丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列和包含以下至少一个的第二多肽的分子，具体地说是多肽，更具体地说是融合蛋白：Fc多肽或来源于Fc多肽的氨基酸序列、细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子靶向多肽的序列、含有WAP结构域的多肽或来源于含有WAP的多肽的序列和白蛋白多肽或来源于血清白蛋白多肽的氨基酸序列。本发明还涉及在各种治疗和诊断适应症中使用所述分子的方法，以及生产所述分子的方法。
【专利说明】丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法
[0001]相关申请
本申请要求2011年6月28日提交的美国临时申请号61/502055、2011年12月14日提交的美国临时申请号61/570394、2011年12月19日提交的美国临时申请号61/577204和2012年4月25日提交的美国临时申请号61/638168的权益。这些申请每一个的内容均通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
[0002]本发明涉及包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列和第二多肽的分子，具体地说是多肽，更具体地说是融合蛋白。另外，本发明涉及包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列、第二多肽和第三多肽的融合蛋白。准确地讲，本发明涉及包括至少一个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和第二多肽的融合蛋白或包括至少一个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、第二多肽和第三多肽的融合蛋白，其中本发明融合蛋白的第二多肽和第三多肽可以是以下的至少一个:Fc多肽或来源于Fe多肽的氨基酸序列；细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子靶向多肽的序列；含有WAP结构域的多肽或来源于含有WAP的多肽的序列；或白蛋白多肽或来源于血清白蛋白多肽的氨基酸序列。本发明还涉及在各种治疗和诊断适应症中使用所述分子的方法以及生产所述分子的方法。
[0003]发明背景
丝氨酸蛋白酶活性异常或蛋白酶对蛋白酶抑制剂失衡可导致蛋白酶介导的组织破坏和炎性反应。因此，存在对靶向丝氨酸蛋白酶活性异常和/或蛋白酶对蛋白酶抑制剂失衡的治疗剂和疗法的需要。此外，可通过减少异常细胞因子信号转导和丝氨酸蛋白酶活性获得增强的治疗效果。另外，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白质显示抗感染活性，而靶向炎性细胞因子显示增加感染风险。本发明的融合蛋白具有减少炎性细胞因子活性和限制感染风险的潜力。
[0004]发明概述
本文所述融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列(多肽I)和第二多肽(多肽2)。另外，本文所述融合蛋白包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列(多肽I)、第二多肽(多肽2)和第三多肽(多肽3)。本文可互换使用的术语“融合蛋白”和“融合多肽”是指与至少第二多肽或来源于至少第二多肽的氨基酸序列有效连接的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列。融合蛋白的个别元素可以多种方式的任一种连接，包括例如直接连接、使用中间体或间隔肽、使用接头区、使用铰链区或使用接头区和铰链区两者。在一些实施方案中，接头区可落入铰链区的序列内，或者，铰链区可落入接头区的序列内。优选接头区是肽序列。例如，接头肽约包括0-40个氨基酸，例如0-35个氨基酸、0-30个氨基酸、0-25个氨基酸或0_20个氨基酸。优选铰链区为肽序列。例如，铰链肽约包括0-75个氨基酸，例如0-70个氨基酸、0-65个氨基酸或0_62个氨基酸。在融合蛋白包括接头区和铰链区两者的实施方案中，优选接头区和铰链区各自为肽序列。在这些实施方案中，铰链肽和接头肽合起来约包括0-90个氨基酸，例如0-85个氨基酸或0-82个氨基酸。
[0005]在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和第二多肽可通过中间体结合蛋白连接。在一些实施方案中，融合蛋白的基于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的部分和第二多肽部分可为非共价连接的。
[0006]在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可具有自N端至C端方向或自C端至N端方向的下式之一:
多肽l(a)-铰链1-多肽2(b)
多肽l(a)-接头λ -多肽2(b)
多妝l(a) _接头λ _绞链《 _多妝2(b)
多妝l(a) _绞链? "接头λ _多妝2(b)
多肽l(a)-多肽2(b)_多肽3(。)
多肽l(a)-铰链w -多肽2(b)_铰链w -多肽3(。)
多妝l(a) _接头λ _多妝2(b)-接头-多妝3(。)
多妝l(a) _绞链? "接头λ _多妝2(b)-绞链w -接头λ _多妝3(。)
多妝l(a) _接头λ _绞链《 _多妝2(b)-接头-绞链多妝3(。)
其中η为0-20的整数，其中m为1_62的整数，其中a、b和c为至少I的整数。这些实施方案包括上式及其任何变化或组合。例如，式中多肽的顺序还包括多肽3(。)-多肽l(a)-多肽2(b)、多肽2(b)-多肽3(。)-多肽I(a)或其任何变化或组合。
[0007]在一些实施方案中，多肽I序列包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是一类具有类似结构的蛋白质，最初被鉴定为一组能够抑制蛋白酶的蛋白质。以非限制性实例的方式，适用于本文提供的融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白质包括α-l抗胰蛋白酶(AAT)、抗胰蛋白酶相关蛋白(SERPINA2)、α 1-抗胰凝乳蛋白酶(SERPINA3)、kallistatin (SERPINA4)、单核细胞嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(SERPINB1)、P1-6 (SERPINB6)、抗凝血酶(SERPINC1)、纤溶酶原激活物抑制剂I(SERPINE1)、α 2-抗纤溶酶(SERPINF2)、补体1-抑制剂(SERPING1)和神经丝抑蛋白(SERPINI1)。
[0008]在一些实施方案中，多肽I序列包括α -1抗胰蛋白酶(AAT)多肽序列或来源于AAT的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽I序列包括AAT蛋白的一部分。在一些实施方案中，多肽I序列至少包括AAT蛋白的反应部位环部分。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应部位环部分至少包括氨基酸序列:GTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNK (SEQ ID NO:1)。
[0009]在一个优选的实施方案中，AAT多肽序列或来源于AAT的氨基酸序列是或来源于人AAT多肽序列。
[0010]在一些实 施方案中，融合蛋白包括具有下列氨基酸序列的全长人AAT多肽序列:
【权利要求】
1.一种分离的融合蛋白，其包含与第二多肽有效连接的至少一个人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一种: 免疫球蛋白Fe多肽或来源于免疫球蛋白Fe多肽的氨基酸序列； 细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子靶向多肽的序列； 含有WAP结构域的多肽或来源于含有WAP结构域的多肽的序列；或 白蛋白多肽或来源于血清白蛋白多肽的氨基酸序列。
2.一种分离的融合蛋白，其包含与以下的至少一种的第二多肽有效连接的至少一个α-l抗胰蛋白酶(AAT)多肽: 免疫球蛋白Fe多肽； 细胞因子靶向肽； 人分泌白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)多肽；和 免疫球蛋白Fe多肽和人SLPI多肽，其中SLPI多肽包含人SLPI的WAP2结构域；或 人血清白蛋白(HSA)多肽。
3.一种分离的融合蛋白，其包含与以下的至少一种的第二多肽有效连接的至少一个α-l抗胰蛋白酶(AAT)多肽: 免疫球蛋白Fe多肽； 细胞因子靶向肽； 人抑弹性蛋白酶蛋白多肽； 人抑弹性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白Fe多肽，其中抑弹性蛋白酶蛋白多肽包含人抑弹性蛋白酶蛋白的WAP结构域；或人血清白蛋白(HSA)多肽。
4.权利要求1的融合蛋白，其中所述人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽是人α-l抗胰蛋白酶(AAT)多肽或来源于人AAT多肽。
5.权利要求2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述AAT多肽包含SEQID NO: 2的氨基酸序列。
6.权利要求2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述AAT多肽包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列的AAT的反应部位环或含有SEQ ID NO: 32或33的氨基酸序列的AAT的突变反应部位环。
7.权利要求2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽是人Fe多肽。
8.权利要求7的分离融合蛋白，其中所述人Fe多肽是人IgM多肽或人IgGFe多肽。
9.权利要求8的分离融合蛋白，其中所述人IgGFe多肽是人IgGl多肽、人IgG2 Fe多肽、人IgG3 Fe多肽或人IgG4 Fe多肽。
10.权利要求1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽包含选自SEQID NO: 3、4、5、6和7的氨基酸序列。
11.权利要求1的分离融合蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和免疫球蛋白Fe多肽通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接。
12.权利要求2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述AAT多肽和免疫球蛋白Fe多肽通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接。
13.权利要求11或权利要求12的分离融合蛋白，其中铰链区、接头区或铰链区和接头区两者包含肽序列。
14.权利要求1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自SEQID NO:16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 和 SEQ ID NO: 21 的氨基酸序列。
15.权利要求1-6中任一项的分离融合蛋白，其中所述细胞因子靶向多肽是人细胞因子受体多肽或人细胞因子受体多肽的衍生物、结合细胞因子受体的细胞因子靶向多肽或结合人细胞因子的细胞因子靶向多肽。
16.权利要求15的分离融合蛋白，其中所述人细胞因子受体多肽包含多个亚基。
17.权利要求15或权利要求16的分离融合蛋白，其中所述人细胞因子受体是TNFa、IgE, IL-12、IL-23、IL-6、IL-1 a、IL-1 β、IL-17、IL-13、IL-12 和 IL-23 的 p40 亚基、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27 或 IL-32 的受体。
18.权利要求17的分离融合蛋白，其中所述细胞因子受体是人TNFa的受体。
19.权利要求15的分离融合蛋白，其中所述人细胞因子是TNFa、IgE,IL-12、IL-23、 IL-6.1L-1 a、IL-1 β、IL-17、IL-13、IL-12 和 IL-23 的 p40 亚基、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27 或 IL-32。
20.权利要求19的分离融合蛋白，其中所述细胞因子是人TNFa。
21.权利要求15的分离融合蛋白，其中所述细胞因子靶向多肽是抗体或抗体片段。
22.权利要求21的分离融合蛋白，其中所述抗体或抗体片段是嵌合的、人源化的或完全人的。
23.权利要求1-6的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自SEQID NO: 22、SEQID NO: 23,SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO: 26 和 SEQ ID NO: 27 的氨基酸序列。
24.权利要求1的分离融合蛋白，其中所述含有WAP结构域的多肽序列包含含有选自SEQ ID NO: 8、9和10的氨基酸序列的SLPI多肽序列。
25.权利要求1的分离融合蛋白，其中所述含有WAP结构域的多肽序列包含含有选自SEQ ID NO: 11、12和13的氨基酸序列的抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列。
26.权利要求1的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、含有WAP结构域的多肽和免疫球蛋白Fe多肽，使得丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、含有WAP结构域的多肽和免疫球蛋白Fe多肽的至少两个通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接。
27.权利要求2的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含AAT多肽、SLPI多肽和免疫球蛋白Fe多肽，使得AAT多肽、SLPI多肽和免疫球蛋白Fe多肽的至少两个通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接。
28.权利要求3的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含AAT多肽、抑弹性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白Fe多肽，使得AAT多肽、抑弹性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白Fe多肽的至少两个通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接。
29.权利要求2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含两个AAT多肽和一个免疫球蛋白Fe多肽。
30.权利要求29的分离融合蛋白，其中所述两个AAT多肽的每一个通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者与免疫球蛋白Fe多肽有效连接，使得融合蛋白具有如下的从N端到C端的结构排列:AAT多肽-免疫球蛋白Fe多肽-AAT多肽。
31.权利要求26-30中任一项的分离融合蛋白，其中所述铰链区、接头区或铰链区和接头区两者包含肽序列。
32.权利要求2的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 28的氨基酸序列。
33.权利要求2的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 29的氨基酸序列。
34.权利要求1的融合蛋白，其中所述白蛋白多肽是人血清白蛋白(HSA)多肽或来源于HSA多肽。
35.权利要求2、3或34中任一项的分离融合蛋白，其中HSA多肽包含SEQID NO: 14的氨基酸序列或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
36.权利要求2、3或34中任一项的分离融合蛋白，其中所述HSA多肽包含HSA的结构域3。
37.权利要求34的分离融 合蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白通过白蛋白结合多肽与HSA有效连接。
38.权利要求2或权利要求3的分离融合蛋白，其中所述AAT多肽通过白蛋白结合多肽与HSA有效连接。
39.权利要求37或38的分离融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是抗体或抗体片段或来源于抗体或抗体片段。
40.权利要求39的分离融合蛋白，其中所述抗体或抗体片段是嵌合的、人源化的或完全人的。
41.权利要求37或38的分离融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是肽。
42.权利要求47的分离融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是链球菌蛋白G的结构域3或来源于链球菌蛋白G的结构域3的序列。
43.权利要求1的分离融合蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与HSA多肽共价连接。
44.权利要求1的分离融合蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与HSA多肽非共价连接。
45.权利要求1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 30或31的氨基酸序列。
46.权利要求1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽经修饰以提高FcRn结合。
47.权利要求1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽包含下列突变中的至少一个:Met252Tyr、Ser254Thr> Thr256Glu> Met428Leu 或 Asn434Ser。
48.一种治疗或减轻有需要的受试者中与丝氨酸蛋白酶表达或活性异常有关的疾病或病症的症状的方法，所述方法包括给予前述权利要求中任一项的融合蛋白。
49.一种治疗或减轻有需要的受试者中炎症或炎性疾病或病症的症状同时降低感染风险的方法，所述方法包括给予前述权利要求中任一项的融合蛋白。
50.一种降低有需要的受试者中感染风险的方法，所述方法包括给予前述权利要求中任一项的融合蛋白。
51.权利要求48-51中任一项的方法,其中所述受试者是人。
52.49的方法，其中所述炎性疾病或病症选自:气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺癌、缺血再灌注损伤、心脏移植术后缺血/再灌注损伤、心肌梗死、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、I型和/或II型糖尿病、肺炎、脓毒症、移植物抗宿主病(GVHD)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化。
53.50的方法，其中所述感染选自细菌感染、真菌感染或病毒感染。
【文档编号】C07K16/46GK103917563SQ201280041956
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年6月28日 优先权日:2011年6月28日
【发明者】B.P.埃克尔曼, J.C.蒂默, P.L.恩盖, G.B.京瑟, Q.德弗劳瓦 申请人:英伊布里克斯有限责任公司