂布的金属或非金属基底。基底可以含有小比例的其它金属，尤其是来自周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属，包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、钼、金、铬(存在于不锈钢中)和汞。
[0037]“T4P菌毛蛋白肽与由不锈钢、锡、铁或钛形成的金属基底的共价连接”意指菌毛蛋白肽通过键连接于金属表面，其(i)抵抗被游离的菌毛蛋白肽置换，且(ii)具有变化的电子功函(EWF)，表明材料的表面电子轨道(e-orbital)发生变化。菌毛蛋白肽与此类金属基底的共价连接还可表征为:(i)表面粘合力的改变、(ii)表面硬度的改变、(iii)导电率的改变和/或(iv)结合能峰的改变(通过X-射线光电子光谱法(XPS)观察到的)。
[0038]“具有共价结合的化合物的金属基底”表示具有与基底表面共价结合的T4P菌毛蛋白肽，和与菌毛蛋白肽直接或间接共价结合的不是菌毛蛋白的蛋白质另一部分的化合物的不锈钢、锡、铁或钛基底。当化合物通过高亲和力结合对(例如卷曲螺旋亮氨酸-拉链对、生物素-抗生物素蛋白对，等等)与菌毛蛋白肽连接时，其中，所述对的一个成员与菌毛蛋白肽共价连接，而另一个成员与化合物共价连接；化合物与T4P菌毛蛋白肽间接共价结合。
[0039]金属基底的“暴露的晶粒边界区”指出现晶粒边界，即，形成基底的金属原子的两个多晶取向的界面处的基底的表面区。[0040]“使菌毛蛋白肽优先定位于暴露的晶粒边界区”是指，菌毛蛋白肽和共价连接于菌毛蛋白肽的任意化合物在晶粒边界区比在晶粒边界区之间的暴露表面区具有更大的分子浓度和/或更大的表面涂层厚度。
[0041]“L型T4P菌毛蛋白肽”或“L型菌毛蛋白肽”是指由L-对映体的氨基酸残基(L-氨基酸残基)组成的T4P菌毛蛋白肽。
[0042]“D型T4P菌毛蛋白肽”或“D型菌毛蛋白肽”是指主要或排他地由D-对映体的氨基酸残基(D-氨基酸残基)组成的T4P菌毛蛋白肽。具体地讲，D型T4P菌毛蛋白肽含有大于50% D-氨基酸残基，和优选全为D-氨基酸，其中任何其余残基为L-氨基酸。D型T4P菌毛蛋白肽是抗蛋白酶的，并且该肽中的任何L-对映体的氨基酸应当位于菌毛蛋白肽序列内，使得它们不会显著损害该蛋白酶抗性。可如下确定这些位置:通过在各个可能的位置上形成具有单个L-氨基酸取代的一系列D型菌毛蛋白肽并测试单取代肽对于各种蛋白酶的抗性。
[0043]“逆-倒位T4P菌毛蛋白肽”或“逆-倒位菌毛蛋白肽”或“RI菌毛蛋白肽”是指具有D-对映体的氨基酸残基的倒转序列的T4P菌毛蛋白肽，其将该氨基酸侧链放置在正确的相对位置中，如下所述。逆-倒位T4P菌毛蛋白肽是抗蛋白酶的。
[0044]“聚乙二醇”或“PEG”是指线状或分支的乙二醇聚合物，并且可包括少至5个单体单元和至多数千个单元，分子量范围介于0.2 kD至500 kD之间或更高，其中所指定的大小是指PEG的平均分子量。“聚乙二醇部分”是指如上所述的菌毛蛋白肽和聚乙二醇的“缀合物”的聚乙二醇部分(portion或moiety)。所述缀合物通常是共价缀合物,其中聚乙二醇部分共价连接于菌毛蛋白肽的C-末端和/或N-末端氨基酸。
[0045]I1.菌毛蛋白狀
图1A-1D显示序列信息可获得的各种细菌属/种/菌株的含二硫环的C-末端菌毛蛋白肽区的序列。给出的序列包括二硫环序列(以半胱氨酸残基(C)开始和结束)并在一些情况下包括在所述环任意一侧的至多5个或更多个残基。单字母氨基酸命名根据标准惯例。在肽的正常氧化形式中，肽含有在半胱氨酸残基之间的二硫桥。
[0046]本发明中采用的合成肽包括或衍生自图1A-1D中显示的一个或多个序列。当序列包括所显示序列中的一个时，其可以包括单独的二硫环，或者所述环可以另外包括在环的N-末端侧或C-末端侧中任意一侧或这两侧的至多10个、优选5个或更少的残基，其中，附加的非环残基典型地包括或衍生自一个或多个相邻的非环序列。更一般地，环区和非环区的序列都可通过使这些序列(优选地在二硫环中具有相同或几乎相同数量的残基的序列)排成一行而衍生自两个或更多个序列。例如，在图1A中，对应于铜绿假单胞菌菌株PAO (SEQID NO: 3),PAK (SEQ ID NO: 4)、PA82935 (SEQ ID NO: 7)和 K122-4 (SEQ ID NO: 9)的四个肽含有14-聚体(mer) 二硫环。通过使来自图1A中的四种铜绿假单胞菌菌株的二硫环序列排成一行，形成了 组合的序列 K/A/S/T-C-T/K/A-S/T-D/T/N-Q/V/A-D/E-E/IP/A/N-Q/M/K-F/Y-1/T/R/L-P-K/N-G/T—C-S/D/T/Q/N-K/N/D/T (SEQ ID NO: 10)。该 17-残基的肽(也一般称为T4P17)包括14个二硫环残基，单个上游(N-末端侧)非环残基和两个下游非环残基。该序列内的示例性序列包括衍生出SEQ ID NO: 10的实际4个不同的序列，SP，对应于 PAK (SEQ ID NO: 3)、PAO (SEQ ID NO: 4)、PA82935 (SEQ ID NO: 7)和 K-122-4(SEQ ID NO: 9)的序列。[0047]作为另一个实例，2个铜绿假单胞菌菌株G7-09 (SEQ ID NO:1)和PA110594(SEQ ID NO:2)形成复合序列 S/T-1-D-W-G/A-C-A/T-S-D/A-S-N-A-V/T-S/--S—G/A-T-D/A-R/Q-N/G-M/F-P/T-A/G-L/M-T/A-A-G-T/S-L/V-P-A/Q-R/E-F-A-P-S/A-E/Q-C-R (SEQ IDN0:21)。
[0048]一旦选择了菌毛蛋白肽序列，其可通过标准的重组合成法或固相合成法而合成。例如，由pRLD-Ε质粒重组表达E-螺旋(E-coil) PAK (128-144) ox，其中，利用合成的寡聚核苷酸符合读框的剪接PAK (128-144) ox DNA序列与E-螺旋并根据已知的技术在大肠杆菌(E.Coli)菌株 BL-21 中表达(参见例如 Giltner 等人，Mol.Microbiology (2006)59 (4):1083和其中引用的参考文献)。通过金属亲和色谱纯化所表达的肽，通过质谱法和N-末端蛋白测序证实纯度和二硫桥的形成。
[0049]在本发明的一个一般性实施方案中，菌毛蛋白肽包含D-氨基酸，并且如上所述，可含有一个或多个L-氨基酸，只要L-氨基酸是少数部分(少于50%残基)并且不会明显损害肽的蛋白酶抗性。在菌毛蛋白肽中包括D-氨基酸的一个目的是增加肽对于由肽可能接触到的一种或多种蛋白酶导致的蛋白水解的抗性。例如，假单胞菌属细菌具有一系列蛋白酶，包括弹性蛋白酶、金属蛋白酶和典型的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，在肽裂解中需要其靶向赖氨酸和/或精氨酸残基。因此，可合成菌毛蛋白肽以含有D-赖氨酸，例如在K122-4菌毛蛋白肽中的K136和K140处。优选地，在制备对尽可能多的蛋白酶具有抗性的肽中，菌毛蛋白肽应该完全由D-氨基酸形成。可通过常规的固相法，在合成中利用活化的D-或L-型氨基酸试剂形成全部由D-氨基酸组成或由D-和L-氨基酸的混合物组成的菌毛蛋白肽。(参见例如 Guichard, G.,等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA.第 91 卷，第 9765-9769页，1994年10月)。
[0050]正如以下将会看到的，与L型菌毛蛋白肽相比，D型菌毛蛋白肽在作为表面涂布剂时具有重要优势。首先，尽管L型T4P菌毛蛋白肽有效抑制假单胞菌所导致的生物膜形成，但是D型菌毛蛋白肽对于假单胞菌所导致的生物膜形成提供更优良的抑制，并对于非假单胞菌(例如利斯特氏菌和葡萄球菌)所致的生物膜形成提供显著更强的抑制。其次，尽管L型T4P菌毛蛋白肽以高亲和力有效结合各种材料，包括多种金属、聚合物、硅酸盐和陶瓷，但是当将材料暴露于蛋白酶时，和在导电材料的情况下当将电流施加到材料时，D型肽通常提供显著更稳定的结合。
[0051]在另一个一般性实施方案中，菌毛蛋白肽包含以逆序列方向、即羧基端至胺端方向合成的D-氨基酸，以产生所谓的逆-倒位(RI)菌毛蛋白肽。逆-倒位(RI)型菌毛蛋白肽还具有更强的蛋白酶抗性的优点，并因此在本文中所述的应用中是有利的，在所述应用中涂布菌毛蛋白的材料暴露于蛋白酶，例如在生物环境中或在经受细菌生长的环境中。合成RI型肽的方法在例如以下文献中有详述:Fletcher, M.D.和Campbell, Μ.Μ., PartiallyModified Retro-1nverso Peptides: Development, Synthesis, and ConformationalBehavior, Chem Rev, 1998，98:763-795，其通过引用结合到本文中。
[0052]正如以下将会看到的，与L型菌毛蛋白肽相比，逆-倒位菌毛蛋白肽作为表面涂布剂也具有重要优势。首先，它们对于假单胞菌所导致的生物膜形成提供更优良的抑制，并对于非假单胞菌(例如利斯特氏菌和葡萄球菌)所致的生物膜形成提供显著更强的抑制，尽管一般而言，与RI肽相比，D型菌毛蛋白肽对生物膜形成产生更强的抑制作用。其次，尽管L型T4P菌毛蛋白肽以高亲和力有效结合不锈钢(通过表征为增加的电子功函(EWF)、更大的硬度和腐蚀抗性的共价-样键)，但是已经发现逆-倒位菌毛蛋白肽产生显著更高的钢EffF (高于L型肽所产生的)，并且还显著增加了材料硬度，亦表明腐蚀抗性更大(相对于用L型肽所观察到的)。
[0053]在再一个实施方案中，将菌毛蛋白肽、和优选D型或逆-倒位型的菌毛蛋白肽，缀合到聚乙二醇聚合物线状或分支链，通常通过共价连接聚乙二醇线状或分支聚合物的末端与肽的N-末端胺和/或C-末端酸基团，使用常规的肽偶联方法，例如用于在肽和PEG部分之间形成酰胺键、酯键、醚键或二硫键，或者含有活化基团的键。用于与蛋白质缀合的PEG或具有合适反应基团的PEG是市售可得到的,例如来自PEGTech, Analytical Ventura和Thermo Scientific (分支PEG)并且活化基团可以是例如马来酰亚胺(通常用于与以下基团反应:肽巯基、乙烯基砜、丙醛、吡啶二砜、NHS酯或碘乙酰胺)；可通过已知的偶联反应，将具有末端胺、酸、羟基或巯基反应基团的PEG偶联到肽的胺、酸、羟基或硫基团。PEG通常在一端具有惰性基团，例如甲氧基，在另一端具有活化基团或反应基团。聚合物试剂的典型平均分子量的选择大小范围介于5kDa至40kDa，相当于在聚合物中有100_1，000个重复单元，尽管更小或更大的PEG也是合适的。按照标准PEG偶联方法，通过活化PEG试剂对蛋白质进行PEG化。
[0054]PEG-D-菌毛蛋白肽或PEG-R1-菌毛蛋白肽的优势在下文将会见到。一般而言，PEG化形式的D型或RI菌毛蛋白肽提供了上文对于非PEG化形式的D-或RI型肽所提及的优势，但额外优势为显著减少摩擦系数和更大地抑制在已涂布表面上的生物膜形成。
[0055]II1.处理金属表面
一方面，本发明包括 处理表面具有暴露的晶粒边界区的不锈钢、锡、铁或钛金属材料的改进方法，以降低材料的腐蚀速率。该方法可单独地或与多种其它抗腐蚀方法中的一种(例如钝化)组合使用。金属材料可具有单个暴露表面(其具有晶粒边界区)或多个待处理的外表面，或含有自材料外表面可及的孔或内部网眼。可以理解，该方法适合对经受化学腐蚀的任意不锈钢、锡、铁或钛金属材料的任何处理，所述化学腐蚀例如在氧化的气氛中或通过与腐蚀性液体(例如碱性或酸性液体)接触。
[0056]在实施该方法中，可首先洗涤金属材料一次或多次，例如在乙醇浴中，以除去污染物。然后，在有效使菌毛蛋白与材料的暴露表面共价结合的条件下使材料与菌毛蛋白溶液接触。在一个典型的处理方法中，将材料放置于肽或缀合物浓度为2 yg/mL至50 μ g/mL菌毛蛋白(例如10 μ g/mL)的菌毛蛋白肽或PEG-菌毛蛋白-肽缀合物在接近中性pH (例如pH 7)的水性缓冲液(例如磷酸缓冲盐水)中的溶液中，并使材料与该溶液接触一段时间(例如5-120分钟)直到合适的菌毛蛋白肽涂层已形成。
[0057]或者，可以用菌毛蛋白溶液喷雾待涂布的材料，且使其与喷雾溶液在高湿度环境中接触需要的接触时间(例如5-120分钟)。
[0058]在再一个实施方案中，将菌毛蛋白涂料施加于金属表面的所选区域，例如在微制造(microfabrication)操作中，或选择性地将肽施加于材料上暴露的晶粒边界区。在该实施方案中，以区域特异性方式(例如通过喷墨打印机或类似手段)将肽溶液递送至材料的
暴露表面。
[0059]11 TA.处理方法和金属表面性质的改变本部分描述了处理金属表面以增强其腐蚀抗性的示例性方法和在支持本发明而进行的研究，所述研究证明，除了增强的腐蚀抗性以外，(i)经处理表面的粘合力降低，(ii)经处理表面的电子功函改变，(iii)经处理表面的硬度增加，(iv)导电率减小，和(V)在至少两个月的时期内涂层稳定。除非另有说明，否则在本部分和在部分IIIB和IIIC中报告的研究是用L型菌毛蛋白肽进行的。在部分IIID中报告的研究和结果是用D型和逆-倒位菌毛蛋白肽以及D-和RI菌毛蛋白肽的PEG-缀合物进行的。
[0060]样品制备将商品级304 2B光泽表面(finish plate) (20规格)不锈钢板(I mm厚)切割成尺寸为I cm X I cm的样品。样品在1140°C、于空气中退火I小时并在空气中冷却。使用120、240、320、400、600和800#粒度的砂纸抛光表面，随后用1200#粒度砂纸进行最终抛光。
[0061]使用上述的抛光方案抛光尺寸为I cm X I cm X I cm的招和不锈钢样品。这些样品在抛光之前都没有进行退火。
[0062]用肽或单体菌毛蛋白涂布样品使用市售洗碟皂将不锈钢和铝样品洗涤I分钟，随后用蒸馏水冲洗。然后伴随温和搅拌将样品浸入95%乙醇中15分钟，用蒸馏水冲洗，再浸入试剂级丙酮中I分钟。用蒸馏水冲洗样品5次，随后使其风干。将样品浸入含有10μ g/mL肽或肽缀合物或单体菌毛蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS)溶液中并伴随温和搅拌于室温(RT)温育I小时。除去溶液，用蒸馏水洗涤样品6次并使样品风干。
[0063]使用上述方案清洁碳钢样品，但在丙酮洗涤步骤之后代替地用100%甲醇冲洗样品并立即将样品浸入100%甲醇中以防止当暴露于水时导致的快速的空气腐蚀。将肽或肽缀合物溶解在100%甲醇中，10 μ g/mL的最终浓度用于浸没碳钢样品。伴随温和搅拌于RT将样品温育I小时。用100%甲醇洗涤样品6次并使其风干。
[0064]粘合力测暈使用原子力显微镜(AFM)测量尖端半径为50-70 nm的标准的涂布Au的AFM氮化硅尖端和涂布肽的表面之间的粘合力。为了确定AFM尖端和涂布的表面之间的粘合力，以“接触”模式使用AFM。使尖端接近表面，使它们接触，测量将尖端拉离表面时悬臂(cantilever)的偏转(deflection)。通过激光束检测偏转的总量,其反映粘合力。如果悬臂的弹簧常数是已知的，可根据光束偏转(beam deflection)而定量测定粘合力。在该研究中，悬臂弹簧常数是0.06 N/m。对每个实验，每个样品获得20至50个粘合力测量结果O
[0065]涂布K122-4或PAO菌毛蛋白肽的不锈钢样品的粘合力研究的结果分别绘制在图2A和2B中。如图2A所示，涂布的金属的粘合力集中在约5-40 nN(纳牛顿)的范围内，平均值约20 nN，相较于未涂布的样品，其粘合力集中在约40-75 nN，平均值约60 nN。用PAO菌毛蛋白涂层获得类似的结果。由于粘合力是电子活性(例如范德华(Van de Walls)相互作用)的反映，可推断出肽涂层起到掩蔽金属表面电子层的作用。
[0066]对涂布肽的铝板的类似的粘合力测量显示，涂布的和未涂布的板之间的粘合力几乎没有区别。
[0067]功函测量用SKP370扫描开尔文探针(Scanning Kelvin Probe)照惯例测量涂布的和未涂布的不锈钢样品的电子功函(EWF)。使用振动电容探针并通过扫频“隔板”电位(swept backing potential)操作该技术，测量扫描探针参考尖端和样品表面之间的功函差。被研究的样品是如同粘合研究中使用的那些，不同之处在于还检验了用PAK菌毛蛋白肽涂布的样品。
[0068]研究结果绘制在图3A中(关于未涂布的和涂布K122-4菌毛蛋白肽的样品)和图3B中(关于未涂布的和涂布PAO-和PAK菌毛蛋白肽的样品)。对于所有三种涂层，菌毛蛋白肽涂层使表面EWF提高了至少约0.5 eV,达到约5eV的最终值。
[0069]对涂布肽的铝板的类似的EWF测量显示，涂布的和未涂布的板之间的EWF几乎没有区别。
[0070]肽涂层的稳定性图4显示对涂布后2个月的时间期限内获取的涂布K122-4菌毛蛋白肽的样品的测量结果。在这2个月的研究时期内观察到涂布的样品相对于未涂布的片具有更高的EFW，表明至少两个月的涂层稳定性。
[0071]纳米压痕/ 硬度使用 triboscope (Hysitron, Minneapolis, USA)检验涂布肽的样品的机械性能的改变。triboscope是纳米机械探针和AFM的组合。该探针是金刚石锥体形维氏硬度计压头，具有150nm的标称半径、100 nN的力灵敏度(force sensitivity)和0.2nm的位移分辨率。在纳米压痕过程中，对于每次压痕获取力-深度曲线，从该曲线获得尖端进入样品表面的总深度位移。使用50至800 μ N的力进行纳米压痕试验。对每个力负荷获取五条力-深度曲线。
[0072]图5中显示涂布肽的(深色)和未涂布的(浅色)不锈钢在50至800 μ N的负荷范围下的力-位移曲线。在800μ N负荷下的总位移显示在图的顶部，对于涂布的片，该值在45-55nm范围内，对于未涂布的片，该值在约90_95nm。基于该试验，涂布的片的硬度几乎是未涂布的片的两倍。更一般地，涂层有效地使不锈钢、锡、铁或钛金属表面的硬度增加至少约20%，优选至少约30%，至多50%或更高。
[0073]图6A和6B绘制涂布的和未涂布的片在20 μ N (6Α)和50 μ N (6Β)下产生的纳米压痕的位移。与来自图5的数据一致，涂布的片的硬度比未涂布的片高约20%-100%。
[0074]相同类型的研究绘制在图7Α和7Β中，图(7Α)针对涂布PAO的且在50-800 μ N的力范围内，图(7Β)针对涂布Κ122-4的且在50-400μΝ的力范围内，结果基本上相同。在这两种情况中，涂布菌毛蛋白肽几乎使金属样品的表面硬度翻倍。
[0075]对涂布肽的铝板的类似的纳米压痕试验显示，涂布的和未涂布的板之间的表面硬度几乎没有改变。
[0076]增加的导电率导电率是材料传导电流的能力的量度。测量表面导电率的一个标准方法使用原子力显微镜(AFM)来测量在规定的低电压电位偏压(potential bias)下从表面上的特定位置流至AFM尖端的电流。AFM将表面和尖端之间的电流(以PA计)定量显示为特定颜色，并且对于未涂布的和涂布菌毛蛋白的不锈钢板，分别用图8A和SB中不同的灰色阴影表示。通常，较深至较浅的阴影表示较大至较小的电流(28.0至24.5pA)。从这两幅图中观察到，图8A中的未涂布的不锈钢样品的表面区在样品表面上变化很大且具有表示较高电流的主导的深色阴影，而图8B中涂布菌毛蛋白的样品的表面区主要是低导电率的且导电率图显著更加均匀。这些结果与来自图3A和3B的EWF数据一致，表明涂布菌毛蛋白的材料具有显著更高的金属功函(提取表面电子所需的功的量度)。
[0077] 腐蚀抗性有多种技术可用于研究材料表面的腐蚀抗性或易腐蚀性。一种方法是测量固定的电位下穿过金属板的电流。测得的电流反映表面电子在氧化还原形式之间往复，更大的电流表明更大的腐蚀潜力。图9A中的图显示对如上制备的304 2B光泽表面(20规格)不锈钢板(未涂布的或涂布K-122-4菌毛蛋白肽的)测得的电流(Icorr)。结果显示涂布的板的Icorr显著更低,表明腐蚀抗性更高。
[0078]可能被问及，以上研究中观察到的Icorr差异是否与电流首先开始流经金属表面时的电位(Ecorr)有关。通过观察金属中的电流首先开始流动时的电位(Ecorr)来研究这个问题。研究结果(显示在图9B中)表明，涂布的和未涂布的金属样品两者具有类似的Ecorr值,表明图9A中看到的Icorr值差异不是由两个样品之间电压电位响应的差异造成的。
[0079]图1OA中绘制了涂布K-122-4的和未涂布样品的腐蚀速率测量结果(以密耳(毫英寸)/年(mpy)测量)。结果与图9A中看到的Icorr的差异一致。具体地，当比较平均速率时，菌毛蛋白肽涂层显示使腐蚀速率降低了超过三倍。
[0080]腐蚀监测中另一个广泛使用的技术是抗极化性，定义为自由腐蚀电位下的电位电流密度曲线的斜率，得到可通过已知的数学关系与腐蚀电流相关的阻抗值Rp。图1OB绘制涂布的和未涂布的不锈钢的Rp值，显示肽涂层显著提高作为腐蚀抗性的量度的Rp。
[0081]令人感兴趣的是，当菌毛蛋白与具有强偶极和/或高电荷密度的另一种肽缀合时，在此例子中，所述另一种肽是亮氨酸拉链型E螺旋或相同的E螺旋(其已结合E螺旋/K螺旋对中的相反电荷的K螺旋)，菌毛蛋白肽在抑制腐蚀中的作用可逆转。如图11所示，未涂布的不锈钢样品的腐蚀速率显著低于具有结合的菌毛蛋白-E或E/Κ螺旋形式的菌毛蛋白的样品。
[0082]对以上讨论的各种不锈钢样品的腐蚀测试的视觉效果参见图12A-12C。在该研究中，样品或者是未涂布的(12B)或者用菌毛蛋白肽(12A)或与E/Κ卷曲螺旋对缀合的菌毛蛋白肽涂布的。在每种情况下，样品在稀盐溶液中经历上述的腐蚀测试。与未涂布的板相t匕，涂布菌毛蛋白的板显示极小的表面腐蚀，而菌毛蛋白-缀合物涂层看起来显著加强腐蚀。
[0083]总之，用合成菌毛蛋白肽涂布金属例如不锈钢、锡、铁或钛，有效地增加金属表面的硬度和腐蚀抗性，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个额外残基。增加的腐蚀抗性通过改变,例如金属表面的电子功函增加至少0.2 EFW单位以及上述Icorr、腐蚀速率和Rp值的改变来证明。提高的硬度通过纳米压痕减小了至少20%来证明，所述纳米压痕通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击金属表面而产生。
[0084]所述方法中考虑的其它金属是元素周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属，包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、钼、金和汞，它们的混合物和合金、准金属硅和锗和它们的氧化物。
_5] 减少的摩擦系数
按照已知方法，例如2007 J.Phys.: Conf Ser 61 51中所报道的，使用原子力显微镜(AFM)测量摩擦系数。简而言之，以给定力(例如500 mN)将AFM的悬臂梁(cantileverbeam)施加到表面，并跨越测试表面而移动。梁的偏转量就提供了梁所经历的摩擦力的度量，较低的摩擦系数产生较低的偏转。梁在表面上的整个移动路线的偏转概况就提供了摩擦系数的度量，小而更均匀的偏转表示低系数，而更高且更不规则的概况则表示更高的梁偏转。
[0086]IIIB.菌毛蛋白肽与经处理金属共价结合的额外证据
涂布的金属的电子功函改变和腐蚀抗性增强表明，菌毛蛋白肽已改变了涂布的表面的电子性质，暗示肽与金属之间共价键的形成，其改变了金属的自由电子轨道。这一发现的麵处支持来自本分部中报道的肽置换分析和X-射线光电子光谱法(XPS)研究。
[0087]肽/菌毛蛋白置换分析化合物和基底之间的共价相互作用的一个指示是在溶质形式的化合物存在下温育复合物时不能从基底上置换化合物。在此，研究外源性菌毛蛋白肽置换与不锈钢表面结合的菌毛蛋白肽的能力。如上所述地清洁I mm厚的商品级304 2B光泽表面(20规格)不锈钢板。这些板不进行退火或抛光。将这些板装配到96孔Schleicher和Schuell Minifold TM System (Mandel Scientific)中。将五十微升含有 10μ g/mL生物素化的PAK肽或生物素化的纯化的菌毛蛋直的溶液加入孔(5个平行测定)中并在RT下伴随温和搅拌将该集合管(manifold)温育I小时。用Ix PBS洗涤孔六次。向平行测定孔中加入增加量(O至10 μ g/mL)的未标记的PAK肽并在RT下伴随温和搅拌将该钢集合管温育I小时。随后用PBS洗涤孔六次。使用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)评估结合的生物素化的肽或菌毛蛋白的置换。将链霉抗生物素蛋白-HRP(Sigma) 1/500稀释，每孔加入100 μ L并在RT下将该集合管温育I小时。每孔加入150微升显影缓冲液(含有I mM 2，2’ -连氮基-双-(3-乙基苄基噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS) (Sigma)和0.03% (v/v)过氧化氢的0.01 M柠檬酸钠缓冲液，pH 4.2)。在RT下伴随温和搅拌将该集合管温育10分钟。将反应溶液转移至96孔平底微量滴定板(Corning)中，使用FLUOstarOPTIMA读板仪(BMG LABTECH)测定在405 nm处的吸光度。
[0088]如图13中绘制的数据所示，即使在较高浓度的可溶性菌毛蛋白肽时，也没有自金属表面的可测量的结合菌毛蛋白肽的损失，证明结合的菌毛蛋白肽与未结合的肽相平衡，表明肽和金属表面之间的共价键连接。肽与金属表面的共价结合的其它证据由以下的腐蚀抗性研究提供。
[0089]XPS特征X-射线光电子光谱法(XPS)是测量元素组成和材料内存在的元素的电子状态的定量光谱学技术。通过用X-射线束照射材料同时测量从被分析材料的顶部I至10nm逃逸的电子的动能和数量来获得XPS光谱。XPS需要超高真空(UHV)条件。
[0090]使用Axis-165光谱仪(Kratos Analytical)检验来自未涂布的和涂布菌毛蛋白的样品的光发射的电子。从这两种样品发射的电子的光谱见图14。如所示的，涂布菌毛蛋白的样品含有结合能约为100和150eV的两个独特的峰，它们在未涂布的样品中不存在。一个可能性是这两个峰代表由于缀合的电子结合而显著红移的硫-金属键。没有N或O与金属结合的证据，表明菌毛蛋白与金属之间可能的共价(共享电子)键相互作用是与菌毛蛋白肽中两个硫原子中的一个或两个。
[0091]IIIC.晶粒边界效应
晶粒边界是多晶材料中两个晶粒或微晶之间的界面。晶粒边界是晶体结构中的缺陷，且易于降低材料的电和热传导率。大多数晶粒边界中的高界面能和较弱的结合经常使它们成为腐蚀开始和从固体沉淀出新的相的优先位点。
[0092]由于晶粒边界可作为腐蚀的起始点，所以，确定菌毛蛋白肽与金属表面结合是否优先发生在晶粒边界位点是令人感兴趣的。为了研究这个问题，将使用涂布菌毛蛋白-肽的AFM尖端的上述粘合力研究进一步精细化为研究晶粒内和晶粒边界处的粘合力作用。该研究中的“试验”和“对照”表面是用PAO菌毛蛋白妝或用具有乱序的(scrambled) PAO氣基酸序列的肽涂布的不锈钢板。对于各样品，测量晶粒内和晶粒边界处的粘合力。
[0093]如下表1中给出的结果所示，在晶粒边界内，菌毛蛋白肽的粘合力比具有乱序的序列的相同材料的粘合力小约20 nN，而在晶粒边界处，粘合力小约43 nN。该结果表明，或者菌毛蛋白肽优先定位于晶粒边界处，即，肽在晶粒边界处具有更大的涂层厚度，或者相同水平的菌毛蛋白结合 在晶粒边界处产生更大的粘合力作用。在任何一种情况下，该数据可解释通过使菌毛蛋白肽与金属表面结合所观察到的抗腐蚀作用的大小。
[0094]表1:晶粒边界区对粘合力的作用
【权利要求】
1.处理管道以减少流过管道的流体的摩擦拽力的方法，所述方法包括: 向所述管道引入携带缀合物的液体，所述缀合物是以下的缀合物:(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量有效通过使所述菌毛蛋白肽附着于管壁而减少流过所述管道的流体的摩擦拽力。
2.权利要求1的方法，其中所述菌毛蛋白肽缀合物是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
3.权利要求1或2的方法，其中所述肽缀合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之间。
4.权利要求1-3的方法，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO: 10的序列。
5.权利要求4的方法，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQIDNO: 3、4或9的序列。
6.权利要求1-5的方法，其中所述菌毛蛋白肽缀合物所附着的管道内表面选自金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面。
7.权利要求1-6的方法，其中施加菌毛蛋白肽的的管道内表面是选自不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁 、银、和镁及其合金的金属表面。
8.权利要求1-7的方法，其中所述管道具有不锈钢内表面并且通过所述引入而附着于管道内表面的菌毛蛋白肽缀合物的量足以减少所述内表面的腐蚀。
9.权利要求1-8的方法，其中通过所述引入而附着于管道内壁的菌毛蛋白肽缀合物的量足以减少引入管道中的含砂浆液的摩擦拽力。
10.权利要求1-9的方法，其中所述引入包括在正常操作期间将所述肽缀合物定期加入到引入管道中的流体中。
11.具有用缀合物涂布的一个或多个暴露的金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面的制品，所述缀合物是以下的缀合物:(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量足以减少所述一个或多个暴露的表面的摩擦系数。
12.权利要求11的制品，其中所述菌毛蛋白肽缀合物是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
13.权利要求11或12的制品，其中所述缀合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal 之间。
14.权利要求11-13的制品，其中所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO:10的序列。
15.权利要求14的制品，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO: 3、4或9的序列。
16.权利要求11-15的制品，其中所述制品的一个或多个暴露的表面是金属表面。
17.权利要求11-16的制品，其中所述制品的一个或多个暴露的表面是不锈钢表面，并且涂布所述表面的所述肽缀合物以足以降低所述表面的腐蚀速率的量存在。
18.权利要求11-17的制品，所述制品是其内壁表面用所述肽缀合物涂布的管道，并且涂布所述表面的所述肽缀合物以足以减少流过所述管道的流体的摩擦拽力的量存在。
19.权利要求11-17的制品，所述制品是宽度尺寸为100微米或更小的微流体通道，其内壁表面用所述肽缀合物涂布并且涂布所述表面的所述肽缀合物以足以减少流体流过所述通道的摩擦拽力的量存在。
20.权利要求11-17的制品，所述制品包括砂颗粒，其外表面用足量的所述肽缀合物涂布，以减少所述涂布的颗粒浆液流过管道的摩擦拽力。
21.权利要求11-17的制品，所述制品是具有活动部件的机器，其涂布肽的表面是彼此移动接触的。
22.权利要求11-17的制品，所述制品是具有用所述肽缀合物涂布的暴露的金属表面的电子器件。
23.权利要求11-17的制品，所述制品是具有不锈钢或钛表面的矫形植入器件，并且涂布所述表面的所述肽缀合物以足以抑制涂布的表面上生物膜形成的量存在。
24.一种制品，所述制品包括: (i)具有暴露的表面的元件，其可在普通使用条件下被非假单胞菌细菌用作生物膜形成的基底，和 (ii)与所述表面结合的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制这类非假单胞菌细菌的生物膜形成。
25.权利要求24的制品，所述制品是旨在植入或驻留体内的医疗器件，其中结合到所述制品表面的所述菌毛蛋白肽是缀合到聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
26.权利要求24-25的制品，其中所述肽缀合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal 之间。
27.权利要求24-26的制品，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO: 10的序列。
28.权利要求24-27的制品，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO: 3、4或9的序列。
29.权利要求24-28的制品，与所述合成的菌毛蛋白肽结合的所述制品的表面选自金属、聚合物、陶瓷或娃酸盐表面。
30.权利要求24-29的制品，其中与所述合成的菌毛蛋白肽结合的所述制品的表面是选自不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金的金属表面。
31.权利要求24-30的制品，其中与所述合成的菌毛蛋白肽结合的所述制品的表面是不锈钢表面，和所述菌毛蛋白肽与所述表面共价结合。
32.权利要求24-30的制品，所述制品用于抑制利斯特氏菌或葡萄球菌的生物膜形成，其中所施加的菌毛蛋白肽的量分别有效地抑制利斯特氏菌或葡萄球菌的生物膜形成。
33.在处理具有暴露的晶粒边界区的表面的金属材料的方法中为了降低所述材料的腐蚀速率的改进，所述改进包括: 使所述材料中的暴露的表面边界区与D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽接触，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制所述材料的腐蚀速率。
34.权利要求33的改进，其中所述菌毛蛋白肽缀合物是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
35.权利要求33-34的改进，其中连接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之间ο
36.权利要求33-35的改进，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO: 10的序列。
37.权利要求33-36的改进，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4 或 9 的序列。
38.权利要求33-37的改进，其中所述接触有效地使暴露的晶粒边界区的电子功函变化至少0.3 eV EFW单位并使暴露的晶粒边界区的硬度增加至少20%，所述硬度通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击金属表面产生的纳米压痕来测定。
39.权利要求33-38的改进，其中所述金属选自不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金。
40.权利要求33-39的改进，其中所述金属材料是不锈钢，和所述接触步骤使涂布表面的腐蚀速率降低至少30%，所述腐蚀速率通过穿过所述表面的腐蚀电流来测定。
41.权利要求33-40的改进，其中所述金属材料是多孔的或网状的，和实施所述接触步骤以使所述菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。
42.权利要求33-40的改进，其中所述金属材料具有暴露的晶粒边界区，和所述接触步骤有效地使所述菌毛蛋白肽与所述晶粒边界区选择性地结合，由此通过优先保护在其晶粒边界区处的表面来增强金属表面的硬度和腐蚀抗性。
43.一种抑制对设计成植入受试者内的医疗器件的炎性反应的方法，所述方法包括: 在植入所述器件之前，用合成的菌毛蛋白肽涂布所述器件的暴露的表面，所述合成的菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环，(?)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两个末端侧的0-10个额外残基，和(iii)包含逆-倒位(RI)型的D-氨基酸，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分。
44.权利要求43的方法，其中所述菌毛蛋白肽是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
45.权利要求43-44的方法,其中连接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之间。
46.权利要求43-45的方法，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO: 10的序列。
47.权利要求43-46的方法，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4 或 9 的序列。
48.一种用于检测分析物的生物传感器器件，所述器件包括: (a)导电金属基底，其具有(i)生物传感器表面(ii)与所述基底表面结合的D型(RI)合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，和(iii)直接或间接地共价连接于所述菌毛蛋白肽的受体，和 (b)用于检测响应分析物相关配体与表面结合的受体的结合的穿过基底表面的电学性质变化的检测器。
49.权利要求48的生物传感器器件，其中所述生物传感器基底由不锈钢形成，并且结合在其上的菌毛蛋白肽是D型菌毛蛋白肽。
50.权利要求48-49的生物传感器器件，其中所述受体通过卷曲螺旋E/Κ螺旋对而共价连接于菌毛蛋白肽，所述螺旋对中的一个共价连接于菌毛蛋白肽，而另一个则连接于受体上。
51.使化合物共价连接于由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底的一个或多个暴露的表面的方法，所述方法包括: 使所述基底的一个或多个暴露的表面与D型合成的菌毛蛋白肽接触，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，由此使所述菌毛蛋白肽共价地结合到一个或多个暴露的表面，和 在所述接触和结合之前或之后，使所述化合物共价连接于所述菌毛蛋白肽。
52.权利要求51的方法，其中所述基底表面具有暴露的晶粒边界区，并且所述接触步骤有效地使所述化合物优先定位在暴露的晶粒边界区处。
53.权利要求51-52的方法，其中所述菌毛蛋白肽是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
54.权利要求51-53的方法,其中连接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之间。
55.权利要求51-54的方法，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO: 10的序列。
56.权利要求51-55的方法，其中所述化合物选自肽、寡糖、脂质、核酸和有机小分子。
57.权利要求51-56的方法，其中所述材料是多孔的或网状的，并且所述接触有效地使所述菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。
58.一种基底，其表面结合有(i) D型合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，和(ii)化合物，所述化合物直接或间接地共价连接于所述菌毛蛋白肽。
59.权利要求58的基底，所述基底由选自不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金的金属形成，并且所述基底用作生物传感器电响应元件，其中所述化合物是通过共价键直接连接于所述菌毛蛋白肽或通过Κ/E螺旋的/螺旋对间接连接于所述菌毛蛋白肽的分析物受体分子，其中所述螺旋中的一个共价连接于所述菌毛蛋白肽，而另一个螺旋共价连接于所述化合物。
60.权利要求58-59的基底，其中所述菌毛蛋白肽是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
61.权利要求58-60的基底,其中连接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500kDal之间.
62.权利要求58-61的基底，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQID NO: 10的序列。
63.权利要求58-62的基底，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4 或 9 的序列。
64.权利要求58-63的基底，所述基底由不锈钢形成，并且所述基底可因所述菌毛蛋白肽结合在其表面而具有改变的电子功函。
【文档编号】C07K14/195GK103930446SQ201280029572
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年4月14日
【发明者】R.T.欧文, E.M.戴维斯, D.李, D.A.马鲁夫 申请人:凯旋门生物物理学公司