具有效应功能的抗cxcr4抗体及其用于治疗癌症的用途
【专利摘要】本发明涉及通过施用能够诱导效应功能的抗CXCR4单克隆抗体治疗癌症的方法。
【专利说明】具有效应功能的抗CXCR4抗体及其用于治疗癌症的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及通过施用能够诱导效应功能的抗CXCR4单克隆抗体治疗癌症的方法。【背景技术】
[0002]趋化因子是小的分泌肽，特别是免疫反应期间其控制着白细胞沿被称为趋化因子梯度的配体化学梯度的迁移(Zlotnick A.等人，2000)。基于其NH2-端半胱氨酸残基的位置、及与G蛋白偶联受体(其两个主要亚家族被命名为CCR和CXCR)的结合，趋化因子被分为两个主要的亚家族，CC和CXC。到目前为止人们已发现了超过50个人趋化因子和18个趋化因子受体。
[0003]许多癌症具有复杂的趋化因子网络，其影响肿瘤的免疫细胞浸润以及肿瘤细胞生长、存活、迁移和血管生成。免疫细胞、内皮细胞和肿瘤细胞自身表达趋化因子受体，并可以响应趋化因子梯度。人类癌症活检样本和小鼠癌症模型的研究表明癌细胞趋化因子受体的表达与转移能力的增加有关。来自不同癌症类型的恶性细胞具有不同的趋化因子受体表达谱，但是趋化因子受体4 (CXCR4)是最常发现的。来自至少23种不同类型的上皮起源、间充质起源和造血起源的人类癌症的细胞表达CXCR4受体(Balkwill F.等人，2004)。
[0004]趋化因子受体4 (也称为融合素、⑶184、LESTR或HUMSTR)作为包含352个或360个氣基酸的两种同种型存在。残基Asnll是糖基化的，残基Tyr21是通过添加硫酸基团修饰的，Cysl09和186通过二硫桥在受体的细胞外部分进行结合(Juarez J.等人,2004)。
[0005]该受体由不同类型的正常组织、天然的(naive)、非记忆T细胞、调节性T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、初级单核细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞、CD34+造血干细胞表达，且在心脏、结肠、肝、肾和脑中以低水平表达。CXCR4在白细胞转运(trafficking)、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。
[0006]CXCR4受体在大量癌症中过表达，所述癌症包括但不限于淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、结肠癌(Ottaiano A.等人，2004)、乳癌(Kato M.等人，2003)、前列腺癌(SunY.X.等人，2003)、肺癌(小细胞癌和非小细胞癌(Phillips R.J.等人，2003))、卵巢癌(Scotton C.J.等人,2002)、胰腺癌(Koshiba T.等人,2000)、肾癌、脑癌(Barbero S 等人，2002),成胶质细胞瘤和淋巴瘤。
[0007]迄今描述的CXCR4受体的唯一配体是间质细胞衍生因子-1 (SDF-1)或CXCL12。SDF-1在淋巴结、骨髓、肝、肺中大量分泌，肾、脑和皮肤分泌程度更少。CXCR4也被拮抗趋化因子识别，该拮抗趋化因子是III型人疱疹病毒编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II(vMIP-1I)。
[0008]CXCR4/SDF-1轴在癌症中起关键作用，直接参与导致转移的迁移、侵入。实际上，癌细胞表达CXCR4受体，它们迁移并进入系统循环。然后，癌细胞被滞留(arrested)在产生高水平SDF-1的器官中的血管床中，在那儿其增殖、诱导血管生成和形成转移性肿瘤(MurphyPM.,2001 )0该轴也通过激活细胞外信号调节的激酶(ERK)途径(Barbero S.等人，2003)和血管生成(Romagnani P.，2004)参与细胞增殖。实际上，CXCR4受体及其配体SDF-1通过刺激VEGF-A表达显然地促进了血管生成，其转而增加了 CXCR4/SDF-1的表达(BachelderR.E.等人，2002)。还已知与肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)聚集在肿瘤的缺氧区域，经刺激后与肿瘤细胞合作，并促进血管生成。据观察缺氧选择性地上调包括TAM的各种细胞类型中CXCR4的表达(Mantovani A.等人，2004)。最近证实CXCR4/SDF-1轴调节CXCR4+造血干细胞/祖细胞(HSC)的转运/归巢，可在新生血管形成中起作用。证据显示除了 HSC之外，功能性CXCR4也在来自其它组织(组织定向干细胞=TCSC)的干细胞上表达，因此SDF-1可在器官/组织再生所需的化学引诱(chemottracting) CXCR4+TCSC中起关键作用，但是这些TCSC也可以是癌症发展的细胞起源(癌症干细胞理论)。对于人类白血病，和最近对于几种实体肿瘤，比如脑和乳房，证实了癌症的干细胞起源。存在几个可以衍生自正常CXCR4+组织/器官特异性干细胞的CXCR4+的肿瘤实例，比如白血病、脑肿瘤、小细胞肺癌、乳癌、肝胚细胞瘤、卵巢癌和宫颈癌(Kucia M.等人，2005)。
[0009]使用针对CXCR4受体的单克隆抗体在体内证实了通过干扰CXCR4受体可以靶向癌症转移(Muller A.等人，2001)。简而言之，已表明针对CXCR4受体(单抗173R&D系统)的单克隆抗体显著地减少了 SCID小鼠中常位(orthotopic)乳癌模型(MDA-MB231)中淋巴结转移的数量。另一个研究(Phillips R.J等人，2003)使用抗SDF-1的多克隆抗体也显示SDF-1/CXCR4轴在常位肺癌模型(A549)的转移中起决定性作用，但是在该研究中，其对于肿瘤生长和血管生成都没有作用。几个其它研究也描述了使用CXCR4的SiRNA双链体(Liang Z.等人，2005)生物稳定的CXCR4肽拮抗剂(Tamamura H.等人，2003)对体内转移的抑制，或使用CXCR4的小分子拮抗剂如AMD3100(Rubin J.B.等人，2003 ；De Falco V.等人，2007)或单抗(专利W02004/059285A2)对体内肿瘤生长的抑制。因此，CXCR4是经验证的用于癌症的治疗靶。
[0010]也已经描述了能够指导与CXCR4的相互作用、从而抑制CXCR4激活的鼠单克隆抗体。通过如下干预发生这种抑制:i)在配体SDF-1的细胞膜上特异性结合受体CXCR4，ii)GTPyS的细胞膜上特异性结合受体CXCR4，iii)CXCR4介导的cAMP产生的调节，和iv)CXCR4受体介导的细胞内钙库调节的动员(参见，W02010/037831)。
[0011]但是，这些抗体或SiRNA都不能导致表达CXCR4的癌细胞的杀死。因而，仍存在癌症复发的风险，应当停止CXCR4的靶向治疗。因而，需要直接靶向表达CXCR4的细胞的制剂，其能够杀死所述表达CXCR4的细胞。
[0012]本发明涉及关于靶向CXCR4抗体的从未被鉴定的新型特性。
【发明内容】
[0013]事实上，本发明人已发现针对CXCR4的人或人源化抗体能够诱导针对表达CXCR4的细胞的效应功能，因此引发针对所述细胞的细胞毒性作用。
[0014]更具体地，本发明涉及诱导针对表达CXCR4的癌细胞的效应功能的方法。
[0015]如现有技术所述，转移性表达CXCR4的肿瘤的治疗涉及抑制迁移、侵入、增殖或血管生成，而非直接杀死表达CXCR4的细胞。与之截然相反的是，本发明涉及诱导引发表达CXCR4的靶细胞死亡的细胞毒性作用。具体而言，本发明提供人或人源化单克隆抗体，其能诱导针对表达CXCR4的癌细胞的一种或多种效应功能，从而实现杀死所述细胞。因此，本发明凭借人或人源化单克隆抗体通过诱导针对表达CXCR4的癌细胞的一种或多种效应功能，提供治疗癌症的方法。
[0016]在第一方面，本发明涉及使用结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段杀死表达CXCR4的癌细胞的方法；所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID N0.1、2和3的CDR区CDR-HU CDR-H2和CDR-H3 ；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R区⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;其中所述方法包括在效应细胞或补体成分存在时诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能的步骤。 [0017]在另一方面，本发明涉及结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段；其中所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQID N0.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3 ;以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R区⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能，制备用于杀死表达CXCR4的癌细胞的组合物中的用途。
[0018]在又一方面，本发明也涉及结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段；所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ IDN0.1、2和3的CDR区CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3 ；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R区⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能，用以杀死表达CXCR4的癌细胞。
[0019]更具体而言，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法通过使用结合CXCR4的人或人源化抗体、或其包含CH2的结合片段杀死表达CXCR4的癌细胞；所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID N0.1、2和3的⑶RgOTR-Hl、CDR-H2和CDR-H3 ；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ IDN0.4、5和6的⑶R区⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;其中所述方法包括在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能的步骤。
[0020]在另一方面，本发明涉及结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段；其中所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQID N0.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3 ;以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R区⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能，以制备通过杀死表达CXCR4的癌细胞治疗癌症的组合物中的用途。
[0021]在又一方面，本发明还涉及结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段；所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ IDN0.1、2和3的CDR区CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3 ；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R区⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能，通过杀死表达CXCR4的癌细胞用于治疗癌症。
[0022]本文所用术语“抗体”在最广泛意义上和特别地包括下述任何同种型(isotype)的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体):如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，多克隆抗体，多特异性抗体(multispecific antibodies),嵌合抗体和抗体片段。通过例如在曬菌体或类似载体中筛选重组抗体文库、或者使用抗原或编码抗原的核酸以免疫动物等重组方法，可生成与特异性抗原反应的抗体。
[0023]“多克隆抗体”是指存在一种或更多其它不同抗体或其间所产生的抗体。一般来说，存在若干产生不同抗体的其它B淋巴细胞时，由B淋巴细胞产生多克隆抗体。多克隆抗体通常通过经免疫的动物直接获得。
[0024]本文所用的“单克隆抗体”，是获自一群实质上均质性抗体(homogeneousantibodies)的抗体，即除去可以以小量存在的可能天然发生的突变之外，形成这个群体的抗体基本上相同。换言之，单克隆抗体由源于单一细胞克隆(例如杂交瘤、使用编码均质性抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、用编码均质性抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等)生长的均质性抗体组成。这些抗体针对单一表位，因此是高度特异的。
[0025]“表位”是抗原上结合抗体的位点。它可以通过连续的残基形成，或者通过折叠抗原蛋白使不连续的残基极为靠近而形成。在暴露于变性溶剂时，由连续的氨基酸形成的表位通常得以保留，然而在所述暴露中，由不连续的氨基酸形成的表位通常丢失。[0026]优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。
[0027]典型的抗体包含通过二硫键结合的两条相同重链和两条相同轻链。每个重和轻链都包含恒定区和可变区。每个可变区包含三个被称为“互补决定区”(“⑶R”)或“超变区”的段，其主要负责与抗原的表位相结合。其通常按照从N端的顺序编号被称作 CDR1、CDR2 和 CDR3(见 Lefranc M.-P., Immunology Todayl8, 509 (1997)/LefrancΜ.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) /Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.1mmunol.，27，55-77 (2003))。可变区中较为高度保守的部分被称作“框架区”。
[0028]如本文所用，“VH”或“VH”指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段的重链。关于“VL”或“VL”指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab，)2片段的轻链。
[0029]抗体恒定结构域不直接参与抗体与抗原结合，但显示各种效应功能。与免疫球蛋白不同分类相对应的重链恒定区分别命名为α、δ、ε、Y和μ。抗体或免疫球蛋白根据其重链的恒定区的氨基酸序列可被分成不同类，即，IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM,这些中的几个可被进一步分成亚类(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ;IgAl和IgA2(见W.E.Paul,编，1993，Fundamental Immunology, Raven Press,纽约，纽约)。
[0030]木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段称为Fab片段，每个具有单一的抗原结合位点和残留的“Fe”片段。虽然免疫球蛋白重链的Fe结构域的边界可变，但人IgG重链Fe结构域通常限定为:从根据EU索引(index)在铰链区Cys226或Pro230位置的氨基酸残基处延伸至其包含重链CH2和CH3结构域的羧基端(Edelman等人，The covalentstructure of an entire gammaG immunoglobulin molecule, PNAS1969;63:78-85)。为清楚起见，此处应该指明:根据EU索引的Cys226/Pro230残基与在Kabat编号系统(Kabatnumbering system)的 Cys239/Pro243 残基、以及根据 IMGT 的铰链残基 Cysll/Prol5 相对应。
[0031]术语“铰链区”一般定义为从人IgGl的Glu216至Pro230的延伸(Burton, MolImmunol, 22:161-206, 1985)。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置，可将其它IgG同种型的铰链区与IgGl序列相比对。人IgGFc部分的“CH2结构域”(也被称作“C Y 2”结构域)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。所述CH2结构域独特之处在于其与另一结构域并不紧密配对。而是两个N-连接的分支糖链被插入至完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，糖可提供结构域-结构域配对的替代，帮助稳定 CH2 结构域(Burton, MoI Immunol, 22:161-206，1985)。“CH3 结构域”包括在 Fe部分C端残基至CH2结构域的延伸(即，从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
[0032]包含单克隆抗体的IgG免疫球蛋白已经被证明在每个重链的恒定区为N糖基化的。其在其两条重链的每一条的CH2结构域上的Asn297上都含有单一的N连接的聚糖。如本文所用术语“N聚糖”指例如通过天冬酰胺-N-乙酰氨基葡萄糖连接附着至多肽的天冬酰胺残基的N连接的寡糖。N聚糖有共同的Man3GlcNAc2的戊多糖核心(“Man”指甘露糖；“Glc”指葡萄糖；和“嫩(3”指N乙酰基；GlcNAc指的是N乙酰氨基葡萄糖)。
[0033]N聚糖的区别在于附着至Man3核心结构的含有外周糖(peripheral sugars)(例如,GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(天线)的数目和性质(nature)。N聚糖根据其分支成分(例如高甘露糖、复合的或杂合的)进行分类。“复合，双天线”型N聚糖通常具有附着至1，3甘露糖分支的至少一个GlcNAc和附着至三甘露糖(trimannose)核心的1，6甘露糖分支的至少一个GlcNAc。复合双天线N聚糖也可具有包含“二分(bisecting)”GlcNAc和核心岩藻糖(〃Fuc〃)的链内置换。“二分GlcNAc”为附着至成熟核心糖结构的β-1，4-甘露糖的GlcNAc残基。
[0034]复合双天线N聚糖也可具有以唾液酸可选地修饰的半乳糖("Gal")残基。唾液酸添加至寡糖链由唾液酸转移酶催化，但需要由半乳糖基转移酶之前将一个或多个半乳糖残基附着至末端N乙酰氨基葡萄糖。根据本发明的“唾液酸”包括5-N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)和5-轻乙酰神经氨酸(NeuNGc)。
[0035]寡糖可含有O个(GO)、一个(Gl)或两个(G2)半乳糖残基，以及附着至或没有附着至第一个GlcNac的一个岩藻糖。这些形式(forms)分别记为G0/G0F、G2/G2F、G1/G1F(见 Theillaud 的图1, Expert Opin Biol Ther.,增刊 1: S15-S27, 2005)。换言之，当寡糖链的两臂都含有半乳糖残基时，每摩尔重链的最大摩尔半乳糖是2，当核心被岩藻糖基化(fucosylated)时所述结构被称作G2F,当核心不是岩藻糖基化时所述结构被称作G2。当一条臂具有末端半乳糖时，所述结构根据其是否被岩藻糖基化而被称作GlF或Gl，当没有末端半乳糖时，所述结构分别被称作GOF或G0。
[0036]因此，分泌的IgG免疫球蛋白为显示出糖残基岩藻糖、半乳糖、唾液酸和二分N-乙酰氨基葡萄糖的可变添加的糖型(g I y Co forms )的异质性混合物。
[0037]Fe结构域在决定免疫球蛋白的生物学功能当中是重要的，这些生物学功能称为“效应功能”。这些Fe结构域-介导的活性是通过免疫效应细胞介导的，如杀伤细胞、自然杀伤细胞和激活的巨噬细胞、或各种补体成分。这些效应功能涉及通过抗体的Fe结构域结合至所述受体或补体成分以激活所述效应细胞表面上的受体。 [0038]表述“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞细胞毒性”或“ADCC”指细胞毒性的形式，其中Ig结合至存在于某些细胞毒性效应细胞上的Fe受体(FcR)，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至带有抗原的靶细胞，并随后用细胞毒素杀死靶细胞。祀细胞的裂解是细胞外的，需要直接的细胞-细胞接触，并且不涉及补体。[0039]细胞破坏(destruction)可通过例如裂解或吞噬作用发生。“细胞毒性效应细胞”为表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达Fe YRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可从其天然来源如从血液或PBMC中得以分离。能够通过裂解方式破坏细胞的细胞毒性效应细胞包括，例如自然杀伤(NK)细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
[0040]在各种人免疫球蛋白分类中，人IgGl和IgG3比IgG2和IgG4更有效地介导ADCC。
[0041]有利地是，本发明的人或人源化抗体或其包含CH2的片段，能够通过诱导抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)杀死表达CXCR4的癌细胞。
[0042]因此，在本发明方法的第一优选的实施方案中，所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。
[0043]换言之，根据本发明的用途特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。
[0044]又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。
[0045]作为非限定性实例，可以提到下列用于评估或体外定量ADCC的方法:使用碘化丙唳(propidium iodide, PI)或|丐黄绿素(calcein)的血细胞计数,51Cr或突光染料例如钙黄绿素-AM、羧基突光素玻拍酸亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)、2’，7’- 二-(2羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素(BCECF)或铕(Europium)，或通过测量如乳酸脱氢酶(LDH)的胞质酶或ATP的释放。这些方法为本领域技术人员所熟知(见，例如Jiang 等人，“Advances in the assessment and control of the effector functionsof therapeutic antibodies”, Nat Rev Drug Discov.，10:101-110，2011，和其参考文献),不需在此进一步详述。
[0046]通过“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”，它在本文指这样一种机制，其凭借特异性抗体结合至细胞表面的抗原，经一系列包含血液中补体相关蛋白组的级联(补体激活途经)触发补体激活，导致靶细胞裂解。此外，通过激活补体生成的蛋白片段可诱导免疫细胞的迁移和激活。补体依赖的细胞毒性(⑶C)激活的第一步在于Clq蛋白结合至抗体的至少两个Fe结构域。“Clq”是包含免疫球蛋白Fe区的结合位点的多肽。Clq与两个丝氨酸蛋白酶Clr和Cls —起形成复合物Cl，其为补体依赖的细胞毒性(⑶C)途经的第一个成分。
[0047]在本发明的另一有利的实施方案中，人或人源化抗体或其包含CH2的片段，通过诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)能够杀死表达CXCR4的癌细胞。
[0048]因此，本发明也涉及上述方法，其中效应功能由补体依赖的细胞毒性(⑶C)组成。
[0049]换言之，根据本发明的用途特征在于所述效应功能由补体依赖的细胞毒性(CDC)组成。
[0050]又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述效应功能由补体依赖的细胞毒性(⑶C)组成。
[0051]有核细胞的细胞毒性根据CDC可通过几种方法在体外定量，例如:台盼蓝排除法、使用碘化丙啶(PI)的流式细胞术、51Cr释放、四唑盐MTT的还原、氧化还原染料Alamar蓝(redox dye Alamar blue)、细胞内 ATP 的流失、CellTiter-Glo、LDH 释放或钙黄绿素-AM释放。这些方法为本领域技术人员所熟知(见，例如Jiang等人，“Advances in theassessment and control of the effector functions of therapeutic antibodies，，, NatRev Drug Discov.，10:101-110，2011，和其参考文献)，不需在此进一步详述。
[0052]在本发明的进一步有利的实施方案中，抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)两者都被诱导，即人或人源化抗体或其包含CH2的片段通过诱导抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)两者能够杀死表达CXCR4的癌细胞。
[0053]在优选的实施方案中，本发明方法的效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(⑶C)组成。
[0054]换言之，根据本发明的用途特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(⑶C)组成。
[0055]又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。
[0056]抗体的这两个效应功能直接关联抗体Fe部分与免疫细胞表面上特异性受体的结合，对于ADCC基本上为NK细胞、巨噬细胞、单核细胞上表达的Fe Y RIIIa(也称为Fe Y RIIIA)和Fe Y RIIa(也称为Fe Y RIIA)，以及对于CDC为补体级联蛋白Clq。
[0057]抗体的Fe部分 和Fe Y R以及Clq之间的精确相互作用已经被精确作图，涉及这种相互作用的主要Fe结构域与CH2结构域相对应。Fe部分和Fe受体之间的亲和性直接关联至所触发的免疫反应的程度。
[0058]如上所述，针对CXCR4的人或人源化抗体能够诱导针对表达CXCR4的细胞的效应功能，因此导致针对所述细胞的细胞毒性作用。很显然，效应功能的诱导越高，针对表达CXCR4的细胞的细胞毒性作用就越强。虽然某些抗体可表现天然升高的ADCC和/或CDC活性，在其它情况下可能有必要去工程化针对CXCR4的人或人源化抗体以提高抗体免疫反应以及更具体地为ADCC和/或CDC。这样经工程化的抗体也包括在本发明的范围内。
[0059]有几种方式去工程化和去提高抗体免疫反应以及更具体地为ADCC和/或⑶C，其中的大多数对ADCC而言基于直接增加Fe部分与同源Fe YR的结合。主要目标为增加与人Fe Y Ra和人Fe Y RIIa的结合，并降低与人Fe Y RIIb (降低免疫反应的抑制受体)的结合。可通过在Fe部分内突变个别氨基酸残基或者通过修饰连接至CH2结构域天冬酰胺297的聚糖部分(moiety)以增加岩聚糖基化聚糖部分实现这个目标。可以例如通过关闭(si RNA, K0,等；Toyohide Shinkawa 等人，The absence of fucosebut not the presence of galactose or bisecting N-acetyIglucosamine of humanIgGIcompIex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancingantibody-dependent cellular cytotoxicity.J.Biol.Chem2003;278:3466 - 3473)产生抗体的宿主细胞上的FUT8基因，或者产生抗体的细胞上过表达GlcNAc III转移酶(见例如 Pablo Umana 等人，Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgGlwithoptimized antibody-dependent cellular cytotoxicity activity.Nat Biotechnol1999; 17:176-180)实现糖工程化(Glycoengineering)。
[0060]通过在抗体的恒定结构域产生单一或多个置换可获得这样的抗体，并因此增加其与Fe受体的相互作用。设计这样突变的方法可见于例如Lazar等人(2006, PNAS, 103(11):4005-4010)和 Okazaki 等人(2004，J.Mo1.Biol.336(5): 1239-49)。
[0061]还可能使用经专门工程化的细胞系用于产生改良的抗体。特别地，这些系已经改变糖基化途经的调节，从而导致抗体岩藻糖基化不足或者甚至完全去岩藻糖基化。这样的细胞系和用于其工程化的方法公开于例如Shinkawa等人(2003，J.Biol.Chem.278 (5): 3466-3473)、Ferrara 等人(Biotechnol.Bioeng.93 (5): 851-61)。
[0062]增加ADCC的其它方法也已描述在Li等人(2006，Nat Biotechnol.24⑵:210-5)、Stavenhagen 等人(2008, Advan.Enzyme Regul.48:152-164)、Shields 等人(2001, J.Biol.Chem.，276(9):6591-6604);和 W02008/006554。 [0063]增加CDC 的方法已经描述于 Idusogie 等人(2001, J Immunol.166 (4): 2571-5)、Dali，Acqua 等人(2006, J Immunol, 177 (2): 1129-38)、Michaelsen 等人(1990, ScandJ Immunol, 32(5):517-28)、fcekke 等人(1993，Mol Immunol, 30 (16): 1419-25)、Tan等人(1990, Proc;Natl.Acad.Sc1.USA, 87:162-166)和 Norderhaug 等人(1991, Eur JImmunol, 21(10):2379-84)。
[0064]一个详细描述的技术是Kyowa开发的补体技术(Complement technology),其在于产生具有增强的CDC的嵌合人IgGl/IgG3Fc部分(见例如W02007/011041)。
[0065]描述用于增加ADCC和CDC的方法的参考文献包括Natsume等人(2008，CancerRes.68(10):3863-3872)。这些参考文献的每个的公开通过交叉引用包括在本文中。
[0066]这对本领域技术人员是显而易见的，因为增强的ADCC和/或⑶C将引发杀死表达CXCR4的癌性细胞，所以其在癌症治疗领域特别受关注，因此其将明确限制癌症复发的风险，CXCR4靶向的治疗应该被停止。
[0067]通过表述“包含CH2的结合片段”，其应该理解为包含母体抗体的6个⑶R的抗体的任何片段或部分以及至少CH2结构域，其已知负责诱导效应功能。在最优选的实施方案中，CH2必须是二聚的，也就是说其包含CH2的两个拷贝。
[0068]在另一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个⑶R和至少CH2以及铰链结构域。
[0069]在又一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个⑶R和至少CHl、铰链和CH2结构域。
[0070]在另一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个⑶R和至少CHl和CH2结构域。
[0071]在又一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个⑶R和至少CH1、CH2和CH3结构域。
[0072]在还一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个⑶R和至少CH1、铰链、CH2和CH3结构域，即全长Fe。
[0073]更优选地，本发明包含通过遗传重组或化学合成获得的人源化抗体，其包含CH2的结合片段。
[0074]根据优选的实施方案，根据本发明的人或人源化抗体特征在于其由单克隆抗体组成。
[0075]换言之，本发明的方法包括人或人源化抗体，或包含CH2的结合片段的用途，其根据MGT包含含有下列三个⑶R的重链，分别为⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中:[0076]-⑶R-Hl包含序列SEQID N0.1，或与序列SEQ ID N0.1经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
[0077]-⑶R-H2包含序列SEQID N0.2，或与序列SEQ ID N0.2经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
[0078]-⑶R-H3包含序列SEQID N0.3，或与序列SEQ ID N0.3经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0079]甚至更优选，本发明的方法包括人或人源化抗体，或包含CH2的结合片段的用途，其根据頂GT包含含有下列三个⑶R的轻链，分别为⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中:
[0080]-CDR-Ll包含序列SEQ ID N0.4，或与序列SEQ ID N0.4经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
[0081]-CDR-L2包含序列SEQ ID N0.5，或与序列SEQ ID N0.5经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
[0082]-CDR-L3包含序列SEQ ID N0.6，或与序列SEQ ID N0.6经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0083]在本发明的描述中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”可互换。
[0084]无论抗原受体、链类型或物种如何，MGT唯一的编号已限定为比较可变结构域(Lefranc Μ.-P., Immunology Today18，509 (1997)/Lefranc M.-P., TheImmunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc,M.-P.,Pommie,C., Ruiz,M., GiudicelIi, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.1mmunol.，27，55-77(2003))。在MGT唯一编号中，保守性氨基酸总是具有相同位置，例如半胱氨酸23 (第一个CYS)、色氨酸41 (保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104 (第二个CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118 (J-PHE或J-TRP)。所述MGT唯一编号提供了框架区(FRl-1MGT:位置 I 至 26，FR2-MGT:39 至 55，FR3-MGT:66 至 104 和 FR4-1MGT:118 至 128)和互补决定区(CDR1-頂GT:27 至 38，CDR2-1MGT:56 至 65 和 CDR3-1MGT:105 至 117)的标准化定界。由于空位(gap)代表未占用的位置，CDR-1MGT长度(在括号之间显示，并用点分开，例如[8.8.13])成为决定性的信息。在2D图解的图表中使用IMGT唯一编号，命名为IMGT Colliers de Perles(Ruiz, Μ.和Lefranc, Μ.-P.，Immunogenetics, 53，857-883(2002)/Kaas, Q.和 Lefranc, Μ.-P.，Current Bioinformatics, 2，21-30 (2007))，以及在 IMGT/3D结构 DB 中的 3D 结构中使用 MGT 唯一编号(Kaas, Q.，Ruiz, M.和 Lefranc, M.-P.，T cellreceptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.，32，D208-D210(2004))。
[0085]在本发明的意义上，两条核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”指两条进行比较的序列之间在最佳比对后获得的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯粹统计学上的，并且两条序列之间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列之间的比较传统上在已对其进行最佳比对后通过比较序列而进行，所述比较能够分段进行或使用“比对窗口”进行。用于比较的序列的最佳比对，除手工比较之外，可以通过Smith和Waterman 的局部同源性算法(1981) (Ad.App.Math.2:482)、通过 Neddleman 和 Wunsch 的局部同源性算法(1970) (J.Mol.Biol.48:443)、通过Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988) (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444)或通过使用这些算法的计算机软件(威斯康星遗传学软件包，遗传学计算机组，575Science Dr.，Madison, WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)进行。
[0086]通过比较两条最佳比对的序列确定两条核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，其中与用于两条序列之间最佳比对的参考序列相比，待比较的核酸或氨基酸序列可具有添加或缺失。通过如下方法计算百分比同一性:确定两条序列优选两条全序列之间相同氨基酸核苷酸或残基的位置数目，将相同位置的数目除以在比对窗口中的位置总数，并将结果乘以100以获得两条序列之间的百分比同一性。
[0087]例如，从网址http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 上可获得的 BLAST程序“BLAST2 序列”(Tatusova 等人，“Blast2sequences_a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol, 1999, Lett.174:247_250)，可以与缺省参数一起使用(特别是参数“开放空位罚分”:5，和“延伸空位罚分”:2;所选的矩阵是例如程序建议的“BL0SUM62”矩阵)；直接通过所述程序计算两条待比较序列之间的百分比同一I"生。
[0088]对于显示出与参考氨基酸序列具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列而言，优选的实例包括包含参考序列，某些修饰，特别是至少一个氨基酸的缺失、添加或置换，截短或延伸的那些。在置换一个或多个连续或不连续氨基酸的情况下，优选其中被置换的氨基酸被“等同的”氨基酸所取代的置换。在此，表述“等同的氨基酸”指可能被结构性氨基酸之一所置换的，然而并未改变相应抗体的生物活性的任何氨基酸和下述限定的那些具体实例。
[0089]等同氨基酸可根据其与被置换氨基酸的结构同源性或根据可能产生的各种抗体之间生物活性的比较性测试结果而确定。
[0090]作为非限制性实例，下表1概述可进行的却没有引起相应经修饰的抗体的生物活性发生显著改变的可能置换；在相同条件下，反向置换自然是可能的。
[0091]表1
[0092]
【权利要求】
1.一种结合CXCR4的人源化抗体、或其含有CH2的结合片段，所述人源化抗体包含选自序列SEQ ID N0.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ ID N0.11至17的轻链可变结构域；在效应细胞或补体成分存在时，通过诱导至少一种效应功能杀死表达CXCR4的癌细胞，用于治疗癌症的方法中。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。
3.根据权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于所述效应功能由补体依赖的细胞毒性(CDC)组成。
4.根据权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(⑶C)组成。
5.根据权利要求1至4任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体选自: 包含序列SEQ ID N0.8的重链可变结构域和选自序列SEQ ID N0.11至17的轻链可变结构域的人源化抗体； 包含选自序列SEQ ID N0.7至10的重链可变结构域和序列SEQ ID N0.13的轻链可变结构域的人源化抗体； 包含序列SEQ ID N0.8的重链可变结构域和序列SEQ ID N0.13的轻链可变结构域的人源化抗体； 包含选自序列SEQ ID N0.18至21的重链和/或选自序列SEQ ID N0.22至28的轻链的人源化抗体； 包含序列SEQ ID N0.19的重链和/或选自序列SEQ ID N0.22至28的轻链的人源化抗体；` 包含选自序列SEQ ID N0.18至21的重链和/或序列SEQ ID N0.24的轻链的人源化抗体；和 包含序列SEQ ID N0.19的重链和/或序列SEQ ID N0.24的轻链的人源化抗体。
6.根据权利要求1至7任一项所述的人源化抗体，其特征在于所述抗体是IgGl。
7.根据权利要求1至6任一项所述的人源化抗体，其特征在于所述表达CXCR4的癌细胞由恶性血液细胞组成。
8.根据权利要求7所述的人源化抗体，其特征在于所述CXCR4恶性血液细胞选自淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。
9.根据权利要求1至8任一项所述的人源化抗体，其特征在于所述效应细胞包含NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
10.根据权利要求1至9任一项所述的人源化抗体，其特征在于在4小时的孵育期后，所述人源化抗体诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少40%的ADCC水平。
11.根据权利要求1至10任一项所述的人源化抗体，其特征在于在NK细胞上没有诱导显著的ADCC。
12.根据权利要求1至11任一项所述的人源化抗体，其特征在于所述补体成分至少包含 Clq。
13.根据权利要求1至12任一项所述的人源化抗体，其特征在于在I小时的孵育期后，所述人源化抗体诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少30%、优选至少50%、以及最优选至少70%的CDC水平。
14.根据权利要求1至13任一项所述的人源化抗体，其特征在于在I小时的孵育期后，所述人源化抗体诱导NIH3T3CXCR4细胞上至少30%、优选至少50%、以及最优选至少70%的CDC水平。
15.根据权利要求1至14任一项所述的人源化抗体，其特征在于人源化抗体、或其含有CH2的结合片段结合至少一个人Fe Y R0
16.根据权利要求15所述的人源化抗体，其特征在于所述至少一个FcyR是人Fe Y RI。
17.根据权利要求16所述的人源化抗体，其特征在于所述人源化抗体根据Langmu’it?模式以I至IOnM之间的解离常数(KD)结合所述Fe YRI。
18.根据权利要求17所述的人源化抗体，其特征在于所述至少一个FcyR是人Fe Y RIIIAo
19.根据权利要求18所述的人源化抗体，其特征在于所述人源化抗体根据异质性配体模式以200至1000nM之间的解离常数(KD)结合所述Fe yRIIIA。
20.—种结合CXCR4的人源化抗体、或其含有CH2的结合片段，通过杀死表达CXCR4的癌细胞用于治疗癌症的方法中；所述人或人源化抗体包含选自序列SEQ ID N0.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ ID N0.11至17的轻链可变结构域；其中在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。
21.根据权利要求20所述的人源化抗体，其特征在于所述癌症由淋巴瘤组成。
22.一种用于筛选结合CXCR4的人源化抗体、或其含有CH2的结合片段的方法，所述人源化抗体或其含有CH2的结合片段在效应细胞或补体成分存在时，通过诱导至少一种效应功能用于杀死表达CXCR4的癌细胞，其中所述方法包括至少一个选自以下的选择步骤: -在4小时的孵育期后，选择诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少40%ADCC水平的抗体； -在I小时的孵育期后，选择诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少30%、优选至少50%以及最优选至少70%CDC水平 的抗体； -在I小时的孵育期后，选择诱导NIH3T3CXCR4细胞上至少30%、优选至少50%以及最优选至少70%CDC水平的抗体； -选择根据Langmi*模式以I至IOnM之间的解离常数(KD)结合Fe y RI的抗体； -选择根据异质性配体模式以200至1000nM之间的解离常数(KD)结合Fe Y RIIIA的抗体。
【文档编号】C07K16/28GK103649120SQ201280030414
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年6月20日 优先权日:2011年6月20日
【发明者】C·克林格-阿穆 申请人:皮埃尔法布雷医药公司