专利名称：一种利拉鲁肽的固相合成方法
技术领域：
本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及合成利拉鲁肽的方法。
背景技术：
II型糖尿病是一种常见的慢性疾病，目前常用的口服治疗药物包括:双胍类、磺脲类、a-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类，DPP-4抑制剂等。对于口服降糖药效果不好的患者，常采用联合胰岛素治疗。由于目前的治疗方案大多侧重于对血糖的控制，而忽略了对胰岛功能的保护，多数患者最终会出现P细胞功能严重衰退，机体胰岛素敏感性逐渐下降，无论采用饮食控制、二甲双胍还是磺脲类药物，对P细胞受损速度均无影响。利拉鲁肽属于新型降糖药GLP-1类似物，多项试验证明此类药物可以刺激胰岛P细胞的增殖、分化及抑制凋亡作用，这就意味着糖尿病的病情得到明显缓解，是II型糖尿病治疗领域的一个革命性的突破。利拉鲁肽是根据天然的GLP-1 (7-37)序列合成的药物，其氨基酸序列为:His_Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys*(gGlu_掠桐酸)_Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val_Arg-Gly-Arg-Gly。与 GLP-1 有 95% 的同源性，保留了 GLP-1 (7-37)的生物活性，其分子结构与天然GLP-1分子不同的是第34位赖氨酸被精氨酸取代，第26位赖氨酸上增加一个由g谷氨酸连接的16碳棕榈酰脂肪酸侧链，使其在体内与血浆白蛋白结合后形成可逆的药物-白蛋白复合体，复合体不易被降解，还可以缓慢释放药物使分布时间延长，克服了天然GLP-1 (7-37)易降解的缺点，半衰期达到13小时。利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司研制，其母链是利用基因重组技术生产，再侧链缩合谷氨酸和棕榈酸。2010年I月25日美国食品与药物管理局批准利拉鲁肽在美国上市。2011年10月9日在我国上市。诺和诺德公司制备利拉鲁肽的方法技术难度大，成本及设备要求高，US6458924B2和US6268343B1报道的合成方法中间体需要用液相纯化，步骤繁琐副反应多，并且产生的废液不好处理，试剂使用成本也高。国内报道的利拉鲁肽固相合成专利方法(CN102286092) 26位赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH,而选择性脱除Alloc需要重金属催化剂Pd(Ph3P)4，一般需要氮气保护下反应，在工业上生产会受到限制。本发明26位赖氨酸采用Fmoc-Lys (Mtt) -OH或Fmoc-Lys (Mmt) -OH, Mtt/Mmt的选择性保护只需要l%TFA/5%Tis在DCM中，简单易行，工业化生产也不受限制。本发明侧链的缩合采用简单易行的Fmoc-Glu-OtBu和棕榈酸的分步缩合得到利拉鲁肽，而CN102286092专利方法采用特殊的Palmiyoyl-Glu-OtBu试剂缩合侧链。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反应步骤简单、所用试剂单一、条件温和、收率高成本低、能实现工业化生产的固相合成工艺，解决现有工艺的一些问题。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案:一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤:
I)选择Fmoc-Gly-Wang树脂,利用N端具有Fmoc保护和侧链保护的氨基酸为原料，按照利拉鲁肽直链的氨基酸序列从第二个精氨酸开始到第31个组氨酸逐步偶联。26位上的赖氨酸采用的是Fmoc-Lys (Mtt) -OH或Fmoc-Lys (Mmt) -OH, N-末端的组氨酸采用的是Boc-His(Trt)-OH 或 Boc-His(Boc)-0H。2) 1%TFA选择脱除赖氨酸上的Mtt/Mmt保护基。3)侧链上依次偶联一个g_谷氨酸和棕榈酸。4) TFA切割树脂得到利拉鲁肽粗品，制备型液相纯化、冻干得到纯品。作为本发明的进一步改进，所述步骤I)中，所述的固相载体树脂为取代度
0.1-1.0mmol/I,的 Fmoc-Gly-Wang 树脂。所有的 Fmoc 保护氨基酸为:Fmoc_Arg(Pbf)-OH ；Fmoc-Val-OH ；Fmoc-Gly-0H ;Fmoc-Leu_0H ；Fmoc-Trp (Boc) -OH ； Fmoc-Glu (OtBu) -OH ；Fmoc-Lys(Mtt) -OH ;Fmoc_Gln(Trt)-OH ；Fmoc-Tyr(tBu)-OH ； Fmoc-Ser(tBu)-OH ；Fmoc-Asp(OtBu)-OH ； Fmoc-Thr(tBu) -OH ;Boc_His(Trt)-OH ;Boc_His (Boc)-OH ;Fmoc-1le-OH ；Fmoc-Phe-0H ；Fmoc-Glu-a -OtBu ;Fmoc_Ala-0Ho Fmoc-Gly-Wang0作为本发明的进一步改进，逐一偶联采用的缩合剂是HOBt/DIC或Cl-HOBt/DIC，缩合溶剂为DMF。Fmoc的脱保护试剂为25%哌啶/DMF溶液。作为本发明的进一步改进，所述步骤I)中具体步骤为:25%哌啶/DMF溶液洗脱Fmoc-Gly-Wang树脂的Fmoc保护基,加入缩合剂和Fmoc-Arg(Pbf)-OH室温反应。重复脱Fmoc保护基、缩合、洗涤步骤至N-端His，His的Boc保护基留在树脂上。
作为本发明的进一步改进，所述步骤2)中脱除Lys20上的Mtt或Mmt保护基所采用的切割试剂A的组成为:TFA ImL ；Tis 5 mL ；DCM 96 mL。室温振荡反应5次，每次5min，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗2次，抽干。作为本发明的进一步改进，所述步骤3)侧链上偶联一个由谷氨酸介导的棕榈酸:加入的原料是Fmoc-Glu- a -OtBu,缩合剂偶联后，25%哌啶/DMF溶液脱Fmoc 2次，抽干，洗涤，加入10倍量棕榈酸/HOBt/DIC反应5小时，洗涤抽干。作为本发明的进一步改进，所述步骤4)切割树脂(0.5-1克):加入切割试剂TFA9mL ;苯甲醚0.25mL ;苯酚0.25g ；Tis 0.25mL ;水0.25mL室温反应2小时后取滤液，无水乙醚沉淀得粗品，半制备型高效液相梯度洗脱，收集产物峰，冷冻干燥得到纯品。与现有技术相比，本合成方法步骤简单，试剂使用种类和数量都较少，合成周期短且副产物少，利于工业化生产。
图1为利拉鲁肽固相合成流程图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。Fmoc保护氨基酸、棕榈酸及Fmoc-Gly-Wang树脂均购自上海吉尔生化有限公司。说明书和权力要求书所使用的英文缩写的含义见下表。
权利要求
1.一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤: 选择Fmoc-Gly-Wang树脂,利用N端具有Fmoc保护和侧链保护的氨基酸为原料,按照利拉鲁肽直链的氨基酸序列从第二个精氨酸开始到第31个组氨酸逐步固相偶联氨基酸；26位上的赖氨酸采用的是Fmoc-Lys (Mtt) -OH或Fmoc-Lys (Mmt) -OH, N-末端的组氨酸采用的是 Boc-His (Trt) -OH 或 Boc-His (Boc) -OH ； 1%TFA选择性脱除26位赖氨酸上的Mtt或Mmt保护基； 侧链上依次偶联g_谷氨酸和棕榈酸； TFA切割树脂得到利拉鲁肽粗品，制备型液相纯化、冻干得到纯品。
2.按权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于:所述步骤I)中所述的固相载体树脂为取代度0.1-1.0mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂。
3.按权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于:所述步骤I)中所述26位上的赖氨酸采用的是Fmoc-Lys (Mtt) -OH或Fmoc-Lys (Mmt) -OH, N-末端的组氨酸采用的是Boc-His(Trt)-OH 或 Boc-His(Boc)-0H。
4.按权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于:所述步骤I)中所述逐一偶联采用的缩合剂是HOBt/DIC或Cl-HOBt/DIC ;每步的脱保护试剂为25%哌啶/DMF溶液。
5.按权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中所述脱除赖氨酸上的Mtt/Mmt保护基采用的脱保护试剂为l%TFA/5%Tis/DCM。
6.按权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中所述侧链上偶联g-谷氨酸为Fmoc-Glu-OtBu。
7.按权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中所述加入切割树脂剂为:90%TFA/2.5%苯甲醚/2.5%苯酚/2.5%Tis/2.5%水。
8.按权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中所述制备型液相纯化利拉鲁肽采用流动相A:乙腈(含0.1%TFA);流动相B:水(含0.1%TFA)，粗肽溶解于醋酸:乙腈:水(3:3:4)中，梯度洗脱；波长:220nm ;收集产物峰，冷冻干燥得到纯品。
全文摘要
本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，包括步骤如下1)选择Fmoc-Gly-Wang树脂，N端Fmoc保护和侧链保护的氨基酸为原料，其中26位上的赖氨酸采用的是Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH，N-末端的组氨酸采用的是Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH。2)1%TFA选择性脱除赖氨酸上的Mtt或Mmt保护基。3)侧链上依次偶联一个g-谷氨酸和棕榈酸。4)TFA切割树脂得到利拉鲁肽粗品，制备型液相纯化、冻干得到纯品。本发明采取的合成利拉鲁肽的方法步骤简单，省时省力，偶联过程中的困难序列少，侧链脱保护简单易行，副产物少，收率高，适合工业化生产。
文档编号C07K1/06GK103087181SQ20131001676
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者刘卫, 杨树耀 申请人:刘卫, 杨树耀