流感病毒疫苗及其用途

流感病毒疫苗及其用途
【专利摘要】本发明提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，该流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1?C端主干区段的HA1?N端主干区段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中HA2域中的一或多个氨基酸已突变。亦提供编码这些多肽的核酸，包含这些多肽和/或核酸分子的组合物，以及其使用方法，尤其在检测、预防和/或治疗流感方面。
【专利说明】流感病毒疫苗及其用途
[0001] Μ?
[0002] 本发明是关于医药领域。本文提供流感血球凝集素主干域多肽，提供血球凝集素 主干域多肽的方法，包含其的组合物，包含其的疫苗，及其使用方法，尤其在检测、预防和/ 或治疗流感方面。
[0003] 置量
[0004] 流感病毒为主要的人类病原体，其引起呼吸道疾病（通常称为"流感"或"流行性 感冒")，严重度可在无症状性感染（sub-clinical infection)至可引起死亡的原发性病毒 性肺炎范围内。感染的临床作用随流感病毒株的毒性及宿主的暴露量、病史、年龄及免疫状 态而变化。据估计在世界范围内每年约有10亿人经历流感病毒的感染，在3至5百万个病 例中引起严重疾病，及引起估计300, 000至500, 000起流感相关死亡。大部分此等感染可 归因于携带H1或H3血球凝集素亚型的A型流感病毒，小部分归因于B型流感病毒，且因此 所有三者的代表株均包括于季节性疫苗中。当前免疫实践依赖于早期鉴别传播性流感病毒 以允许及时制造有效的季节性流感疫苗。除在预测将在下一个季节期间占主导地位的病毒 株方面存在固有的困难以外，抗病毒耐药性及免疫逃避亦在当前疫苗无法预防发病及死亡 中起一定作用。除此以外，大流行病的可能性对全球健康造成重大及现实的威胁，该大流行 病由来源于动物储存宿主的高毒性病毒株引起且经过再分类以增强人与人之间传播。
[0005] A型流感病毒在自然界中分布广泛且可感染多种禽类及哺乳动物。流感病毒为包 膜RNA病毒，其属于正黏液病毒科（Orthomyxoviridae)家族。其基因组由8个单链RNA区 段组成，这些单链RNA区段编码以下11种不同的蛋白质：一种核蛋白（NP)、三种聚合酶蛋 白（PA、PB1及PB2)、两种基质蛋白（Ml及M2)、三种非结构蛋白（NS1、NS2及PB1-F2)及两 种外部糖蛋白：血球凝集素（HA)及神经胺酸酶（NA)。基于HA及NA蛋白的抗原结构的差 异对病毒进行分类，且其不同组合表示独特的病毒亚型，这些病毒亚型进一步分类为特定 流感病毒株。尽管所有已知亚型均可见于禽类中，但目前传播的人类A型流感亚型为H1N1 及H3N2。系统发生分析已展示血球凝集素再分成两个主要类群：尤其系统发生第1类群中 的HI、H2、H5及H9亚型，及尤其系统发生第2类群中的H3、H4及H7亚型。
[0006] B型流感病毒株严格针对人类。B型流感病毒株内HA的抗原变异少于在A型病毒 株内观察到的抗原变异。B型流感病毒的两种遗传上及抗原上不同的谱系在人类中传播， 如由 B/Yamagata/16/88(亦称为 B/Yamagata)及 B/Victoria/2/87(B/Victoria)谱系所表 示（Ferguson等人，2003)。尽管由B型流感病毒引起的疾病谱与由A型流感病毒引起的疾 病谱相比一般较温和，但在B型流感感染的情况下仍频繁地观察到需要住院治疗的严重疾 病。
[0007] 已知中和流感病毒的抗体主要是针对血球凝集素（HA)。血球凝集素或HA为三聚 糖蛋白，其锚定至病毒外壳且具有双重功能：其负责结合至细胞表面受体唾液酸，及在吸收 之后，其介导病毒与内体膜的融合，引起病毒RNA在细胞的胞溶质中的释放。HA包含较大头 部域及较小主干域。对病毒膜的附着是由与主干域连接的C端锚定序列所介导。蛋白以指 定环形式翻译后裂解，得到两种多肽HA1及HA2 (完整序列称为ΗΑ0)。膜远程头部区主要来 源于HA1，且膜近端干区主要来自HA2 (图1)。
[0008] 季节性流感疫苗必须每年更新的原因在于病毒的变异性较大。在血球凝集素分子 中，此变异尤其表现于头部域中，其中抗原漂移（drift)及转移（shift)已产生大量不同的 变异体。由于此头部域亦为免疫显性区，故大多数中和抗体是针对此域且藉由干扰受体结 合来起作用。头部域的免疫显性与较大变异的组合亦解释经特定病毒株感染不引起对其他 病毒株的免疫性的原因：由首次感染诱生的抗体仅识别与初次感染的病毒密切相关的有限 数目的病毒株。
[0009] 近来，已经描述了缺乏全部或实质上全部流感血球凝集素球状头部域的流感血球 凝集素主干域多肽，且其用于对主干域多肽的一或多个保守抗原决定基产生免疫反应。相 信主干域多肽的抗原决定基与球状头部域的高度免疫原性区相比免疫原性较低，因此，主 干域多肽中不存在球状头部域可能允许针对主干域多肽的一或多个抗原决定基产生免疫 反应（Steel等人，2010)。因此，Steel等人已藉由以下方式建立一种新的分子：使A/波多 黎各（Puerto Rico)/8/1934 (H1N1)及 A/香港（Hong Kong)/1968 (H3N2)病毒株的 HA1 的 氨基酸残基53至276自HA -级序列中缺失，且用较短柔性连接序列GGGG置换此缺失。用 H3HK68构建体对小鼠进行疫苗接种不会诱生可与第1类群HA交叉反应的抗血清。此外，如 以下实例中所示，这些主干域多肽高度不稳定且未采取正确构象，如由展示结合至干区中 的保守抗原决定基的抗体不发生结合所证实。
[0010] 此外，Bommakanti等人（2010)描述一种基于HA2的多肽，其包含HA2的氨基酸残 基1至172、7氨基酸连接子（GSAGSAG)、HA1的氨基酸残基7至46、6氨基酸连接子GSAGSA， 后接撤1的残基290至321，其中在撤1中有突变￥2971\130(^、￥3021'及03051'。该设计是 基于H3HA的序列（A/香港（Hong Kong)/1968)。该多肽仅针对H3亚型内另一流感病毒株 (A/Phil/2/82)而非针对H1亚型（A/PR/8/34)提供交叉保护。
[0011] 因此，仍存在对安全及有效的通用疫苗的需求，该通用疫苗刺激产生稳固的广泛 中和抗体反应，且针对一组广泛的当前及未来流感病毒株（季节性及大流行性）提供保护， 尤其针对系统发生第1类群和/或第2类群内的一或多种A型流感病毒亚型提供保护，以 用于有效预防及治疗流感。
[0012] 概述
[0013] 本文提供流感血球凝集素主干域多肽，提供主干域多肽的方法，包含其的组合物， 包含其的疫苗及其使用方法。
[0014] 在第一方面中，本发明提供新颖免疫原性多肽，其包含流感血球凝集素主干域且 缺乏球状头部，称为流感血球凝集素（HA)主干域多肽。多肽能够在投与个体（尤其为人类 个体）时诱导免疫反应。本发明的多肽在膜远程头部域中存在的显性抗原决定基不存在的 情况下，向免疫系统呈现膜近端主干域HA分子的保守抗原决定基。为此，移除构成头部域 的ΗΑ0蛋白的一级序列的一部分，且将剩余氨基酸序列直接再连接或在一些实施例中藉由 引入较短柔性连接序列（'连接子'）而再连接，以恢复氨基酸链的连续性。所得序列藉由 引入特定突变来进一步修饰，这些特定突变使ΗΑ0分子的剩余部分的天然3维结构稳定。免 疫原性多肽不包含流感病毒的全长HA1和/或HA2。
[0015] 流感血球凝集素主干域多肽是基于一般用于人类流感疫苗制造的流感病毒株的 HA。具体而言，多肽是基于HI、H5和/或H3亚型的A型流感病毒的HA。
[0016] 在某些实施例中，本发明提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含（a)流感血球 凝集素 HA1域，该流感血球凝集素 HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共 价键联至HA1C端主干区段的HA1N端主干区段；及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中该血 球凝集素主干域多肽在HA1与HA2之间的接合点处可抵抗蛋白酶裂解，且其中连接HA2的 A螺旋与螺旋CD的氨基酸序列中的一或多个氨基酸与野生型流感HA2域相比已突变。HA1 及HA2域优选地来源于选自由HI、H5及H3亚型组成的组的A型流感病毒。
[0017] 如图1中所指示，本发明的多肽在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基 的HA2氨基酸序列中包含一或多个突变。在某些实施例中，该HA2氨基酸序列中的一或多 个疏水性氨基酸已由亲水性氨基酸（诸如极性和/或带电荷的氨基酸）或柔性氨基酸甘氨 酸（G)取代。
[0018] 在某些实施例中，HA1N端主干区段包含HA1的氨基酸1至X，且HA1C端主干区段 包含HA1的氨基酸y至末端（亦即HA1的C端氨基酸）。因此，在某些实施例中，HA1区段 中的缺失包含位置χ+1处的氨基酸至并且包括位置y-Ι处的氨基酸的氨基酸序列。在某些 实施例中，多肽不包含信号序列。因此，在某些实施例中，HA1N端区段包含HA1的氨基酸p 至X，其中P为成熟HA分子的第一个氨基酸（例如在SEQ ID NO: 1的情况下，p = 18)。普 通技术人员将能在无信号肽（例如SEQ ID NO: 1的氨基酸1至17)的情况下制备本文中所 述的多肽。在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例 中，本发明的多肽不包含HA的细胞内序列及跨膜域。在某些实施例中，已移除细胞内及跨 膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置）至 HA2域的C端的氨基酸序列。
[0019] 本发明的多肽不包含全长HA1。
[0020] 在某些实施例中，多肽经糖基化。
[0021] 在某些实施例中，免疫原性多肽实质上小于ΗΑ0,优选地缺乏HA的全部或实质上 全部球状头部。免疫原性多肽长度优选地不大于360个、优选地不大于350、340、330、320、 310、305、300、295、290、285、280、275或270个氨基酸。在某些实施例中，免疫原性多肽长度 为约250至约350个、优选地约260至约340个、优选地约270至约330个、优选地约270 至约330个氨基酸。
[0022] 在某些实施例中，与HA1及HA2域所基于的HA的氨基酸序列相比，多肽在HA1和 /或HA2域中另外包含一或多个其他突变。
[0023] 本发明亦提供用于提供流感血球凝集素干多肽的方法，该方法包含以下一般步 骤：
[0024] (a)提供流感ΗΑ0氨基酸序列；
[0025] (b)移除HA1与HA2之间的裂解位点；
[0026] (c)自ΗΑ0序列中移除球状头部域的氨基酸序列，尤其自位置χ+1开始至y-Ι的氨 基酸序列；
[0027] (d)在使螺旋A的C端残基连接至螺旋⑶的N端残基的氨基酸序列中引入一或多 个突变；及
[0028] (e)在HA主干域多肽中引入一或多个二硫桥键。
[0029] 可藉由这些方法获得的多肽亦为本发明的一部分。
[0030] 在某些实施例中，多肽包含第1类群交叉中和抗体CR6261 (如WO 2008/028946中 所揭示）和/或抗体CR9114(如下文及共同待决申请EP11173953.8中所述；一种能够结合 及中和第1类群及第2类群A型流感病毒以及B型流感病毒的抗体）的保守主干域抗原决 定基。因此，本发明的另一方面提供HA主干域多肽，其中这些多肽结合至抗体CR6261和/ 或抗体CR9114。在一实施例中，多肽不结合至CR8057(描述于W0 2010/130636中；一种仅 结合至H3流感病毒的单克隆抗体）。在某些实施例中，多肽结合至抗体CR8020、CR8043和 /或CR9114。本文提供的流感血球凝集素主干域多肽适用于免疫原性组合物（例如疫苗）， 该免疫原性组合物能够针对复数种A型和/或B型流感病毒株产生免疫反应。在一实施例 中，流感血球凝集素主干域多肽能够针对系统发生第1类群和/或第2类群的A型流感病 毒株、尤其针对系统发生第1类群及第2类群两者的流感病毒株产生免疫反应。在一实施 例中，多肽能够针对同源流感病毒株产生免疫反应。在一实施例中，多肽能够针对属于相同 和/或不同亚型的异源流感病毒株产生免疫反应。在另一实施例中，多肽能够对系统发生 第1类群及第2类群两者的流感病毒株及B型流感病毒株产生免疫反应。
[0031] 本发明的多肽可用于例如独立治疗和/或预防和/或诊断由流感病毒、尤其系统 发生第1类群或第2类群A型流感病毒和/或B型流感病毒引起的疾病或病状，或与其他 预防性和/或治疗性治疗（诸如（现有或未来的）疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体）组 合。
[0032] 在另一方面中，本发明提供编码流感HA主干域多肽的核酸分子。在另一方面中， 本发明提供包含编码免疫原性多肽的核酸的载体。
[0033] 在另一方面中，本发明提供在个体中诱导免疫反应的方法，该方法包含向个体投 与本发明的多肽和/或核酸分子。
[0034] 在另一方面中，本发明提供免疫原性组合物，其包含本发明的多肽和/或核酸分 子。本文提供的免疫原性组合物可呈允许组合物投与个体（例如小鼠、雪貂或人类）的任 何形式。在一特定实施例中，免疫原性组合物适于人类投与。多肽、核酸分子及组合物可用 于预防和/或治疗流感病毒疾病的方法和/或用于诊断目的。组合物可另外包含医药学上 可接受的载剂或赋形剂。在某些实施例中，本文中所述的组合物包含佐剂或与佐剂组合投 与。
[0035] 在另一方面中，本发明提供多肽、核酸和/或免疫原性组合物，其用作疫苗。本发 明尤其是关于免疫原性多肽、核酸和/或免疫原性组合物，其在预防和/或治疗由系统发生 第1类群和/或第2类群的A型流感病毒亚型和/或B型流感病毒引起的疾病或病状中用 作疫苗。
[0036] 由以下本发明的详细描述，将清楚本发明的多肽的各种实施例及用途。
[0037] 附图简要说明
[0038] Ml展示如存在于天然三聚体中的呈融合前状态的HA单体的模型。HA1以浅灰色 展示，HA2以深灰色展示。如同连接此等二级结构组件的环一般，指示螺旋A(CR6261的抗 原决定基的重要部分）及螺旋CD (三聚体界面的一部分）。
[0039] 图2 :如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及本发明的HA主干域多肽的结合。 A:染色后阳性的细胞百分比。B:平均荧光强度。H1-全长（SEQIDN0:1)、微型HA-cll(SEQ ID NO: 3)、微型 HA-cl 1+2 (SEQ ID NO: 4)、微型 HA-c 11+3 (SEQ ID NO: 5)、微型 HA-c 11+4 (SEQ ID N0:6)、微型 HA-cll+2+3(SEQ ID N0:7)、微型 HA-cll+2+3+4(SEQ ID N0:8)。
[0040] 图3 :如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。A :染色后 阳性的细胞百分比。B :平均荧光强度。H1-全长（SEQ ID N0:1)、微型HA(SEQ ID N0:2)、微 型 HA-cll(SEQ IDN0:3)。
[0041] 图4 :血清抗体对HEK293F表达的全长HA及本发明的多肽的结合。A :平均荧光强 度。B :染色后阳性的细胞百分比。H1-FL(SEQ ID N0:1)、CL1(SEQ ID N0:3)、CL1+2(SEQ ID N0:4)及 CL1+4(SEQ ID N0:6)。cM2 为阴性对照。
[0042] 图5 :如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。上图染色 后阳性的细胞百分比。下图：平均荧光强度。H1-全长（SEQIDN0:1)、微型HA-cll(SEQID N0:3)、H1-微型 1-clll (SEQ ID N0:9)、H1-微型2-clll (SEQ ID NO: 10)、H1-微型3-clll (SEQ ID N0:11)、HI-微型 4-clll(SEQ ID N0:12)、HI-微型 l-clll+5(SEQ ID N0:13)、HI-微型 2-clll+5(SEQ ID N0:14)、HI 微型 3-clll+5(SEQ ID N0:15)及 HI-微型 4-clll+5(SEQ ID N0:16)。
[0043] 图 6 :在经编码 HA A/ 布里斯班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)、微型 HA-聚 簇 1 (SEQ ID NO: 3)、微型 2-聚簇 11 (SEQ ID NO: 10)、微型 1-聚簇 11+5 (SEQ ID NO: 13)、微型 2_聚簇11+5 (SEQ ID NO: 14)及cM2 (共同M2序列）的DNA肌肉内免疫或编码HA A/布里斯 班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)、微型 2-聚簇 11+5(SEQ ID NO: 14)及 cM2(共同 M2 序列）的DNA的基因枪免疫之后，血清抗体对来自A/布里斯班（Brisbane) 59/2007的全长 HA的胞外域的结合。图A :首次免疫后28天。图B:免疫49天后。
[0044] 图7 :如由FACS分析的单克降抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。上图 染色后阳性的细胞百分比。下图：平均荧光强度。H1-全长（SEQIDN0:1)、微型HA(SEQ ID N0:2)、HI-微型 2-clll+5(SEQ ID N0:14)、HI-微型 2-cll+5(SEQ ID N0:48)、HI-微型 2-cll+5+6(SEQ ID N0:46)、H1-微型 2-clll+5+6(SEQ ID N0:47)、H1-微型 2-cll+5+6-三聚 体（SEQ ID N0:44)、H1-微型 2-cll+5+6-GCN4(SEQ ID N0:45)。
[0045] 图8 :如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。A :染色后 阳性的细胞百分比。B:平均荧光强度。
[0046] 图9 :如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。A :染色后 阳性的细胞百分比。B:平均荧光强度。
[0047] 图10 :某于呑俄(Hong Kong) /1/1968的构建体在细胞表面上的表达。
[0048] 图11 :本发明的若干多肽的纯化的SDS-PAGE (A至D)及蛋白质印迹（E至F)分析。 在蛋白质印迹中，将针对his标记的抗体用于检测。
[0049] 图12 :如由Elisa检测的单克降抗体CR9114(A)、CR8020(B)及多克隆抗HI HA血 清（C)对本发明的若干多肽的结合。
[0050] 图13 :本发明的多肽的糖基化的SDS-PAGE(A)及蛋白质印迹（B)分析。在去糖基 化之后，扩散条带集中在预期分子量下。在蛋白质印迹中，将针对H1HA的多克隆血清用于 检测。
[0051] 图14 :本发明的多狀的SEC-MALS分析。迹线以SEQ ID N0标记。
[0052] 图15 :A :表达SEQ ID NO: 145的细胞的上清液的蛋白质印迹分析。在蛋白质印迹 中，将针对his标记的抗体用于检测。B :如由Elisa检测的单克隆抗体CR9114 (正方形）、 CR6261(圆圈）、CR8020(向上三角形）及FI6v3(向下三角形）对SEQ IDN0:145的结合。
[0053] 图16 :来自培养物上清液的SEQ ID N0:145在His截留管柱上的纯化的洗脱概况。 本发明的多肽分别在l〇〇mM(A峰）及200mM(B峰）咪唑下洗脱。
[0054] 图17 :A至B :SEQ ID NO: 145藉由尺寸排阻层析（Superdex200)纯化的洗脱概况。 A峰及B峰均含有本发明的多肽。C:来自尺寸排阻层析的部分的非变性PAGE分析。大部 分经纯化的蛋白在与该蛋白的单体形式一致的分子量下运作。D:来自尺寸排阻层析的部分 的SDS PAGE分析。
[0055] 图18 :作为本申请中所述的DNA免疫方案结果的对同源全长蛋白胞外域的IgG反 应的时程。
[0056] 图19 :针对来自同源病毒株H1N1 A/布里斯班（Brisbane) /59/2007 (A)及异源病 毒株H1N1 A/加利福尼亚（California)/07/2009 (B)的全长血球凝集素的胞外域，对个别小 鼠进行首次免疫后第7周时的IgG反应。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
[0057] 图20 :针对来自同源病毒株H1N1 A/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (A)、异源 病毒株H1N1 A/加利福尼亚（California)/07/2009 (B)、异源亚型病毒株H5N1 A/越南 (Vietnam)/1203/2004(0 及异源亚型病毒株 H3N2A/香港（Hong Kong)/1/1968 (D)的全长 血球凝集素的胞外域，对个别小鼠进行首次免疫后第7周时的IgG反应。空心符号对应于 在分析检测限以下的值。
[0058] 图21:基于H3 HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均荧光强度㈧及阳性细 胞％⑶。
[0059] 图22 :针对来自同源病毒株H1N1 A/布里斯班（Brisbane) /59/2007 (图A)、异源 病毒株H1N1 A/加利福尼亚（California)/07/2009 (图B)及异源亚型病毒株H5N1 A/越南 (Vietnam)/1203/2004(图C)的全长血球凝集素，对个别小鼠进行首次免疫后第7周时的 IgG反应。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
[0060] 图23 :单抗CR6261、CR9114、CR8020及CR9020以及多克隆抗H1血清对全长HA及 本发明的相应多肽的FACS分析。上图平均荧光强度。实心条表示全长蛋白，条纹条表示本 发明的多肽。全长HA及来源于该序列的本发明的相应多肽具有相同的背景色。
[0061] 图24 :实例21中所述的流感攻击实验的卡本-麦尔（Kaplan-Meier)存活曲线 (A)、体重变化⑶及临床分数中值（C)。
[0062] 图25 :根据实例22选择的H1N1序列的比对。
[0063] 图26 :根据实例22选择的基于HI HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均荧光 强度。
[0064] 图27 :如由牛物层干渉术测定，旱三聚体及单体形式的全长HI HA(SEQ ID NO 149) 及s-Hl-微型2-聚簇l+5+6-GCN4(SEQ ID N0:145)对经固定的单克隆抗体CR6261(A)、 CR9114(B)及CR8020(C)的结合的动力学。
[0065] 图28 :稳态滴定s-Hl-微型2-聚簇1+5+6-GCN4 (SEQ ID N0:145)对经固定的 CR6261(A)及CR9114(B)的结合，继而进行生物层干涉术。
[0066] 图29 :如由ELISA测定，在第49天时针对来自A/香港（Hong Kong)/1/1968的HA 的胞外域的IgG反应。实验详情描述于实例24中。空心符号对应于在分析检测限以下的 值。
[0067] 图30 :实例24中描述的流感攻击实验的卡本-麦尔存活曲线（A)、体重变化（B) 及临床分数中值（C)。
[0068] 图31 :根据实例25选择的基于HI HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均荧光 强度。
[0069] 图 32 :如由来自 A/ 威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005 (A)、A/ 香港（Hong Kong) /1/1968 (B)及A/Perth/16/2009 (C)的HA测定，49天后针对HA的胞外域的IgG反应。 实验详情描述于实例26中。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
[0070] 图33 :如由ELISA测定，在49天后针对来自A/呑俄(Hong Kong)/1/1968的HA的 胞外域的IgG反应。实验详情描述于实例27中。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
[0071] 图34 :根据实例28选择的基于HI HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均荧光 强度。
[0072] 定义
[0073] 下文给出如本发明中所用的术语的定义。
[0074] 本发明的氨基酸可为20种天然产生的氨基酸（或'标准'氨基酸）中的任一者或 其变异体（诸如D-脯氨酸（脯氨酸的D-对映异构体））、或并非天然可见于蛋白质中的任 何变异体（诸如正亮氨酸）。标准氨基酸可基于其性质划分为数个组。重要因素为电荷、亲 水性或疏水性、尺寸及官能基。此等性质对于蛋白质结构及蛋白质间相互作用很重要。一 些氨基酸具有特殊性质，诸如半胱氨酸，其可对其他半胱氨酸残基形成共价二硫键（或二 硫桥键）；脯氨酸，其对多肽主链形成环；及甘氨酸，其与其他氨基酸相比柔性较大。表5展 示标准氨基酸的缩写及性质。
[0075] 术语"氨基酸序列一致性"是指一对经比对的氨基酸序列之间的一致性或相似性 程度，通常以百分比形式表示。一致性百分比为在比对序列及引入空隙（如有必要）以获得 最大序列同源性百分比之后，候选序列中与肽中相应氨基酸残基一致（亦即，在比对中在 给定位置处的氨基酸残基为相同残基）或相似（亦即，如下文论述，在比对中在给定位置处 的氨基酸取代为保守性取代）的氨基酸残基的百分比。序列同源性（包括序列一致性及相 似性百分比）使用此项技术中熟知的序列比对技术（诸如藉由目视检查及数学计算）来测 定，或更优选地，比较藉由使用计算机程序比较序列信息来进行。一种例示性优选的计算机 程序为 Genetics Computer Group (GCG ;Madison, Wis.)威斯康辛州（Wisconsin)套装 10. 0 版程序 'GAP'（Devereux 等人（1984))。
[0076] "保守性取代"是指一个类别的氨基酸经相同类别的另一氨基酸置换。在特定实施 例中，保守性取代不改变多肽的结构或功能或结构及功能两者。出于保守性取代的目的，氨 基酸的类别包括疏水性（例如Met、Ala、Val、Leu)、中性亲水性（例如Cys、Ser、Thr)、酸性 (例如Asp、Glu)、碱性（例如Asn、Gin、His、Lys、Arg)、构象破坏者（例如Gly、Pro)及芳 族（例如 Trp、Tyr、Phe)。
[0077] 如本文所用，术语"疾病"及"病症"可互换使用以指代个体中的病状。在一些实 施例中，病状为病毒性感染，尤其为流感病毒感染。在特定实施例中，术语"疾病"是指由细 胞或个体中存在病毒引起、或藉由病毒对细胞或个体的侵袭引起的病理状态。在某些实施 例中，病状为个体中的疾病，其严重度藉由经由投与免疫原性组合物在个体中诱导免疫反 应来降低。
[0078] 如本文所用，术语"有效量"在向个体投与疗法的情形下是指具有预防性和/或治 疗性作用的疗法的量。在某些实施例中，"有效量"在向个体投与疗法的情形下是指足以获 得以下效果的疗法的量：降低或改善流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的严重度，诸如 (但不限于）减少流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的持续时间；预防流感病毒感染、 与其相关的疾病或症状的发展；预防流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的发生或发作 或复发；预防或减少流感病毒由一个个体传播至另一个体；减少个体的住院治疗和/或住 院治疗持续时间；提高患有流感病毒感染或与其相关的疾病的个体的存活率；消除流感病 毒感染或与其相关的疾病；抑制或减少流感病毒复制；降低流感病毒效价；和/或增强和/ 或改良另一疗法的预防性或治疗性作用。在某些实施例中，有效量不引起全面保护免于流 感病毒疾病，但与未经治疗的个体相比引起流感病毒效价降低或数目减少。流感病毒的效 价、数目或总负载降低的益处包括（但不限于）感染的症状严重度较低、感染的症状较少及 与感染有关的疾病的持续时间减少。
[0079] 如本文所用的术语"宿主"意欲指代已引入载体（诸如克隆载体或表达载体）的 生物体或细胞。生物体或细胞可为原核或真核的。宿主优选地包含经分离的宿主细胞，例 如培养中的宿主细胞。术语"宿主细胞"仅意味经修饰以用于本发明的多肽的（过度）表 达的细胞。应理解术语宿主意欲不仅指代特定个体生物体或细胞，而且指代该生物体或细 胞的子代。由于某些修饰可能因突变或环境影响而发生于继代中，故该子代可能实际上并 非与亲本生物体或细胞一致，但仍包括于如本文中所用的术语"宿主"的范围内。
[0080] 如本文所用的术语"包括（included或including) "视为后接措词"（但不限 于）"。
[0081] 如本文所用，术语"感染"意谓藉由病毒在细胞或个体中倍增和/或存在而侵袭。 在一个实施例中，感染为"活性"感染，亦即，病毒在细胞或个体中复制的感染。该感染特征 在于病毒自经病毒最初感染的细胞、组织和/或器官传播至其他细胞、组织和/或器官中。 感染亦可为潜伏性感染，亦即，病毒不复制的感染。在某些实施例中，感染是指由细胞或个 体中存在病毒引起、或藉由病毒对细胞或个体的侵袭引起的病理状态。
[0082] 流感病毒分类成流感病毒类型：A属、B属及C属。如本文所用的术语"流感病毒 亚型"是指A型流感病毒变异体，其特征在于血球凝集素（H)及神经胺酸酶（N)病毒表面蛋 白质的组合。根据本发明，流感病毒亚型可利用其Η号数称为诸如"包含H3亚型的HA的 流感病毒"、"Η3亚型的流感病毒"或"Η3流感"，或利用Η号数与Ν号数的组合称为诸如"流 感病毒亚型Η3Ν2"或"Η3Ν2"。术语"亚型"特定言之包括各亚型内的所有个别"病毒株"， 这些病毒株通常由突变产生且展示不同病原性概况，包括天然分离株以及人造突变株或重 配株及其类似物。这些病毒株亦可称为病毒亚型的各种"分离株"。因此，如本文所用，术语 "病毒株"及"分离株"可互换使用。人类流感病毒株或分离株的现行命名法包括病毒类型 (属）（亦即Α、Β或C)、首次分离的地理位置、病毒株号数及分离年份，通常在括号中给出ΗΑ 及ΝΑ的抗原描述，例如A/Moscow/10/00 (Η3Ν2)。非人类病毒株亦在命名中包括起源宿主。 A型流感病毒亚型可另外藉由参考其系统发生类群分类。系统发生分析已展示血球凝集素 再分成两个主要类群：尤其系统发生第1类群（"第1类群"流感病毒）中的H1、H2、H5、H9 亚型，及尤其系统发生第2类群（"第2类群"流感病毒）中的H3、H4、H7及H10亚型。
[0083] 如本文所用，术语"流感病毒疾病"是指由细胞或个体中存在流感病毒（例如A型 或B型流感病毒）或者流感病毒侵袭细胞或个体而产生的病理状态。在特定实施例中，术 语是指由流感病毒引起的呼吸道疾病。
[0084] 如本文所用，术语"核酸"意欲包括DNA分子（例如cDNA或基因组DNA)及RNA分 子（例如mRNA)及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可为单链或双链 的。如普通技术人员将轻易地了解，核酸分子可以化学方式或以生物化学方式修饰，或可含 有非天然或经衍生的核苷酸碱基。这些修饰包括例如：标记；甲基化；用类似物取代一或多 个天然产生的核苷酸；核苷酸间修饰，诸如不带电荷的键联（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨 基磷酸酯、氨基甲酸酯等）、带电荷的键联（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）；侧接部分 (例如多肽）；嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）；螯合剂；烷基化剂；及经修饰的键联（例如 α变旋异构核酸等）。除非另有说明，否则提及核酸序列涵盖其互补序列。因此，提及具有 特定序列的核酸分子应理解为涵盖其互补链以及其互补序列。互补链亦适用于例如反义疗 法、杂交探针及PCR引子。
[0085] 如本文所用，在某些实施例中，ΗΑ中氨基酸的编号是基于野生型流感病毒的ΗΑ0 中氨基酸的编号，例如Η1Ν1流感病毒株Α/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)的 氨基酸的编号。因此，如本发明中所用，措词"HA中位置"x"处的氨基酸"意谓对应于特定 野生型流感病毒（例如A/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1 ;其中HA2域的氨基 酸已以斜体形式指示））的ΗΑ0中位置X处的氨基酸的氨基酸。普通技术人员将理解在其他 流感病毒株和/或亚型中的等效氨基酸可藉由多重序列比对来测定（参见例如表8)。应注 意，在贯穿本申请所用的编号系统中，1是指不成熟ΗΑ0蛋白（SEQ ID NO: 1)的N端氨基酸。 成熟序列起始于例如SEQ ID NO: 1的位置18。在某些实施例中，等效氨基酸的编号是基于H3 ΗΑ0中氨基酸的编号，尤其基于H3N2流感病毒株A/威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID N0:89)的氨基酸的编号。其他H3 HA序列中的等效氨基酸可藉由比对来测定。普通技 术人员将理解在制造期间引导蛋白质转运的前导序列（或信号序列；例如对应于SEQ ID NO:89的氨基酸1至17) -般不存在于例如用于疫苗的最终多肽中。因此，在某些实施例中， 本发明的多肽包含不具有前导序列的氨基酸序列，亦即氨基酸序列是基于不具有信号序列 的ΗΑ0的氨基酸序列。
[0086] 如普通技术人员已知，"多肽"是指利用酰胺键键联的氨基酸的聚合物。如本文所 用，该术语可指代利用共价酰胺键键联的单条多肽链。该术语亦可指代利用非共价相互作 用（诸如离子接触、氢键、凡得瓦尔力（Van derWaals)接触及疏水性接触）缔合的多条多 肽链。普通技术人员将认识到该术语包括例如藉由翻译后处理而经修饰的多肽，该翻译后 处理诸如为信号肽裂解、二硫键形成、糖基化（例如N连接型糖基化）、蛋白酶裂解及脂质修 饰（例如S-棕榈酰化）。
[0087] "主干域多肽"是指多肽，其包含构成天然产生的（或野生型）血球凝集素（HA)的 主干域的一或多条多肽链。主干域多肽通常为单条多肽链（亦即对应于血球凝集素 ΗΑ0多 肽的主干域）或两条多肽链（亦即对应于与血球凝集素 HA2多肽缔合的血球凝集素 HA1多 肽的主干域）。根据本发明，与野生型HA分子相比，主干域多肽包含一或多个突变，特定言 之野生型HA的一或多个氨基酸残基可能经其他氨基酸取代，这些其他氨基酸并非天然产 生于特定野生型HA中的相应位置上。如下文所述，本发明的主干域多肽可另外包含一或多 个连接序列。
[0088] 术语"载体"表示核酸分子，其中可插入第二核酸分子以用于引入其将复制且在 一些情况下表达的宿主中。换言之，载体能够转运其已连接的核酸分子。如本文所用，术 语"载体"涵盖克隆载体以及表达载体。载体包括（但不限于）质体、黏质体、细菌人工染 色体（BAC)及酵母人工染色体（YAC)及来源于噬菌体或植物或动物（包括人类）病毒的载 体。载体包含由所提出的宿主识别的复制起点，且在表达载体的情况下，包含由宿主识别的 启动子及其他调节区。某些载体能够在引入其的宿主中自主复制（例如具有细菌复制起点 的载体可在细菌中复制）。其他载体一旦引入宿主中后即可整合于宿主的基因组中，且藉此 与宿主基因组一起复制。
[0089] 如本文所用，术语"野生型"在病毒的情形下是指流行、自然传播且产生典型疾病 爆发的流感病毒。
[0090] 详细描沭
[0091] 流感病毒对全球公众健康具有重大影响，每年引起数百万例严重疾病、数以千计 的死亡及可观的经济损失。当前三价流感疫苗对疫苗病毒株及密切相关的分离株诱发强力 中和抗体反应，但极少扩展至亚型内分歧较大的病毒株或其他亚型。此外，选择适当疫苗病 毒株存在许多挑战且经常引起欠佳的保护。另外，预测下一次大流行病毒的亚型（包括其 将出现的时间及地点）在当前是不可能的。
[0092] 血球凝集素（HA)为来自A型流感病毒的主要包膜糖蛋白，其为中和抗体的主要标 靶。血球凝集素在进入过程期间具有两个主要功能。第一，血球凝集素经由与唾液酸受体 相互作用来介导病毒对靶细胞表面的附着。第二，在病毒内吞之后，血球凝集素随后触发病 毒与内体膜的融合以将其基因组释放至靶细胞的细胞质中。HA包含具有约500个氨基酸的 较大胞外域，该胞外域由宿主来源的酶裂解，产生仍然利用二硫键键联的2条多肽。大部分 N端片段（HA1，320至330个氨基酸）形成膜远程球状域，该膜远程球状域含有由病毒中和 抗体识别的受体结合位点及大多数决定基。较小C端部分（HA2,约180个氨基酸）形成干 样结构，该干样结构使球状域锚定至细胞或病毒膜。HA1多肽中亚型之间的序列同源性程 度（亚型之间34%至59%同源性）与HA2多肽中（51%至80%同源性）相比较小。最保 守的区域为裂解位点周围的序列，尤其为HA2 N端23个氨基酸，其在所有A型流感病毒亚型 中均为保守的（Lorieau等人，2010)。此区域的一部分以HA前驱体分子（ΗΑ0)中的表面环 形式暴露，但在ΗΑ0裂解成HA1及HA2时变得不可及。
[0093] 大多数中和抗体结合至围绕受体结合位点的环且干扰受体结合及附着。由于此等 环高度易变，故大多数靶向此等区的抗体为病毒株特异性的，解释当前疫苗诱发如此有限 的病毒株特异性免疫的原因。然而，近来产生具有广泛交叉中和效能的针对流感病毒血球 凝集素的完全人类单克隆抗体。功能及结构分析已揭示此等抗体干扰膜融合过程且针对流 感HA蛋白的主干域中的高度保守抗原决定基（Throsby等人，2008 ;Ekiert等人2009 ;W0 2008/028946 ;W0 2010/130636)。
[0094] 根据本发明，已设计含有此等抗原决定基的新颖HA主干域多肽，以便建立基于 通用抗原决定基的疫苗，该疫苗针对广泛范围流感病毒株诱发保护。基本上，首先自全长 HA分子中移除高度易变且免疫显性的部分（亦即头部域），产生主干域多肽（亦称为微型 HA)。以此方式，免疫反应将对定位有针对广泛中和抗体的抗原决定基的主干域重定向。上 述广泛中和抗体用于探查新建分子的正确折叠，并用于证实存在中和抗原决定基。
[0095] 本发明的主干域多肽能够在膜远程头部域中存在的显性抗原决定基不存在的情 况下，向免疫系统呈现膜近端主干域HA分子的保守抗原决定基。为此，移除构成头部域的 ΗΑ0蛋白的一级序列的一部分，且直接再连接或在一些实施例中藉由引入较短柔性连接序 列（'连接子'）来再连接，以恢复多肽链的连续性。所得多肽序列藉由引入特定突变来进 一步修饰，这些突变使ΗΑ0分子的剩余部分的天然3维结构稳定。
[0096] 因此，本发明提供多肽，其包含（a)流感血球凝集素 HA1域，该流感血球凝集素 HA1 域包含利用具有〇至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段的HA1N端 主干区段；及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中HA2域中的一或多个氨基酸已突变。因此， 在本发明的多肽中，HA2域与HA主干域多肽所基于的野生型流感血球凝集素的HA2域相比 包含一或多个突变。
[0097] 流感血球凝集素主干域多肽是基于一般用于人类流感病毒疫苗的A型流感病毒 亚型的HA。在优选地实施例中，主干域多肽是基于包含H1、H5和/或H3亚型的HA的流感 病毒的HA。
[0098] 本发明特定言之提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含（a)流感血球凝集素 HA1域，该流感血球凝集素 HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联 至HA1 C端主干区段的HA1 N端主干区段；及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中血球凝集素 主干域多肽在HA1与HA2之间的接合点处可抵抗蛋白酶裂解，且其中连接HA2的A螺旋与 螺旋CD的氨基酸序列中的一或多个氨基酸与野生型流感HA2域相比已突变。HA1及HA2域 优选地来源于选自由HI、H5及H3组成的组的A型流感病毒亚型。
[0099] 因此，如图1中所指示，本发明的多肽在使螺旋A的C端残基连接至螺旋⑶的N 端残基的HA2氨基酸序列中包含一或多个突变。在某些实施例中，该HA2氨基酸序列中的 一或多个疏水性氨基酸已由亲水性氨基酸（诸如极性和/或带电荷的氨基酸）或柔性氨基 酸甘氨酸（G)取代。
[0100] 本发明的多肽不包含全长HA1。
[0101] 在某些实施例中，免疫原性多肽实质上小于ΗΑ0,优选地缺乏HA的全部或实质上 全部球状头部。免疫原性多肽长度优选地不大于360个、优选地不大于350、340、330、320、 310、305、300、295、290、285、280、275或270个氨基酸。在某些实施例中，免疫原性多肽长度 为约250至约350个、优选地约260至约340个、优选地约270至约330个、优选地约270 至约330个氨基酸。
[0102] 在某些实施例中，与获得HA1及HA2域的HA的氨基酸序列相比，多肽在HA1和/ 或HA2域中另外包含一或多个其他突变。由此，进一步增强干多肽的稳定性。
[0103] 根据本发明，"HA1 N端区段"是指对应于流感血球凝集素（HA)分子的HA1域的氨 基端部分的多肽区段。在某些实施例中，HA1 N端多肽区段包含HA1域的位置1至位置X的 氨基酸，其中位置X上的氨基酸为HA1内的氨基酸残基。术语"HA1 C端区段"是指对应于 流感血球凝集素 HA1域的羧基端部分的多肽区段。在某些实施例中，HA1 C端多肽区段包含 HA1域的位置y至且包括C端氨基酸的氨基酸，其中位置y上的氨基酸为HA1内的氨基酸残 基。根据本发明，y大于X，因此，HA1 N端区段与HA1 C端区段之间（亦即HA1的位置X上 的氨基酸与位置y上的氨基酸之间）的HA1域的区段已缺失，且在一些实施例中，经连接序 列置换。
[0104] 在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸1至x，且HA1 C端主干区段 包含HA1的氨基酸y至末端。因此，在某些实施例中，HA1区段中的缺失包含位置x+1处的 氨基酸至且包括位置y-Ι处的氨基酸的氨基酸序列。
[0105] 在某些实施例中，多肽不包含信号序列。因此，在某些实施例中，HA1N端区段包含 HA1的氨基酸p至X，其中p为成熟HA分子的第一个氨基酸（例如在SEQ IDN0:1的情况下， P = 18)。普通技术人员将能在无信号肽（例如SEQ ID NO: 1的氨基酸1至17)的情况下制 备本文中所述的多肽。在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在 其他实施例中，本发明的多肽不包含HA的细胞内序列及跨膜域。在某些实施例中，已移除 细胞内及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或530 (或等效 位置）至HA2域的C端的氨基酸序列。
[0106] 根据本发明，血球凝集素主干域多肽在HA1与HA2之间的接合点处可抵抗蛋白酶 裂解。普通技术人员已知跨越HA1及HA2的Arg(R)-Gly(G)序列为胰蛋白酶及胰蛋白酶样 蛋白酶的识别位点且通常裂解以达成血球凝集素活化。由于本文中所述的HA主干域多肽 不应活化，故本发明的流感血球凝集素主干域多肽耐蛋白酶裂解。因此，根据本发明，移除 蛋白酶裂解位点，或使跨越HA1及HA2的蛋白酶位点突变成耐蛋白酶裂解的序列。
[0107] 在某些实施例中，HA1 C端主干区段的C端氨基酸残基为除精氨酸（R)或赖氨酸 (K)以外的任何氨基酸。在某些实施例中，HA1 C端氨基酸为谷氨酰胺（Q)、丝氨酸（S)、苏 氨酸（T)、天冬酰胺（N)、天冬氨酸（D)或谷氨酸（E)。在某些实施例中，HA1 C端主干区段 的C端氨基酸残基为谷氨酰胺（Q)。
[0108] 在某些实施例中，多肽经糖基化。
[0109] 流感血球凝集素主干域多肽可基于任何天然产生的A型流感血球凝集素病毒的 HA，该A型流感血球凝集素病毒属于用于人类流感疫苗的亚型。一般用于流感疫苗的A型流 感病毒亚型为H1、H3或H5亚型的A型流感病毒。"基于"意谓HA1域和/或HA2域的N端 区段和/或C端区段与HI、H3和/或H5亚型的任何天然产生的流感血球凝集素的HA1和 /或HA2域的相应N端和/或C端区段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %氨基酸序列一致性，该H1、H3和/或H5亚型为普通技术人员已知或后来 发现的。在某些实施例中，流感血球凝集素主干域多肽是基于第1类群A型流感病毒的流 感血球凝集素。在某些实施例中，流感血球凝集素主干域多肽是基于第2类群A型流感病 毒的流感血球凝集素。在一些实施例中，流感血球凝集素主干域多肽为杂交或嵌合多肽，其 包含以下或由以下组成：来自复数种流感病毒株或亚型的区段和/或域。举例而言，流感血 球凝集素主干域多肽可包含来自不同A型流感病毒HA亚型的HA1 N端及HA1 C端主干区段 和/或HA2域。
[0110] 在某些实施例中，多肽是基于H1HA。如下文所述，在一特定实施例中，多肽包含来 自以下或基于以下的血球凝集素主干域：包含H1亚型的HA的A型流感病毒的HA，诸如来 自流感病毒A/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 1)。普通技术人员将理解， 亦可根据本发明使用包含H1亚型的HA的其他A型流感病毒。在某些实施例中，多肽包含 基于选自表7的A型H1流感病毒的HA的血球凝集素主干域。
[0111] 在某些实施例中，多肽包含HA1 N端多肽区段，该HA1 N端多肽区段包含HI HA1域 的位置1至位置X的氨基酸，其中X为位置46上的氨基酸与位置60上的氨基酸之间的任 何氨基酸，诸如为位置47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59上的氨基酸，优选地 其中X为52、53、55或59。多肽优选地包含不具有信号序列的HA1 N端区段，亦即包含HA1 域的位置18(例如对于HI HA而言，诸如SEQ IDN0:1 ;或其他H1流感病毒株中的等效位置） 至位置X的氨基酸的HA1 N端区段。因此，在某些实施例中，HA1 N端区段包含HA1域的位 置P (其中对于H1HA而言，在SEQ IDN0:1中，p = 18 ;或其他HI HA上的等效位置）至位置 X的氨基酸。
[0112] 在某些实施例中，HA1 C端多肽区段包含HI HA1域的位置y至且包括C端氨基酸 的氨基酸，其中y为HI HA1的位置290上的氨基酸与位置325上的氨基酸之间的任何氨基 酸，优选地其中y为291、303、318或321。根据本发明，HA2域在使螺旋A的C端残基连接 至螺旋⑶的N端残基的HA2氨基酸序列中包含一或多个突变（图1)。在某些实施例中，该 HA2氨基酸序列中的一或多个疏水性氨基酸已由亲水性氨基酸（诸如极性和/或带电荷的 氨基酸）取代。在某些实施例中（例如对于HI HA而言，诸如SEQ ID NO: 1)，连接螺旋A的 C端残基与螺旋CD的N端残基的HA2氨基酸序列包含流感HA2的残基402至418之间的氨 基酸序列。在某些实施例中，连接螺旋A的C端残基与螺旋CD的N端残基的HA2氨基酸序 列包含氨基酸序列 MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R) (SEQ ID N0:17)。
[0113] 在某些实施例中，x为59且y为291。
[0114] 在某些实施例中，X为52且y为321。
[0115] 在某些实施例中，X为53且y为303。
[0116] 在某些实施例中，X为55且y为318。
[0117] 在一实施例中，使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列对应 于：SEQ ID NO: 1的HA2的位置402上的氨基酸与位置418上的氨基酸之间的氨基酸序列， 其中多肽在跨越SEQ ID NO: 1的氨基酸402至418的氨基酸序列中包含一或多个突变。血 清型H1的流感HA的残基402至418之间的氨基酸序列包含氨基酸序列MNTQFTAVGKEFN (H/ K)LE(K/R) (SEQ ID N0:17)。在某些实施例中，血清型H1的流感HA的残基402至418之间 的氨基酸序列包含氨基酸序列MNTQXJAX 2GKEX3N(H/K)X4E(K/R)。
[0118] 因此，在某些实施例中，如表6中所指示，多肽在HI HA2域中包含一或多个突变。 在某些实施例中，位置406、409、413及416上的氨基酸中的一或多者（亦即氨基酸Xi、X 2、 X3&X4中的一或多者）已突变（编号参考SEQ ID NO: 1)。在某些实施例中，位置406上的 氨基酸（亦即XD已转变成选自由以下组成的组的氨基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E&Gdt 选地为S。在某些实施例中，位置409上的氨基酸（亦即X2)已转变成选自由以下组成的组 的氨基酸：S、T、N、Q、R、Η、K、D、E及G，优选地为T、Q或G。在某些实施例中，位置413上的 氨基酸（亦即X 3)已转变成选自由以下组成的组的氨基酸：S、T、N、Q、R、Η、K、D、E、G，优选 地为S。在某些实施例中，位置416上的氨基酸（亦即X 4)已转变成选自由以下组成的组的 氨基酸：3、1\队〇、1?、!1、1(、03、6，优选地为3。亦可能为此等突变的组合。
[0119] 在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸残基1至59,且HA1 C端主 干区段包含HA1的氨基酸残基291至343,其中位置343上的氨基酸（亦即R343)已突变 且为除R以外的氨基酸，优选地为谷氨酰胺（Q)。在某些实施例中，HA1 N端区段由HA1的 氨基酸残基1至59组成，且HA1 C端区段由HA1的氨基酸残基291至343组成。应注意氨 基酸的编号是基于HI ΗΑ0中氨基酸的编号，特定言之是基于H1N1流感病毒株A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)的氨基酸的编号。应注意由于不同流感亚型/病毒株的 HA序列与彼此相比可能在头部区中具有插入或缺失，故编号未必总是相同。普通技术人员 将能藉由序列比对来测定不同流感病毒株和/或亚型的HA序列中的等效氨基酸位置。
[0120] 在某些实施例中，HA1 N端多肽区段不包含信号序列。在优选地实施例中，HA1 N端 区段包含HA1域的位置18至位置59的氨基酸。在某些实施例中，HA1 N端区段由HA1域的 氨基酸18至59组成。
[0121] 在一些实施例中，本发明的多肽在HA1域和/或HA2域中包含一或多个其他突变 (亦即氨基酸取代）。因此，在某些实施例中，HA1域另外包含以下突变中的一或多者：L58T、 V314T及I316T。再次应注意氨基酸的编号是基于H1HA0中氨基酸的编号，特定言之是基于 H1N1流感病毒株A/布里斯班（Brisbane)/59/2007 (SEQ ID N0:1)的氨基酸的编号。普通 技术人员将能测定其他H1流感病毒的HA中的等效氨基酸，且因此将能测定等效突变。
[0122] 在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T及I316T，且HA2域包含以下突变 中的一或多者：F406S、V409T 及 L416S。
[0123] 在某些实施例中，HA1域另外包含突变K321C且/或HA2域另外包含以下突变中 的一或多者：Q405C、F413C、E421C 及 Y502S。
[0124] 在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含 突变：Q405C、F406S、V409T 及 L416S。
[0125] 在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T及I316T，且HA2域包含突变： F406S、V409T、F413C、L416S 及 E421C。
[0126] 在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T及I316T，且HA2域包含突变： F406S、V409T、L416S 及 Y502S。
[0127] 在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含 突变：Q405C、F406S、V409T、F413C、L416S 及 E421C。
[0128] 在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含 突变：Q405C、F406S、V409T、F413C、L416S、E421C 及 Y502S。
[0129] 在其他实施例中，HA2域另外包含突变M420I及V421I中的一或多者或等效突变。
[0130] 在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T及I316T，且HA2域包含以下突变 中的一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I 及 V421I。
[0131] 在某些实施例中，HA1N端主干区段包含HA1的氨基酸残基1至52,优选地为HA1 的氨基酸残基18至52,且HA1 C端主干区段包含HA1的氨基酸残基321至343,其中位置 343上的氨基酸（亦即R343)已突变且为除R以外的氨基酸，优选地为谷氨酰胺（Q)，其中 HA2域包含突变F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。在某些实施例中，HA1 N端主干区段 由HA1的氨基酸残基1至52、优选地HA1的氨基酸残基18至52组成，且HA1 C端主干区段 由HA1的氨基酸残基321至343组成。
[0132] 在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸残基1至53,优选地为HA1 的氨基酸残基18至53,且HA1 C端主干区段包含HA1的氨基酸残基303至343,其中位置 343上的氨基酸（亦即R343)已突变且为除R以外的氨基酸，优选地为谷氨酰胺（Q)。在某 些实施例中，HA1 N端主干区段由HA1的氨基酸残基1至53、优选地HA1的氨基酸残基18至 53组成，且HA1 C端主干区段由HA1的氨基酸残基303至343组成。在一特定实施例中，HA1 域包含突变V314T及I316T，且HA2域包含以下突变中的一或多者：F406S、V409T、L416S、 M420I及V421I。在一优选的实施例中，多肽包含SEQIDN0:11的氨基酸序列。
[0133] 在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸残基1至55,优选地为HA1 的氨基酸残基18至55,且HA1 C端主干区段包含HA1的氨基酸残基318至343,其中位置 343上的氨基酸（亦即R343)已突变且为除R以外的氨基酸，优选地为谷氨酰胺（Q)。在某 些实施例中，HA1 N端主干区段由HA1的氨基酸残基1至55、优选地HA1的氨基酸残基18至 55组成，且HA1 C端主干区段由HA1的氨基酸残基318至343组成。在一实施例中，HA2域 包含突变 F406S、V409T、L416S、M420I 及 V421I。
[0134] 在某些实施例中，多肽另外包含以下突变：HA1域中的R324C及HA2域中的T436C。
[0135] 在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T、I316T及R324C，且HA2域包含 以下突变中的一或多者： 1?4065、￥4091'、14165、财2〇1、料211及了436(：。
[0136] 在一实施例中，HA1域包含突变R324C，且HA2域包含突变F406S、V409T、L416S、 M420I、V421I 及 T436C。
[0137] 在另一实施例中，HA1域包含突变V314T、I316T及R324C，且HA2域包含以下突变 中的一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I、V421I 及 T436C。
[0138] 在一实施例中，HA1域包含突变R324C，且HA2域包含突变F406S、V409T、L416S、 M420I、V421I 及 T436C。
[0139] 在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例 中，已移除细胞内及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或 530 (或等效位置）至HA2域的C端（编号根据SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列。在某些实施 例中，藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ IDN0:143)('折叠子' 序列），任选地经由连接子连接，使多肽进一步稳定。连接子任选地可含有裂解位点以用于 之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列， 例如经由较短连接子（例如EGR)连接的his标记（HHHHHHH)。在一些实施例中，在不存在 折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。
[0140] 在某些实施例中，已移除HA2域的位置530 (或等效位置）至HA2域的C端（编 号根据SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列。在某些实施例中，细胞内及跨膜序列已由氨基酸序列 AGRHHHHHHH(SEQ ID N0:81)或 SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SE Q ID NO :82)置换。
[0141] 在某些实施例中，多肽选择性结合至抗体CR6261和/或CR9114。在一实施例中， 多肽不结合至抗体CR8057。在一实施例中，CR6261包含：重链可变区，该重链可变区包含 SEQ ID N0:20的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID N0:21的氨基酸序 列；CR9114包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID N0:18的氨基酸序列；及轻链可变 区，该轻链可变区包含SEQ ID N0:19的氨基酸序列。在一实施例中，CR8057包含：重链可变 区，该重链可变区包含SEQ ID N0:22的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID N0:23的氨基酸序列。
[0142] 如上所述，多肽包含流感血球凝集素 HA1域，该流感血球凝集素 HA1域包含利用具 有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1 C端主干区段的HA1 N端主干区段。连 接序列不以天然产生的（或野生型）HA形式出现。在某些实施例中，连接子为包含以下的 肽：1个氨基酸残基、2个或2个以下氨基酸残基、3个或3个以下氨基酸残基、4个或4个以 下氨基酸残基、5个或5个以下氨基酸残基、10个或10个以下氨基酸残基、15个或15个以 下氨基酸残基、或20个或20个以下氨基酸残基、或30个或30个以下氨基酸残基、或40个 或40个以下氨基酸残基、或50个或50个以下氨基酸残基。在一特定实施例中，连接序列为 选自由以下组成的组的序列：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、 GSAGSAG 及 GSGSGSG。
[0143] 本发明亦提供用于提供本发明的多肽、特定言之提供本发明的HI HA主干域多肽 的方法，以及利用此等方法可获得或获得的多肽。在某些实施例中，该方法包含以下步骤：
[0144] (a)提供流感ΗΑ0氨基酸序列，特定言之血清型H1的流感ΗΑ0氨基酸序列；
[0145] (b)移除HA1与HA2之间的裂解位点，优选地藉由使HA1的C端氨基酸突变成除精 氨酸（R)或赖氨酸⑷以外的氨基酸；
[0146] (c)自ΗΑ0序列中移除球状头部域的氨基酸序列；此举藉由以下方式进行：使位置 X上的氨基酸与位置y上的氨基酸之间的HA1域的区段缺失，且任选地经由具有0至50个 氨基酸的连接序列将由此获得的HA1的N端区段（跨越HA1的位置1上的氨基酸至并且包 括位置X上的氨基酸）与C端区段（跨越HA1的氨基酸y至C端氨基酸）再连接。在某些 实施例中，X为位置46与60之间的任何位置上的氨基酸，优选地为HA1的位置52、53、55或 59上的氨基酸，且其中y为位置290与325之间的任何位置上的氨基酸，优选地为HA1的位 置291、303、318或321上的氨基酸。再次，所用编号参考SEQIDN0:1。普通技术人员将理 解在制造期间引导蛋白质转运的前导序列（或信号序列；例如对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸 1至17) -般将不存在于例如用于疫苗的最终多肽中。因此，在某些实施例中，本发明的多 肽包含不具有前导序列的HA1 N端区段。
[0147] (d)使经修饰的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定，优选 地藉由在以下中引入一或多个突变：使螺旋A的C端残基连接至螺旋⑶的N端残基的 氨基酸序列、优选地为跨越SEQ ID NO: 1的氨基酸402至418的氨基酸序列（尤其包含 MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R) (SEQ ID N0:17)的氨基酸序列）。突变优选地包含将疏水性氨 基酸残基取代成亲水性氨基酸残基。
[0148] (e)在HA主干域多肽中引入一或多个二硫桥键。
[0149] 根据本发明，移除HA1与HA2之间的裂解位点可藉由在P1位置处使R(在少数情 况下为K)突变成Q来达成（参见例如Sun等人，2010对于裂解位点（SEQ ID NO: 1中的位 置343)的命名的解释）。优选地突变成Q，但S、T、N、D或E为替代方案。
[0150] 移除头部域可例如藉由使来自SEQ ID NO: 1的氨基酸53至320、或来自其他流感病 毒的HA中的等效位置处的氨基酸缺失来达成。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合 的算法（诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。序列的剩余部分可直接连接， 或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔 性连接子（小于或等于10个氨基酸），例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似 物。缺失长度亦可变化，例如藉由在位置（x)(等效位置）处、例如在位置54、55、56、57或 58处开始缺失；或藉由在位置47、48、49、50、51或52处切割以增加缺失长度。类似地，最 后一个欲缺失的氨基酸可在位置（y)、诸如315、316、317、318或319(等效位置）处，或在位 置321、322、323、324或325(等效位置）处以增加缺失长度。重要的是认识到，缺失长度的 变化可藉由匹配连接子序列的长度来部分补偿，亦即较大缺失可与较长连接子匹配且反之 亦然。本发明亦涵盖此等多肽。
[0151] 根据本发明，增强A螺旋与⑶螺旋之间的环的溶解度。此环由HI A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007 (SEQ ID NO: 1)中的残基402至418 (等效残基）形成。因此，使经修 饰的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定。如可在以下表6中看出，此环 在H1序列中高度保守。此举可例如藉由用亲水性对应物置换该环中的氨基酸I、L、F或V 来达成。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法（诸如Clustal或Muscle)比对 序列来轻易地测定。突变成甘氨酸使融合后构象不稳定，因为此氨基酸的高度柔性引起欲 利用HA序列的此部分形成的融合后螺旋的稳定性降低。描述血清型H1的流感HA的残基 402至418之间的环的共同序列为（SEQ ID NO: 17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本发明 的多肽中，位置406、409、413和/或416(或其等效位置，如由序列比对测定）处的氨基酸 为极性（S、T、N、Q)、带电荷的（R、H、K、D、E)或柔性（G)氨基酸。亦可能为此等位点处的突 变的组合，例如F406S、V409T、L416S。在一些情况下，优选地为恢复共同氨基酸的突变，例 如其中V或Μ在位置404处（突变成T)，V在408(突变成A)或410(突变成G)处，或I在 414处（突变成N);具有此等特定氨基酸的序列的发生率极低。表征本发明的多肽的上述 突变的概述在表6中给出。
[0152] 根据本发明，将一或多个二硫桥键引入主干域多肽中，优选地在H1A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007中的位置324与436 (或等效位置）的氨基酸之间。等效位置可由普 通技术人员藉由使用适合的算法（诸如ClustaUMuscle等）比对序列来轻易地测定。藉由 以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个（若另一者已为半胱氨酸）、 但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形 成共价键。
[0153] 天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之 间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的 分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基 元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。根据本发明，可在位置418至433(等效 位置）处将用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列（例如IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ IDN0:83))引 入本发明的多肽中。在某些实施例中，在位置419至433(等效位置）处引入来源于GCN4且 亦已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ (SEQ ID N0:84)。在某些实施例中，藉由将M420、L423、 V427、G430修饰成异亮氨酸来使三聚体界面稳定。
[0154] 在某些实施例中，本发明的多肽含有HI HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施 例中，已移除细胞内及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或 530 (或等效位置）至HA2域的C端（编号根据SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列，以在表达于细 胞中之后产生可溶性多肽。在某些实施例中，藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦即 AYVRKDGEWVLL(SEQ IDN0:80)，任选地经由连接子连接，使多肽进一步稳定。连接子可任选 地含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的 纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子（例如EGR)连接的his标记（HHHHHHH)。在一 些实施例中，在不存在折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。在某些实施例中， 细胞内及跨膜序列已由氨基酸序列AGRHHHHHHH(SEQ ID N0:97)或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPR DGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ IDN0:82)置换。
[0155] 申请人:先前已鉴别由来自经接种疫苗的个体的原代人类B细胞分离的广泛中和 抗体，其中一些对第1类群具有特异性（例如CR6261，如W0 2008/028946中所述），且其中 一些对第2类群流感病毒具有特异性（例如CR8020,如W0 2010/130636中所述）。此等单克 隆抗体的抗原决定基的详细分析已揭露此等特异性抗体缺乏交叉反应性的原因。在两种情 况下，聚糖存在于第1类群或第2类群HA分子中的不同位置上至少部分解释抗体具有类群 特异性的事实。如下文所述，在鉴别与许多第1类群及第2类群HA分子交叉反应的CR9114 样抗体的情况下，已清楚人类免疫系统有可能针对流感病毒诱生极广泛中和抗体。然而，鉴 于对每年疫苗接种流程的需求，在经（季节性）H1和/或H3亚型的流感病毒感染或疫苗接 种之后显然不诱生或仅在极低程度上诱生此等抗体。因此，在某些实施例中，本发明提供以 构象正确方式呈现HA的干区的多肽，以便在不存在免疫显性可变区的情况下向免疫系统 呈现诱生广泛中和抗体的抗原决定基。由于已知聚糖模式在H1与H3HA之间不同，且此差 异可引起较多类群限制性抗体反应，故在不同实施例中，本发明的多肽是基于第2类群HA 分子（例如H3的HA)。如以下实例3中所示，与H3亚型相比，CR9114对H1亚型的活体外 中和能力较高。因此，猜测与H3HA分子（其可归因于HA1中N38上为许多第2类群HA亚型 所共有的聚糖）相比，CR9114的抗原决定基对H1较可及。在不希望受此理论束缚下，可推 断若本发明的多肽是基于H1，则所得抗体很可能受第2类群HA分子上N38上的聚糖阻碍， 且因此对第2类群流感病毒的活性稍低。因此，为了能够诱生以良好活性对第1类群及第 2类群两者流感病毒起作用的广泛中和抗体，在某些实施例中，本发明的主干域多肽是基于 H3 HA亚型。
[0156] 人类经常受包含H1或H3亚型的HA的季节性流感病毒感染。显然尽管暴露于此 等流感病毒，但在自然情况下通常不产生广泛中和抗体。除HA中存在易变头部区以外，此 现象的原因之一可能为暴露于与先前所见亚型密切相关的新亚型不知何故使反应较不广 泛。因此，优选地可使个体暴露于较无关的亚型序列。因此，在另一实施例中，本发明的主 干域多肽是基于第2类群亚型的HA，该第2类群亚型在HA1中的位置38上含有天冬酰胺 (N) (N38)且不为H3亚型。
[0157] 在某些实施例中，多肽是基于A型流感病毒亚型。在某些实施例中，多肽不基于H7 HA。
[0158] 如上所述，本发明的多肽不仅经设计基于来自第1类群的流感疫苗病毒亚型（诸 如H1及H5)的亲本HA序列，而且亦可基于来自第2类群的流感亚型的HA序列，尤其用于 流感疫苗的第2类群的流感病毒亚型（诸如H3)。根据本发明，多肽经构建保守CR8020 及CR8043的抗原决定基，因为此等抗体能够中和多种第2类群病毒株（W0 2010/130636)。 在此等多肽中，干区底部处的β片及其周围应尽可能的保守，因为此β片为CR8020及 CR8043结合至Η3 ΗΑ的区域。
[0159] 在某些实施例中，ΗΑ域属于Η3亚型，优选地属于Α/威斯康辛州 (Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID Ν0:89)或 Α/香港（Hong Kong)/1/1968 (SEQ ID Ν0:121)。普 通技术人员将理解，亦可根据本发明使用包含H3亚型的HA的其他A型流感病毒。
[0160] 在某些实施例中，多肽包含HA1 N端多肽区段或由HA1 N端多肽区段组成，该HA1 N 端多肽区段包含H3 HA1域的位置1至位置X的氨基酸，优选地包含HA1域的位置p至位置 X的氨基酸，其中X为H3 HA1的位置56与69之间的任何氨基酸，诸如为57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67或68，优选地其中1为61、62、63或68。在某些实施例中，拟1(：端多肽 区段包含H3HA1域的位置y至且包括C端氨基酸的氨基酸，其中y为H3 HA1的位置292与 325之间（且包括位置292及325)的任何氨基酸，优选地其中y为293、306、318或323。
[0161] 在某些实施例中，HA域属于H3亚型，优选地属于A/威斯康辛州 (Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID N0:89)或 A/香港（Hong Kong)/1/1968 (SEQ ID N0:121)。
[0162] 根据本发明，头部域已藉由以下方式移除：使HA1序列的较大部分缺失，且经由较 短连接子使N端及C端序列再连接。缺失长度可变化，但优选地HA1的N端序列的最后一 个残基与C端序列的第一个残基在空间上紧靠在一起以避免经由连接序列引入病毒株。在 H3序列中，可在S62至P322、S63至P305及T64至T317(等效位置）处引入缺失。等效位 置可由普通技术人员藉由使用适合的算法（诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地 测定。序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50 个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子（小于或等于10个氨基酸），例如GGG、GGGG、 GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。缺失长度亦可变化，例如藉由在位置63、64、65、66、 67 (等效位置）处开始来减少缺失中的残基数目，或藉由在位置57、58、59、60或61处切割 来增加缺失长度。类似地，最后一个欲缺失的氨基酸可在位置317、318、319、320或321 (等 效位置）处，或在位置323、324、325、326或327(等效位置）处以增加缺失长度。重要的是 认识到，缺失长度的变化可藉由匹配连接子序列的长度来部分补偿，亦即较大缺失可与较 长连接子匹配且反之亦然。此等多肽亦包括于本发明中。
[0163] 在某些实施例中，X为61且y为323。
[0164] 在某些实施例中，X为62且y为306。
[0165] 在某些实施例中，X为63且y为318。
[0166] 在某些实施例中，X为位置62、63、64、65、66或位置56、57、58、59或60(等效位 置）。
[0167] 在某些实施例中，y为位置306、318、319、320、321或322 (等效位置），或位置324、 325、326、327 或 328 (等效位置）。
[0168] 在一实施例中，使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列对应 于：SEQ ID N0:89的HA2的位置400上的氨基酸与位置420上的氨基酸之间的氨基酸序列， 或其他H3病毒株中等效位置上的氨基酸残基，其中多肽在以下中包含一或多个突变：使螺 旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列，亦即跨越SEQ ID N0:89的氨基酸 400至420的氨基酸序列，或其他H3流感病毒株中的等效氨基酸残基。
[0169] 在某些实施例中，使血清型H3的流感HA的螺旋A的C端残基连接至螺旋⑶的N 端残基的氨基酸序列包含SEQ ID N0:104的氨基酸序列。
[0170] 根据本发明，多肽在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列 中包含一或多个突变。在某些实施例中，多肽包含表8的一或多个突变、或H3亚型的其他 流感病毒株中的等效突变。
[0171] 根据本发明，已移除HA1与HA2之间的裂解位点。在某些实施例中，位置345 (编号 参考SEQ ID N0:89)处的裂解位点移除已突变（R345Q)，以防止自ΗΑ0形成HA1及HA2。任 选地可再缺失残基347至351 (IFGAI，融合肽的一部分），以使疏水性残基对水性溶剂的暴 露降至最低。裂解处的正电荷在H3中100%保守，且此突变可因此应用于所有序列中。
[0172] 头部域的缺失留下现暴露于水性溶剂的残基400至420之间的B环。在H3HA中，此 环高度保守（参见表9)。共同序列为：4011 (E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421 (SEQ ID N0:104 ; 编号参考SEQ ID N0:89)。为了增加此环的溶解度以用于呈融合前构象的本发明的多肽且 使融合后构象不稳定，一些疏水性残基必需修饰成极性（S、T、N、Q)、带电荷的氨基酸（R、H、 1(、03)，或必需藉由突变成6来增加柔性。特定言之，在位置401、408、411、415、418(编号 参考SEQ ID N0:89)处的突变将有助于本发明的多肽的稳定性。
[0173] 为了使本发明的多肽的融合前构象稳定，在于一级序列中远离但在折叠的融合前 构象中接近的两个部分之间引入共价键。为此，二硫桥键可在本发明的多肽中经工程化，优 选地在H3A/威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID N0:89)中的位置326与438 (等效 位置）之间。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法（诸如ClustaUMuscle等） 比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一 个（若另一者已为半胱氨酸）、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧 化在此等残基的硫原子之间形成共价键。藉由使此等残基突变成半胱氨酸，可在H3 A/威斯 康辛州（Wisconsin)/67/2005 (SEQ ID N0:89)中的位置334与393 (等效位置）之间建立替 代性半胱氨酸桥连基。在一些情况下，将位置321 (等效位置）处的半胱氨酸修饰成甘氨酸 以避免形成不当二硫桥键。
[0174] 在某些实施例中，多肽包含以下突变中的一或多者：F408S、I411T、F415S、V418G、 I401R、K326C、S438C、T334C、I393C、C321G。
[0175] 天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之 间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断 的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋 基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。在位置421至441(等效位置）处 引入用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIEAIEKK。为了避免妨碍在位置 326与438之间形成二硫桥键，亦使用在位置421至435 (等效位置）处的替代性较短序列 IEAIEKKIEAIEKKI。一种替代方案为在位置421至441处引入来源于GCN4且已知三聚的序 列 RMKQIEDKIEEIESKQKKIEN 或在位置 421 至 435 处引入较短序列 RMKQIEDKIEEIESK。
[0176] 本发明的多肽可含有HA的细胞内序列及跨膜域，以便所得多肽在表达于细胞中 时呈现于细胞表面上。在其他实施例中，移除位置522至C端（等效位置）的细胞质序列 及跨膜序列，以便在表达于细胞中之后产生分泌型（可溶性）多肽。一些其他残基任选地 可藉由自523、524、525、526、527、528或529(等效位置）缺失序列而包括于可溶性蛋白质 中。藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQIDN0:143)( '折叠子' 序列），任选地经由连接子连接，可使可溶性多肽进一步稳定。连接子可任选地含有裂解位 点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加 标记序列，例如经由较短连接子（例如EGR)连接的his标记（HHHHHHH)。在一些实施例中， 在不存在折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。
[0177] 根据本发明，HA2域的位置530 (编号根据SEQ ID NO: 1)至C端氨基酸的氨基酸序 列可经移除并置换为以下序列：EGRHHHHHHH(SEQ IDN0:81)或 SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQ AYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO :82)〇
[0178] 在某些实施例中，HA1 N端主干区段不包含信号序列。普通技术人员将理解在制 造期间引导蛋白质转运的前导序列（或信号序列；例如对应于SEQ ID N0:89的氨基酸1至 17) -般将不存在于例如用于疫苗的最终多肽中。因此，在某些实施例中，本发明的多肽包 含不具有前导序列的氨基酸序列。
[0179] 根据本发明，多肽不基于B型流感的HA分子。B型流感病毒株严格地针对人类。 B型流感病毒株内HA的抗原变异少于在A型病毒株内观察到的抗原变异。B型流感病 毒的两种遗传上及抗原上不同的谱系在人类中传播，如由B/Yamagata/16/88(亦称为B/ Yamagata)及 B/Victoria/2/87(B/Victoria)谱系所表不（Ferguson 等人，2003)。尽管由 B型流感病毒引起的疾病谱与由A型流感病毒引起的疾病谱相比一般较温和，但在B型流感 感染的情况下仍频繁地观察到需要住院治疗的严重疾病。
[0180] 根据本发明，提供模拟CR6261及CR9114的特异性抗原决定基的多肽，且其可用作 免疫原性多肽以例如在单独或与其他预防性和/或治疗性治疗组合活体内投与时诱生交 叉中和抗体。在"交叉中和抗体"的情况下，抗体意谓能够中和：系统发生第1类群的A型 流感病毒的至少两种、优选地至少三种、四种或五种不同亚型；和/或系统发生第2类群的 A型流感病毒的至少两种、优选地至少三种、四种或五种不同亚型；和/或B型流感病毒的 至少两种不同亚型，尤其由CR6261及CR9114中和的至少所有病毒株。
[0181] 本发明的多肽不包含全长HA1。在某些实施例中，免疫原性多肽实质上小于ΗΑ0， 优选地缺乏HA的全部或实质上全部球状头部。免疫原性多肽长度优选地不大于360个、优 选地不大于 350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275 或 270 个氨基酸。在一 实施例中，免疫原性多肽长度为约250至约350个、优选地约260至约340个、优选地约270 至约330个、优选地约270至约330个氨基酸。
[0182] 在某些实施例中，多肽选择性结合至抗体CR6261和/或CR9114。在一实施例中， 多肽不结合至抗体CR8057。在一实施例中，CR6261包含：重链可变区，该重链可变区包含 SEQ ID N0:20的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID N0:21的氨基酸序 列；CR9114包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID N0:18的氨基酸序列；及轻链可变 区，该轻链可变区包含SEQ ID N0:19的氨基酸序列。在一实施例中，CR8057包含：重链可变 区，该重链可变区包含SEQ ID N0:22的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID N0:23的氨基酸序列。
[0183] 如上所述，多肽包含流感血球凝集素 HA1域，该流感血球凝集素 HA1域包含利用具 有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1 C端主干区段的HA1 N端主干区段。连 接序列不以天然产生的（或野生型）HA形式出现。在某些实施例中，连接子为包含以下的 肽：1个氨基酸残基、2个或2个以下氨基酸残基、3个或3个以下氨基酸残基、4个或4个以 下氨基酸残基、5个或5个以下氨基酸残基、10个或10个以下氨基酸残基、15个或15个以 下氨基酸残基、或20个或20个以下氨基酸残基、或30个或30个以下氨基酸残基、或40个 或40个以下氨基酸残基、或50个或50个以下氨基酸残基。在一特定实施例中，连接序列为 选自由以下组成的组的序列：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、 GSAGSAG 及 GSGSGSG。
[0184] 本发明亦提供用于提供本发明的多肽、特定言之提供本发明的HA主干域多肽的 氨基酸序列的方法，以及利用此等方法可获得或获得的多肽。在某些实施例中，该方法包含 以下步骤：
[0185] -提供流感ΗΑ0氨基酸序列，例如血清型HI、H5或H3的流感ΗΑ0序列；
[0186] -移除HA1与HA2之间的裂解位点，优选地藉由使HA1的C端氨基酸突变成除精氨 酸（R)或赖氨酸⑷以外的氨基酸；
[0187] -自ΗΑ0序列中移除球状头部域的氨基酸序列；此举藉由以下方式进行：使位置X 上的氨基酸与位置y上的氨基酸之间的HA1域的区段缺失，且任选地经由具有0至50个氨 基酸的连接序列将由此获得的HA1的N端区段（跨越HA1的位置1上的氨基酸至并且包括 位置X上的氨基酸）与C端区段（跨越HA1的氨基酸y至C端氨基酸）再连接。
[0188] -使经修饰的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定，优选地藉由 在以下中引入一或多个突变；使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序 列、优选地为跨越HI HA的氨基酸402至418的氨基酸序列（尤其包含MNTQFTAVGKEFN (H/K) LE(K/R) (SEQ ID N0:17)或对于 H3 HA 的 I (E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421 (SEQ ID N0:104) 的氨基酸序列）。突变优选地包含将疏水性氨基酸残基取代成亲水性氨基酸残基。
[0189] -在HA主干域多肽中引入一或多个二硫桥键。
[0190] 根据本发明，移除HA1与HA2之间的裂解位点可藉由在P1位置处使R(在少数情 况下为K)突变成Q来达成（参见例如Sun等人，2010对于裂解位点（SEQ ID NO: 1中的位 置343)的命名的解释）。优选地突变成Q，但S、T、N、D或E为替代方案。
[0191] 移除头部域可例如藉由使来自SEQ ID NO: 1的氨基酸53至320缺失来达成。等效 位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法（诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地 测定。序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50 个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子（小于或等于10个氨基酸），例如GGG、GGGG、 GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。缺失长度亦可变化，例如藉由在位置（X)(等效位 置）处、例如在位置54、55、56、57或58处开始缺失；或藉由在位置47、48、49、50、51或52处 切割以增加缺失长度。类似地，最后一个欲缺失的氨基酸可在位置（y)、诸如315、316、317、 318或319 (等效位置）处，或在位置321、322、323、324或325 (等效位置）处以增加缺失长 度。重要的是认识到，缺失长度的变化可藉由匹配连接子序列的长度来部分补偿，亦即较大 缺失可与较长连接子匹配且反之亦然。本发明亦涵盖此等多肽。
[0192] 根据本发明，增强A螺旋与⑶螺旋之间的环的溶解度。此环由HI A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007 (SEQ ID N0:1)中的残基402至418(等效位置）形成。因此，使经修饰 的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定。如可在以下表6中看出，此环在 H1序列中高度保守。此举可例如藉由用亲水性对应物置换该环中的氨基酸I、L、F或V来 达成。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法（诸如Clustal或Muscle)比对序 列来轻易地测定。突变成甘氨酸使融合后构象不稳定，因为此氨基酸的高度柔性引起欲利 用HA序列的此部分形成的融合后螺旋的稳定性降低。描述血清型H1的流感HA的残基402 至418之间的环的共同序列为（SEQ IDN0:17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本发明的 某些多肽中，位置406、409、413和/或416(或其等效位置，如由序列比对测定）处的氨基 酸为极性（S、T、N、Q)、带电荷的（R、H、K、D、E)或柔性（G)氨基酸。亦可能为此等位点处的 突变的组合，例如SEQ ID N0:10及SEQ ID N0:14中的F406S、V409T、L416S。在一些情况下， 优选地为恢复共同氨基酸的突变，例如其中V或Μ在位置404处（突变成T)，V在408 (突 变成A)或410 (突变成G)处，或I在414处（突变成N);具有此等特定氨基酸的序列的发 生率极低。表征本发明的多肽的上述突变的概述在表6中给出。
[0193] 根据本发明，将一或多个二硫桥键引入主干域多肽中，优选地在H1A/布里斯班 (Brisbane)/59/2007中的位置324与436 (或等效位置）的氨基酸之间：SEQ ID N0:13至 SEQ ID NO: 16。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法（诸如Clustal、Muscle 等）比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至 少一个（若另一者已为半胱氨酸）、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活 性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。
[0194] 利用该方法可获得的多肽亦为本发明的一部分。
[0195] 天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之 间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的 分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基 元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。根据本发明，可在位置418至433(等 效位置）处将用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ IDN0:83)弓丨入本 发明的多肽中。在某些实施例中，在位置419至433(等效位置）处引入来源于GCN4且亦 已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID N0:84)。在某些实施例中，藉由将M420、L423、 V427、G430修饰成异亮氨酸来使三聚体界面稳定。
[0196] 在某些实施例中，多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID N0:3至 SEQIDN0:16、SEQIDN0:44至SEQIDN0:53、SEQIDN0:111至SEQIDN0:114、SEQIDN0:119 至 SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 144 至 SEQ ID NO: 175 及 SEQ ID NO: 177 至 SEQ ID NO: 187。
[0197] 在某些实施例中，多肽是选自由以下组成的组：SEQ IDN0:45、SEQ IDN0:113及SEQ ID NO: 130。
[0198] 普通技术人员将理解在制造期间引导蛋白质转运的前导序列（或信号序列；例如 对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸1至17)不存在于例如用于疫苗的最终多肽中。因此，在某些 实施例中，本发明的多肽包含不具有前导序列的氨基酸序列。
[0199] 可根据视为适于熟习技术者的任何技术（包括下文描述的技术）制备流感血球凝 集素主干域多肽。
[0200] 因此，本发明的免疫原性多肽可藉由此项技术中已知的标准方法以DNA序列形式 合成并克隆，且随后使用此项技术中已知的适合的限制酶及方法活体外或活体内表达。因 此，本发明亦关于编码上述多肽的核酸分子。本发明另外关于包含编码本发明的多肽的核 酸的载体。在某些实施例中，本发明的核酸分子为载体（例如质体）的一部分。这些载体 可利用普通技术人员所熟知的方法来轻易地操作，且可例如经设计以能够在原核和/或真 核细胞中复制。此外，许多载体可直接或以来自其的经分离的所需片段形式用于真核细胞 转型，且将全部或部分整合至这些细胞的基因组中，产生在基因组中包含所需核酸的稳定 宿主细胞。所用载体可为适于克隆DNA且可用于相关核酸转录的任何载体。当使用宿主细 胞时，载体优选地为整合载体。或者，载体可为游离型复制载体。
[0201] 普通技术人员能够选择适合的表达载体，且以功能方式插入本发明的核酸序 列。为了获得编码多肽的核酸序列的表达，普通技术人员熟知能够驱动表达的序列可功 能性连接至编码多肽的核酸序列，产生编码呈可表达形式的蛋白质或多肽的重组核酸分 子。通常，将启动子序列置放于应表达的序列的上游。此项技术中可利用许多表达载体， 例如Invitrogen的pcDNA及pEF载体系列、来自BD Sciences的pMSCV及pTK-Hyg、来自 Stratagene的pCMV-Script等，这些表达载体可用于获得适合的启动子和/或转录终止子 序列、polyA序列及其类似序列。当参考控制所编码的多肽的转录及翻译的序列适当插入编 码相关多肽的序列时，所得表达卡匣适用于制造相关多肽，称为表达。驱动表达的序列可包 括启动子、强化子及其类似物及其组合。此等序列应能够在宿主细胞中起作用，藉此驱动与 其功能性连接的核酸序列的表达。普通技术人员意识到各种启动子可用于获得基因在宿主 细胞中的表达。启动子可为组成性的或经调节的，且可自各种来源（包括病毒、原核或真核 来源）获得或经人工设计。相关核酸可自天然启动子或其衍生物或自完全异源的启动子表 达（Kaufman，2000)。一些用于在真核细胞中表达的熟知且较常用的启动子包含：来源于病 毒（诸如腺病毒）的启动子，例如E1A启动子；来源于细胞巨大病毒（CMV)的启动子，诸如 CMV实时早期（IE)启动子（本文中称为CMV启动子）（可例如自pcDNA，Invitrogen获得）； 来源于猴病毒40 (SV40)的启动子（Das等人，1985);及其类似启动子。适合的启动子亦可 来源于真核细胞，诸如金属硫蛋白（MT)启动子、延长因子1 a (EF-1 α )启动子（Gill等人， 2001)、泛素 C或UB6启动子（Gill等人，2001)、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休 克启动子及其类似启动子。测试启动子功能及启动子强度为普通技术人员的常规事项，且 通常可例如涵盖克隆在启动子序列后面的测试基因（诸如lacZ、荧光素酶、GFP等），及针 对测试基因的表达测试。当然，启动子可藉由其中序列的缺失、添加、突变来改变且针对功 能性测试，以发现新型减弱或改良的启动子序列。根据本发明，优选地为在所选真核细胞中 产生较高转录水平的较强启动子。
[0202] 构建体可使用普通技术人员所熟知的方法转染至真核细胞（例如植物、真菌、酵 母或动物细胞）或适合的原核表达系统（如大肠杆菌（E.coli))中。在一些情况下，可将 适合的'标记'序列（诸如（但不限于）his标记、myc标记、strep标记或flag标记）或完 全蛋白质（诸如（但不限于）麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶）添加至本发明的序列 中，以允许自细胞或上清液中纯化和/或鉴别多肽。任选地可包括含有特异性蛋白水解位 点的序列以在之后藉由蛋白水解消化移除标记。
[0203] 可藉由此项技术中已知的光谱学方法（例如圆二色性光谱学、傅里叶变换红外光 谱学（Fourier Transform Infrared spectroscopy)及NMR光谱学或X射线晶体学）分析经 纯化的多肽，以研究所需结构（如螺旋及β片）的存在。ELISA、Octet及FACS及其类似 方法可用于研究本发明的多肽对前述广泛中和抗体（CR6261、CR9114、CR8057)的结合。因 此，可选择具有正确构象的本发明的多肽。
[0204] 本发明另外关于免疫原性组合物，其包含治疗有效量的本发明的多肽和/或核酸 中的至少一者。在某些实施例中，组合物包含多肽，该多肽包含血球凝集素主干域，该血球 凝集素主干域来自（或基于）一种流感亚型的HA，例如基于包含例如H1或H7亚型的HA的 流感病毒的HA。在某些实施例中，组合物包含多肽，该多肽包含血球凝集素主干域，该血球 凝集素主干域基于两种或两种以上不同流感亚型的HA，例如包含以下的组合物：包含基于 H1亚型的HA的血球凝集素主干域的多肽、及包含基于H7亚型的HA的血球凝集素主干域的 多肽两者。
[0205] 免疫原性组合物优选地另外包含医药学上可接受的载剂。在本发明情形中，术语 "医药学上可接受"意谓载剂在所用剂量及浓度下将不在其所投与的个体中引起不当或有 害作用。这些医药学上可接受的载剂及赋形剂为此项技术中所熟知（参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第 18 版，A. R. Gennaro 编，Mack Publishing Company [1990]； Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer 及 L. Hovgaard 编，Taylor 及 Francis [2000];及 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版，A. Kibbe编，Pharmaceutical Press [2000])。术语"载剂"是指与组合物一起投与 的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。可例如采用盐水溶液及水性右旋糖及甘油溶液作为液体载 齐U，尤其用于可注射溶液。确切配方应适应投药模式。多肽和/或核酸分子优选地以无菌 溶液形式调配并投与。无菌溶液藉由无菌过滤或藉由此项技术中本身已知的其他方法来制 备。溶液可随后冻干或填充至药物剂量容器中。溶液的pH值一般在pH3.0至pH9. 5 (例如 pH5. 0至pH7. 5)的范围内。
[0206] 本发明亦关于在个体中诱导免疫反应的方法，该方法包含投与个体如上所述的多 肽、核酸分子和/或免疫原性组合物。本发明的个体优选地为哺乳动物，其能够受感染性致 病因子（特定言之为流感病毒）感染或可得益于免疫反应的诱导，该个体例如为啮齿动物 (例如小鼠、雪貂或家畜或农畜）、或非人类灵长类动物或人类。个体优选地为人类个体。因 此，本发明提供在利用本文中所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物的个体中诱导对流 感病毒血球凝集素（HA)的免疫反应的方法，该流感病毒血球凝集素（HA)尤其属于第1类 群和/或第2类群A型流感病毒（诸如包含H1、H2、H3、H4、H5、H7和/或H10亚型的HA的 流感病毒）和/或B型流感病毒。在一些实施例中，所诱导的免疫反应有效预防和/或治 疗第1类群和/或第2类群A型流感病毒亚型和/或B型流感病毒引起的流感病毒感染。 在一些实施例中，由本文中所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物诱导的免疫反应有效 预防和/或治疗由A型流感病毒的两种、三种、四种、五种或六种亚型和/或B型流感病毒 引起的A型和/或B型流感病毒感染。
[0207] 由于已熟知较小蛋白质和/或核酸分子并不总是有效诱导强力免疫反应，故可能 有必要藉由添加佐剂来增加多肽和/或核酸分子的免疫原性。在某些实施例中，本文中所 述的免疫原性组合物包含佐剂或与佐剂组合投与。用于与本文中所述的组合物组合投与的 佐剂可在该组合物投与之前、同时或之后投与。适合的佐剂的实例包括：铝盐，诸如氢氧化 铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物（或水包油组合物），包括角鲨烯-水乳液，诸如MF59 (参 见例如W0 90/14837);皂素调配物，诸如QS21及免疫刺激复合物（ISC0MS)(参见例如US 5, 057, 540 ;TO 90/03184 ;TO 96/11711 ;TO 2004/004762 ;TO 2005/002620);细菌或微生物 衍生物，其实例为单磷酰基脂质A (MPL)、3-0-脱酰MPL (3dMPL)、含有CpG基元的寡核苷酸、 ADP核糖基化细菌毒素或其突变体（诸如大肠杆菌不耐热肠毒素 LT、霍乱菌毒素 CT、百日 咳毒素 PT或破伤风类毒素 TT)、基质M(ISC〇n〇va)。此外，可使用已知免疫增强技术，诸如 将本发明的多肽融合至此项技术中已知的蛋白质以增强免疫反应（例如破伤风类毒素、 CRM197、rCTB、细菌鞭毛蛋白或其他）、或在病毒体中包括多肽或其组合。可使用的其他非 限制性实例例如由Coffman等人（2010)揭示。
[0208] 在一实施例中，将本发明的流感血球凝集素主干域多肽并入病毒样粒子（VLP)载 体中。VLP-般包含通常来源于病毒的结构蛋白质的病毒多肽。VLP优选地不能够复制。在 某些实施例中，VLP可能缺乏病毒的完整基因组或包含病毒的基因组的一部分。在一些实 施例中，VLP不能够感染细胞。在一些实施例中，VLP在其表面上表达普通技术人员已知的 病毒（例如病毒表面糖蛋白）或非病毒（例如抗体或蛋白质）靶向部分中的一或多者。
[0209] 在一特定实施例中，本发明的多肽并入病毒体中。含有本发明的多肽的病毒体可 使用普通技术人员已知的技术制造。举例而言，病毒体可藉由以下方式制造：破坏经纯化的 病毒，提取基因组，及将粒子与病毒蛋白质（例如流感血球凝集素主干域多肽）及脂质一起 重新装配以形成含有病毒蛋白质的脂质粒子。
[0210] 本发明亦关于上述多肽、核酸和/或免疫原性组合物，其用于在个体中针对流感 HA诱导免疫反应，尤其用作疫苗。因此，本文中所述的流感血球凝集素主干域多肽、编码这 些多肽的核酸或包含这些核酸或多肽的载体可用于针对流感病毒、例如针对流感病毒血球 凝集素的干区诱生中和抗体。本发明尤其关于如上所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合 物，其在预防和/或治疗由系统发生第1类群和/或第2类群的A型流感病毒和/或B型 流感病毒引起的疾病或病状中用作疫苗。在一实施例中，疫苗可用于预防和/或治疗由系 统发生第1类群和/或第2类群的两种、三种、四种、五种、六种或六种以上不同亚型和/或 B型流感病毒引起的疾病。本发明的多肽可在活体外或在适合的细胞表达系统（包括细菌 及真核细胞）中合成之后使用，或者可藉由表达针对免疫原性多肽编码的核酸而在有需要 的个体中活体内表达。这些核酸疫苗可采用任何形式，包括裸DNA、质体或病毒载体（包括 腺病毒载体）。
[0211] 可使用标准投药途径进行本发明的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物的投 与。非限制性实例包括非经肠投与，诸如静脉内、皮内、经皮、肌肉内、皮下等；或经黏膜 投与，例如鼻内、经口及其类似方式。普通技术人员应能够确定投与本发明的多肽、核酸 分子和/或免疫原性组合物的各种可能性，以便诱导免疫反应。在某些实施例中，多肽、 核酸分子和/或免疫原性组合物（或疫苗）投与一次以上，亦即呈所谓同源初免-加强 (prime-boost)方案形式。在某些实施例中，当不止一次投与多肽、核酸分子和/或免疫原 性组合物时，第二剂量的投与可在以下时间间隔之后进行：例如第一剂量投与之后1周或1 周以上、第一剂量投与之后2周或2周以上、第一剂量投与之后3周或3周以上、第一剂量 投与之后1个月或1个月以上、第一剂量投与之后6周或6周以上、第一剂量投与之后2个 月或2个月以上、第一剂量投与之后3个月或3个月以上、第一剂量投与之后4个月或4个 月以上等，直至多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物的第一剂量投与之后数年。亦可能投 与疫苗大于两次，例如三次、四次等，以便第一次初免投与继之以一次以上加强投与。在其 他实施例中，仅投与一次本发明的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物。
[0212] 多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物亦可在异源初免-加强方案中以初免或加 强形式投与。
[0213] 本发明另外提供在利用本文中所述的多肽、核酸和/或组合物的个体中预防和/ 或治疗流感病毒疾病的方法。如上所述，在一特定实施例中，一种在个体中预防和/或治疗 流感病毒疾病的方法包含投与有需要的个体有效量的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。 治疗有效量是指如本文所定义的多肽、核酸和/或组合物的量，该量有效预防、改善和/或 治疗由第1类群或第2类群A型流感病毒和/或B型流感病毒感染引起的疾病或病状。预 防涵盖抑制或减少流感病毒的传播、或抑制或减少与流感病毒感染有关的一或多种症状的 发作、发生或发展。如本文中所用的改善可指代减少可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或 任何其他可量测的流感感染表达。
[0214] 需要治疗者包括已遭受由经第1类群或第2类群A型流感病毒或B型流感病毒感 染引起的病状者、以及欲预防流感病毒感染者。因此，本发明的多肽、核酸和/或组合物可 投与未处理个体（亦即不患有由流感病毒感染引起的疾病或尚未及当前未经流感病毒感 染感染的个体）或投与早已和/或已经受流感病毒感染的个体。
[0215] 在一实施例中，预防和/或治疗可以容易受到流感病毒感染的患者群体为目标。 这些患者群体包括（但不限于）例如老年人（例如>50岁、>60岁且优选地>65岁）、年 轻人（例如<5岁、< 1岁）、住院治疗的患者及已用抗病毒化合物治疗但显示抗病毒反应 不够的患者。
[0216] 在另一实施例中，多肽、核酸和/或免疫原性组合物可与一或多种其他活性药剂 组合投与个体，这些其他活性药剂诸如为现有或未来的流感疫苗、单克隆抗体和/或抗病 毒剂、和/或抗细菌剂和/或免疫调节剂。一或多种其他活性药剂可有益于治疗和/或预 防流感病毒疾病，或可改善与流感病毒疾病有关的症状或病状。在一些实施例中，一或多种 其他活性药剂为疼痛舒解剂、抗发热药物、或缓和或辅助呼吸的疗法。
[0217] 本发明的多肽和/或核酸分子的给药方案可经调整以提供最佳所需反应（例如治 疗反应）。适合的剂量范围可例如为0. 1毫克/公斤体重至100毫克/公斤体重，优选地 为1毫克/公斤体重至50毫克/公斤体重，优选地为0. 5毫克/公斤体重至15毫克/公 斤体重。欲使用的多肽和/或核酸分子的精确剂量将例如视投药途径及由其引起的感染或 疾病的严重度而定，且应根据医师的判断及各个体的情况来决定。举例而言，有效剂量视以 下而改变：靶部位、患者的生理状态（包括年龄、体重、健康状态）以及治疗为预防性的抑或 治疗性的。患者通常为人类，但亦可治疗非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量 经最佳滴定以使安全性及功效优化。
[0218] 本发明的多肽亦可用于验证鉴别为潜在治疗候选物的单克隆抗体的结合。此外， 本发明的多肽可用作诊断工具，例如藉由在个体的血清中确定是否存在能够结合至本发明 的多肽的抗体来测试该个体的免疫状态。因此，本发明亦关于用于检测患者中存在流感感 染的活体外诊断方法，该方法包含以下步骤：a)使自该患者获得的生物样本与本发明的多 肽接触；及b)检测抗体-抗原复合物的存在。
[0219] 本发明的多肽亦可用于鉴别新的结合分子或改良现有结合分子，诸如单克隆抗体 及抗病毒剂。
[0220] 本发明另外说明于以下实例及图中。实例不意欲以任何方式限制本发明的范围。
[0221] 实例
[0222] 实例1 :鉴别新颖第1类群及第2类群交叉中和抗体：CR9114
[0223] 藉由静脉穿刺在EDTA抗凝血试样管中收集来自正常健康供体的周边血液。 scFv噬菌体呈现文库基本上如W0 2008/028946中所述获得，该专利以引用的方式并 入本文中。针对以下A型流感亚型的重组血球凝集素（HA)进行选择：H1(A/新喀里 多尼亚（New Caledonia)/20/99)、H3(A/ 威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005)、H4(A/ 鸭 / 香港（Hong Kong)/24/1976)、H5 (A/ 鸡 / 越南（Vietnam)/28/2003)、H7 (A/ 荷兰 (Netherlands)/219/2003)及 H9(A/HongKong/1073/99)。进行连续两轮选择，随后分离个 别单链噬菌体抗体。在第二轮选择之后，使用个别大肠杆菌群落来制备单克隆噬菌体抗体。 在ELISA中验证在上述筛检中获得的含有单链噬菌体抗体的所选上清液的特异性，亦即对 不同HA抗原的结合。为此目的，将以下涂布至Maxisorp? ELISA盘：杆状病毒表达的重组 H1(A/新卩客里多尼亚（NewCaledonia)/20/99)、H3(A/威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005)、 H5 (A/ 越南（Vietnam)/1203/04)、H7 (A/ 荷兰（Netherlands)/219/2003)及 B(B/ 0hio/01/2005) HA (Protein Sciences, CT，USA)。在所获得的单链噬菌体抗体中，单链噬 菌体抗体SC09-114展示特异性结合重组A型流感HI、H3、H5、H7及B型流感HA。藉由 FACS分析验证SC09-114的结合及特异性。为此目的，使全长重组A型流感亚型HI (A/ 新喀里多尼亚（New Caledonia)/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)及 H7(A/ 荷兰 (Netherlands) /219/2003) HA表达于PER. C6细胞的表面上。SC09-114展示特异性结合至A 型流感亚型HI、H3及H7 HA。如先前所述克隆scFv的重链及轻链可变区（W0 2008/028946)。 编码人类IgGl重链及轻链的所得表达构建体短暂组合表达于293T细胞中，且使用标准纯 化程序获得及制造含有人类IgGl抗体CR9114的上清液。CR9114的重链及轻链的⑶R的氨 基酸序列在表1中给出。以下给出重链及轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列。
[0224] 实例2 :CR9114的交叉结合反应性
[0225] 在ELISA中验证CR9114的结合特异性，亦即对不同HA抗原的结合。为此 目的，将以下涂布至Maxisorp? ELISA盘：杆状病毒表达的重组H1(A/新喀里多尼亚 (New Caledonia)/20/1999)、H3(A/ 威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005)、H5(A/ 越南 (Vietnam) /1203/04)、H7 (A/ 荷兰（Netherlands) /219/2003)及 H9 (A/HongKong/1073/99) HA (Protein Sciences, CT，USA)。使用无关IgG CR4098作为对照。CR9114展示对所测试的 所有重组HA均具有异源亚型交叉结合活性。参见表2。
[0226] 另外，藉由FACS分析来测试抗体的异源亚型结合。为此目的，使全长重组A型流感 亚型 HI (A/ 新喀里多尼亚（New Caledonia) /20/1999)、H3 (A/Wisonsin/67/2005)及 H7 (A/ 荷兰（Netherlands)/219/2003)HA表达于PER. C6细胞的表面上。将细胞与CR9114-起 培育1小时，随后用PBS+0. 1 % BSA进行三个洗涤步骤。使用PE结合的抗人抗体检测所结 合的抗体。使用未经转染的PER.C6细胞作为对照。CR9114展示对A型流感亚型H1、H3及 H7HA而非野生型PER. C6细胞的交叉结合活性。参见表2。
[0227] 实例3 :CR9114的交叉中和活性
[0228] 为了测定CR9114是否能够阻断多种A型流感病毒株，进行另外的活体外病毒中和 分析（VNA)。在MDCK细胞（ATCC CCL-34)上进行VNA。将MDCK细胞培养于MDCK细胞培养基 (补充以抗生素、20mM Η印es及0· 15% (w/v)碳酸氢钠的MEM培养基（完全MEM培养基）， 补充以10% (v/v)胎牛血清）中。将以下用于分析的病毒株均稀释至5.7X103TCID50/ ml (每毫升50%组织培养感染剂量）的效价，其中效价根据Spearman及Karber的方法计 算：Hl(A/WSN/33、A/ 新喀里多尼亚（New Caledonia)/20/1999、A/ 所罗门群岛（Solomon Islands)/IVR-145 (A/所罗门群岛（Solomon Islands)/3/2006 的高生长性重配株）、A/布 里斯班（Brisbane)/59/2007、A/NYMC/X-181(A/加利福尼亚（California)/07/2009 的高 生长性重配株））、H2 (A/Env/MPU3156/05)、H3 (A/ 香港（Hong Kong) /1/68、A/ 约翰尼斯堡 (Johannesburg)/33/94、A/ 巴拿马（Panama)/2000/1999、A/广岛（Hiroshima)/52/2005、 A/ 威斯康辛州（Wisconsin)/67/2005 及 A/ 布里斯班（Brisbane)/10/2007)、H4(A/WF/ HK/MPA892/06)、H5(PR8-H5N1-HK97(A/ 香港（Hong Kong)/156/97 及 A/PR/8/34 的 6:2 重配株）及 A/ 赤颈鸭 /MPF461/07)、H6 (A/ 赤颈鸭 /MPD411/07)、H7 (NIBRG-60 (A/ 绿 头鸭 / 荷兰（Netherlands)/12/2000 的 6:2 重配株）及 PR8-H7N7-NY(A/ 纽约（New York) /107/2003 (H7N7)及 A/PR/8/34 的 7:1 重配株））、H8 (A/ 赤颈鸭 /MPH571/08)、H9 (A/ 香港（Hong Kong) /1073/99 及 A/ 鸡 /HK/SSP176/09)、H10 (A/ 鸡 / 德国（Germany) /N/49)及 H14(PR8-H14N5 (A/ 绿头鸭 / 阿斯特拉罕（Astrakhan)/263/1982 (H14N5)及 A/PR/8/34 的 6:2重配株））。在一式四份孔中在完全MEM培养基中连续2倍稀释（1:2至1:512) IgG制备 物（200 μ g/ml)。将25 μ 1各别IgG稀释液与25 μ 1病毒悬浮液（100TCID50/25 μ 1)混合， 且在37°C下培育1小时。随后将悬浮液一式四份地转移至含有汇合MDCK培养物于50 μ 1 完全MEM培养基中的96孔盘上。使用前，MDCK细胞以3Χ 104个细胞/孔接种于MDCK细胞 培养基中，生长直至细胞已达至汇合为止，用300μ 1至350μ 1 PBS(pH7.4)洗涤，且最后向 各孔中添加50 μ 1完全MEM培养基。在37°C下将所接种的细胞培养3至4天，且每日观察 细胞病变作用（CPE)的发展。将CPE与阳性对照比较。
[0229] CR9114展示对所有测试的A型流感亚型HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9及H10 病毒的代表病毒株均具有异源亚型交叉中和活性。参见表3。
[0230] 实例4 :某于H1HA设计包含CR6261及CR9114的保守主干域抗原决定基的主干域 多肽
[0231] 先前已鉴别针对流感病毒血球凝集素的具有广泛交叉中和效能的完全人类单克 隆抗体。CR6261 (如W0 2008/028946中所述）展示具有针对系统发生第1类群的A型流 感病毒的广泛交叉中和活性。此外，上述CR9114已显示能够结合及中和系统发生第1类群 及第2类群两者的A型流感病毒以及B型流感病毒。功能及结构分析已揭示此等抗体干扰 膜融合过程且针对流感HA蛋白的主干域中的高度保守抗原决定基（Throsby等人（2008); Ekiert 等人（2009) ;W0 2008/028946 ;及共同待决申请号 EP11173953. 8)。
[0232] 在引向本发明的研究中，设计了包含含有此等抗原决定基的HA的主干域的新颖 分子，以便建立基于通用抗原决定基的免疫原性多肽，这些多肽可例如用作针对广泛范围 流感病毒株诱发保护的疫苗。基本上，首先自全长HA分子中移除高度易变且免疫显性的部 分（亦即头部域），以产生HA主干域多肽（亦称为"微型HA"）。以此方式，免疫反应将对 定位有针对广泛中和抗体的抗原决定基的主干域重定向。抗体CR6261及CR9114用于探查 新建分子的正确折叠，并用于证实存在中和抗原决定基。
[0233] 因此，本发明的多肽在膜远程头部域中存在的显性抗原决定基不存在的情况下， 向免疫系统呈现膜近端主干域HA分子的保守抗原决定基。为此，移除构成头部域的ΗΑ0蛋 白的一级序列的一部分，且直接再连接或藉由引入较短柔性连接序列（'连接子'）来再连 接，以恢复多肽链的连续性。所得序列藉由引入特定突变来进一步修饰，这些突变使ΗΑ0分 子的剩余部分的天然3维结构稳定。
[0234] 病毒中HA分子的功能为结合至细胞表面受体唾液酸，及在吸收于内体中之后，介 导病毒与内体膜的融合，引起病毒RNA释放至细胞中。融合过程中的基本步骤为HA分子的 较大构象变化，该构象变化使分子的二级结构组件重排以使融合肽暴露。因此，HA分子存在 的两种构象（融合前及融合后）在其三级结构方面极其不同。由于病毒HA蛋白质主要以 融合前状态暴露于免疫系统，故重要的是确保本发明的多肽采用此构象。此要求可藉由使 融合前构象稳定且同时使融合后构象不稳定来满足。由于融合前构象为介稳态且采用融合 后构象可产生稳定构象（亦即能量最低）（Chen等人，1995)，故需要此稳定/去稳定作用。
[0235] 在此实例中，采用来自 H1N1A/ 布里斯班（Brisbane)/59/2007 的 HA(SEQ ID NO: 1) 作为一级（或野生型）序列来建立本发明的多肽。
[0236] 在第一步骤中，本发明的多肽的构建法是移除在位置59与291之间的HA1序列 (编号参考ΗΑ0序列中的位置，如SEQ ID NO: 1中所示。在某些实施例中，HA1部分包含氨基 酸18至343,且HA2部分包含氨基酸残基344至565 ;由于SEQ ID NO: 1包含信号肽，故HA1 部分起始于位置18)。此结果为移除ΗΑ0的残基60至290。此等残基被GGGG连接序列置 换。接着，藉助于Brugel计算融合前及融合后构象中各残基的可利用表面积（Delhaise等 人，1984)。如Samantha等人（2002)中所述，测定各残基的暴露及隐藏程度，其中着重于在 融合前构象中暴露且在融合后构象中隐藏的残基。此等残基的进一步分析指示一些此等氨 基酸残基可依一定方式突变，该方式使得突变不会影响融合前构象，但会使融合后构象不 稳定。此等残基通常具有疏水性侧链且参与形成融合后构象中的卷曲螺旋。使此等氨基酸 残基突变成亲水性氨基酸将扰乱卷曲螺旋性质（卷曲螺旋中螺旋之间的接触通常为疏水 性），且因此使融合后构象不稳定。
[0237] 依据此推断，在序列的HA2部分中引入一些突变：Phe 406突变成Ser(F406S)、Val 409 突变成 Thr (V409T)、Leu 416 突变成 Ser (L416S)及 Tyr502 突变成 Ser (Y502S)。此等突 变为自HA表面移除疏水性残基的突变。应注意到L416突变成S或T时亦引入共同N-糖基 化位点（共同序列为NX(S/T))。此位置处的糖基化将进一步增强此区域的溶解度。此外， Leu58 突变成 Thr(L58T)、Val 314 突变成 Thr(V314T)且 lie 316 突变成 Thr(I316T);此等 突变均在HA1域中，亦即对应于在天然ΗΑ0链裂解后的HA1的序列部分。后两个突变维持 侧链的β分支，但自表面移除疏水性残基。如以下将展示，将一些此等突变引入所有变异 体中，在各别多肽中测试其他此等突变，以研究这些突变是否以不合需要的方式彼此影响。
[0238] 为了增强多肽的稳定性，研究两个二硫桥键以将ΗΑ锁定为融合前构象。二硫桥键 形成于在空间上彼此相隔适当距离（在全长ΗΑ分子中）的残基之间，且这些残基使其已在 正确位置处的C-β原子形成二硫桥键。所提出的第一二硫桥键是在位置321 (ΗΑ1域）与 位置405 (ΗΑ2域）之间。在ΗΑ2域内，二硫桥键产生于位置413与421之间。
[0239] 由于在位置R343处裂解ΗΑ为构象变化能够进行的基本步骤，故在本发明的多肽 中，藉由引入Arg(R)至Gln(Q)的突变来移除裂解位点。本发明的另一解决方案为将Arg 变为Gin且使残基345至350 (HA2的融合肽的一小部分）缺失。此等（疏水性）序列的移 除将使多肤进一步稳定。
[0240] 在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例 中，移除 HA2 的位置 523、524、525、526、526、527、528、529 或 530(或其等效位置）至 HA2 的C端（编号根据SEQ ID NO: 1)的细胞质序列及跨膜序列，以便在表达于细胞中之后制 造可用于例如疫苗的分泌型（可溶性）多肽。藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦 即AYVRKDGEWVLL(SEQIDN0 :143)，任选地经由连接子连接，使可溶性多肽进一步稳定。连 接子可任选地含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进 可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子（例如EGR)连接的his标记 (HHHHHHH)。在一些实施例中，在不存在折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。 根据本发明，HA2域的位置530 (编号根据SEQ ID NO: 1)至C端氨基酸的氨基酸序列可经移 除并置换为以下序列：EGRHHHHHHH(SEQ ID N0:81)，包含较短连接子及his标记；或SGRSLV PRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID N0:82)，包含凝血酶裂解位点、三 聚域及his标记。
[0241] 将上述突变根据其功能及在HA干多肽的3维结构中的位置集合成聚簇。所有多 肽均含有HI HA序列1至59及291至565及R343Q突变，具有以下其他突变：L58T、V314T、 I316T、F406S、V409T、L416S(SEQ IDN0:3 ;命名为聚簇1)。此外，制得具有其他突变的变异 体：
[0242] 聚簇 2 :K321C、Q405C(SEQ ID N0:4)
[0243] 聚簇 3 :F41：3C、E421C(SEQ ID NO:5)
[0244] 聚簇 4 :HA2Y5〇2S (SEQ ID NO:6)
[0245] 另外，制得含有聚簇1序列且此外含有聚簇2及3(SEQ ID NO:7)或聚簇2、3及 4(SEQIDN0:8)的突变的两种变异体。
[0246] 合成编码上述蛋白质序列的基因，且使用普通技术人员一般已知的方法克隆至 表达载体PCDNA2004中。出于比较的原因，将全长序列（SEQIDN0:1)以及由Steel等 人（2010)描述的序列（Hl-PR8-dHl ;SEQIDN0:24，其是基于HlNlA/波多黎各（Puerto Rico)/8/1934序列）包括于实验中。
[0247] 使用40 μ 1 293 transfectin作为转染试剂用表达载体（1 μ g/ml)转染 HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞（106个细胞/毫升，30ml)，且允许再增殖2天。收集细胞， 等分试样（〇. 3ml，约3X 105个细胞），且将等分试样以针对HI HA产生的多克隆血清处理以 探查表达或以HA特异性单克隆抗体（5微克/毫升）及用于染色的二级抗体处理。随后， 使用针对H1HA产生的多克隆血清，针对膜连接的本发明的HA主干域多肽的表达，藉由荧光 结合细胞分选（FACS)分析细胞以探查表达。将具有结合全长蛋白质的已知特异性的单克 隆抗体小组（例如CR6261及CR9114)用于探查保守抗原决定基的存在，且根据推理探查全 长HA及本发明的微型HA多肽的正确折叠。结果表示为阳性细胞百分比及平均荧光强度， 且展示于图2中。
[0248] 结果展示所有构建体均表达于细胞表面上，因为与对于未经转染的细胞的约4% 相比，与多克隆血清（抗H1多克隆）的反应引起所分析的全部细胞的75%或75%以上为 阳性。此结果由平均荧光强度（MFI)的值证实，这些值对于以多克隆血清处理之后的所有 构建体而言为类似的。不存在IgG、仅使用经标记的抗人IgG或不相关单抗的对照实验均 为阴性的。A/布里斯班（Brisbane)/59/2007及A/波多黎各（Puerto Rico)/8/1934全长 HA蛋白质均由单克隆抗体CR6261、CR6254、CR6328(均已知结合并中和HI HA ;Throsby等 人（2008) ;TO 2008/028946)、CR9114(上述）、CR8001(结合至 H1HA，但不中和 HI;描述于 TO 2010/130636中）而非CR8057 (仅结合至某些H3病毒株，亦描述于W0 2010/130636中） 及 CR6307(Throsby 等人（2008) ;TO 2008/028946)识别。
[0249] 考虑CR6261抗原决定基的不连续性及构象特征（Ekiert等人2009)，推断出两 种全长蛋白质均以其天然3维构象形式存在。对于在此实验中测试的新设计的本发明多 肽而言，观察到由单克隆抗体小组识别的相同模式：由CR6261、CR6254、CR6328、CR9114及 CR8001而非CR6307及CR8057结合。此现象在阳性细胞百分比的数据中最明显，但亦在平 均荧光强度数据中观察到。就细胞阳性％以及平均荧光强度而言，均在微型HA-聚簇1的 情况下获得最佳结果。
[0250] 添加其他修饰，诸如上述二硫桥键（聚簇2及3)及聚簇4的Y502S突变或此等 突变的组合，引起阳性细胞百分比降低及平均强度降低。此实验中所用的任何抗体均未在 背景水平以上识别含有头部域缺失但缺乏其他修饰的由Steel等人（2010)描述的构建体 (SEQ ID N0:24)。因此，推断出在DNA转染之后，此蛋白未以其在HA中具有的天然3维构象 形式展示。
[0251] 上述结果预示聚簇1突变的重要性，这些聚簇1突变增强环的亲水性特征，该环 由HA分子的连接A螺旋及较长骨架螺旋（⑶）的残基402至418及周围区域形成。为了 进一步确定聚簇1突变对本发明的多肽的稳定性及折叠的有益作用，在另一实验中比较微 型HA(SEQ ID N0:2 ;根据Steel的多肽，但基于A/布里斯班（Brisbane))及微型祖_聚簇 1(本发明的多肽；SEQIDN0:3)(图3)。
[0252] 尽管约60%经微型撤-聚簇1转染的细胞在结合〇?6261、〇?6254、〇?6328及 CR9114之后为阳性，但用微型HA (根据Steel的多肽，但基于A/布里斯班（Brisbane) ;SEQ ID NO:2)转染引起极接近于背景水平的值（1 %至3% )。我们推断出聚簇1的突变与缺乏 此等突变的未经修饰的微型HA蛋白（SEQ ID N0:2)相比，有利地促进本发明的多肽的正确 折叠及稳定性。
[0253] Steel等人藉由以下方式建立一种新的分子：使HI A/波多黎各（Puerto Rico)/8/1934及H3 HK68病毒株的HA1的氨基酸残基53至276自一级序列中缺失，且用较 短柔性连接子置换此缺失。如此实例中所示，此举产生高度不稳定的分子，该分子并未调整 正确构象，如由先前展示结合至干区中的保守抗原决定基的抗体不发生结合所证实。不正 确折叠由较大区域的溶剂暴露引起，该较大区域通常由全长HA分子中的球状头部遮蔽。由 于此区域本质为疏水性的，故分子不再稳定且因此必需改适。
[0254] 如已在本发明多肽中进行的疏水性残基调换为亲水性残基抵消此作用且使HA主 干域多肽稳定。藉由以下方式来达成主干域的天然3维折叠的进一步稳定：在适当位置处 引入二硫桥键，以使在天然三级结构中空间上接近但在一级结构中分离的残基紧密连接。
[0255] 实例5 :卖例4的HA主干域多肽的免疫原性
[0256] 为了评估主干域多肽的免疫原性，用编码以下的表达载体对小鼠进行免疫：来自 A/ 布里斯班（Brisbane)/59/2007 的全长 HI (SEQ ID NO: 1)、微型 HA-聚簇 1 (SEQ ID N0:3)、 微型HA-聚簇1+2 (SEQ ID NO:4)及微型HA-聚簇1+4 (SEQ ID NO:6)。出于比较的原因，亦将 由Steel等人（2010)设计的微型HA (微型PR8 ;SEQ ID NO: 24)及来自A/波多黎各（Puerto Rico)/8/1934的相应全长蛋白质HA包括于实验中。亦包括编码cM2的表达载体作为阴性 对照。
[0257] 在第1天、第21天及第42天用50 μ g构建体+50 μ g佐剂（pUMCVl-GM-CSF)对4 只小鼠（BALB\c)的组进行肌肉内免疫。在第49天，进行最终取血且收集血清。藉由FACS 分析来分析血清。使用40微升293transfectin作为转染试剂用表达载体（1微克/毫升） 转染HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞（10 6个细胞/毫升，30ml)，且允许再增殖2天。收集 细胞，等分试样（〇. 3ml，约3X 105个细胞），且将等分试样以构建体特异性血清处理，用二 级抗体染色且藉由荧光结合细胞分选进行分析。结果展示于图4中。
[0258] 正如所料，如由阳性细胞％及MFI表明，cM2特异性血清（阴性对照）识别cM2， 但全长HA或主干域多肽中没有一者识别cM2。相比之下，全长HA特异性血清染色表达相 应全长HA(SEQ ID N0:1)的细胞，而且染色表达微型HA-聚簇1(SEQ ID勵:3)、微型撤-聚 簇1+2 (SEQ ID NO: 4)及微型HA-聚簇1+4 (SEQ ID NO: 6)的细胞，但在较低水平下（约40% 阳性细胞相对于针对全长的约80%，MFI约1000相对于针对全长的约7000)。反过来亦是 正确的：对微型HA-聚簇1(SEQ IDN0:3)、微型HA-聚簇1+2(SEQ IDN0:4)及微型HA-聚簇 1+4 (SEQ ID N0:6)具有特异性的血清识别表达相应构建体以及全长HA(SEQ ID NO: 1)的细 胞。结果概述于下表4中。
[0259] 与上述针对微型拟-聚簇1彼〇10勵:3)、微型拟-聚簇1+2彼〇10勵:4)及微 型HA-聚簇1+4 (SEQ ID N0:6)的结果对比，自经全长PR8免疫的小鼠获得的血清并未很好 地结合至经Hl-PR8-dHl (SEQ ID N0:24)转染的细胞。与针对微型HA-聚簇1 (SEQ ID N0:3) 及微型HA-聚簇1+2(SEQ ID N0:4)的40%至50%相比，细胞阳性百分比为约20%。在所 观察的几乎不在背景水平以上的平均荧光强度中亦反映该结果。
[0260] 总之，数据展示本发明的多肽能够诱导针对全长HA的免疫反应。特定言之，在残 基402与418 (编号根据SEQ ID NO: 1)之间的区域中的修饰对建立稳定分子很重要。
[0261] 实例6 :制各第二代丰干域多狀
[0262] 实例4中所述的主干域多肽的平均荧光强度在所有情况下均低于针对相应全长 蛋白质所观察到的平均荧光强度；实际上，最佳设计微型HA-聚簇1(SEQIDN0:3)在与单克 隆抗体结合之后具有全长构建体的约10%平均强度的强度。由此指示细胞表面上主干域多 肽的表达和/或折叠低于针对全长蛋白质所观察到的表达和/或折叠，且可进一步改良设 计。自第一代获得的结果展示改良第一代构建体为可能的且因此启动第二轮设计。
[0263] 实例4中所述的多肽是基于ΗΑ0链的相同缺失，亦即残基L60至K290(微型1 ;编 号参考来自Η1Ν1 Α/布里斯班（Brisbane)/59/2007的全长ΗΑ0中的位置；SEQ ID NO: 1)。此 方法产生现不再连接于头部域的较长非结构化环。推断此环并不有助于整体蛋白稳定性， 且可在不影响多肽的其他部分折叠的情况下大大缩短。设计三种其他缺失，且用如前所述 的GGGG连接子序列置换且与上述聚簇1的突变组合。缺失为S53至P320 (微型2)、H54至 1302 (微型3)、G56至G317 (微型4)。引入与上述聚簇1 一致的其他修饰（L58T、V314T、 I316T、F406S、V409T、L416S)。属于此聚簇的一些残基为所缺失的序列的一部分，且因此可 不再经修饰（参见下文）。此外，在于融合前状态中形成三聚卷曲螺旋的较长螺旋C中建 立两种其他突变。此项技术中熟知三聚卷曲螺旋利用在七价重复序列的位置420 a及d处 的lie稳定，该七价重复序列为此结构基元的标志（Suzuki等人，（2005) ;Woolfson等人 (2005))。藉由在位置420(M420I)及427(V427I)处引入lie来应用此知识。此两种突变 与聚簇1的突变的组合指定为聚簇11 ;为了阐明，以下列出组合：
[0264]
【权利要求】
1. 一种流感血球凝集素主干域多肽，其包含（a)流感血球凝集素 HA1域，该流感血球凝 集素 HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段的 HA1N端主干区段；及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中该血球凝集素主干域多肽在HA1与 HA2之间的接合点处可抵抗蛋白酶裂解，且其中连接HA2的A螺旋与螺旋CD的氨基酸序列 中的一或多个氨基酸与野生型流感HA2域相比已突变，且其中该HA1域及该HA2域来源于 选自由以下组成的组的A型流感病毒亚型：HI、H5及H3。
2. 如权利要求1所述的多肽，其中该多肽不包含全长HA1域。
3. 如权利要求1或2所述的多肽，其中该多肽经糖基化。
4. 如权利要求1、2或3所述的多肽，其包含（a)HAlN端区段，该HA1N端区段包含HA1 的氨基酸1至X，利用具有〇至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段， 该HA1C端主干区段包含HA1的氨基酸y至末端，及（b)流感血球凝集素 HA2域。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中该多肽包含流感血球凝集素 HA1和/ 或HA2域，该流感血球凝集素 HA1和/或HA2域是基于来自包含H1亚型的HA的A型流感 病毒的流感血球凝集素，且其中X = 46与60之间的任何氨基酸且y = 290与325之间的 任何氨基酸。
6. 如权利要求5所述的多肽，其中该多肽包含流感血球凝集素 HA1和/或HA2域，该流 感血球凝集素 HA1和/或HA2域是基于来自包含H1亚型的HA的A型流感病毒的流感血球 凝集素，该H1亚型选自由表7的A型流感病毒组成的组。
7. 如权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中该多肽包含流感血球凝集素 HA1和/ 或HA2域，该流感血球凝集素 HA1和/或HA2域是基于来自包含H3亚型的HA的A型流感 病毒的流感血球凝集素，且其中X = 56与69之间的任何氨基酸，且其中y = 292与325之 间的任何氨基酸。
8. 如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该HA1C端主干区段的C端氨基酸残基为 除精氨酸（R)或赖氨酸（K)以外的任何氨基酸，优选地为谷氨酰胺（Q)。
9. 如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽在该HA1域和/或该HA2域中包 含一或多个其他突变。
10. 如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽包含一或多个二硫桥键。
11. 如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽不包含信号序列。
12. 如权利要求11所述的多肽，其包含HA1N端区段，该HA1N端区段包含HA1的氨基酸 P至X，利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段，该HA1C端 主干区段包含HA1的氨基酸y至末端，及（b)流感血球凝集素 HA2域，其中p =成熟HA的 第一个氨基酸。
13. 如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽不包含HA的细胞内及跨膜序 列。
14. 如权利要求13所述的多肽，其中该多肽不包含流感H1HA2域的C端部分，该C端部 分跨越 H1HA2 的氨基酸残基 520、521、522、523、524、525、526、527、528、529 或 530 至 C 端氨 基酸。
15. 如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽选择性结合至抗体CR6261和/ 或CR9114,且不结合至抗体CR8057。
16. 如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽选择性结合至抗体CR8020、 CR843和/或CR9114,且不结合至抗体CR8057。
17. -种提供流感血球凝集素主干域多肽的方法，该方法包含以下步骤： (a) 提供流感HAO氨基酸序列； (b) 移除HA1与HA2之间的裂解位点； (c) 自该HAO序列中移除球状头部域的氨基酸序列； (d) 在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列中引入一或多个突 变；及 (e) 在该HA主干域多肽中引入一或多个二硫桥键。
18. -种流感血球凝集素主干域多肽，其可利用如权利要求17所述的方法获得。
19. 一种核酸，其编码如权利要求1至16中任一项所述的多肽。
20. -种免疫原性组合物，其包含如权利要求1至16中任一项所述的多肽和/或如权 利要求19所述的核酸分子。
21. 如权利要求1至16中任一项的多肽、如权利要求19所述的核酸和/或如权利要求 20所述的免疫原性组合物，其用作药物，尤其用作疫苗。
【文档编号】C07K14/005GK104066446SQ201280067834
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年11月27日 优先权日:2011年11月28日
【发明者】J·W·梅博阁, A·因帕利亚佐, R·福格尔斯, R·H·E·弗里森, P·阿拉尔, S·洛夫里克斯, K·拉多塞维奇 申请人:克鲁塞尔荷兰公司