一种新的制备肝实质细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种新的制备肝实质细胞的方法。通过在体细胞中过表达若干个转录因子，将已经分化的体细胞在体外诱导成了具有功能的肝实质细胞。所述细胞具有典型的上皮细胞形态，表达肝脏基因，并获得了多种肝实质细胞的功能。所述细胞可在肝脏中增殖，并重建肝脏功能。
【专利说明】-种新的制备肝实质细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及一种新的制备肝实质细胞的方法。
【背景技术】
[0002]肝脏是人体最重要的器官之一，调控着多种生理功能。肝脏本身具有很强的再生能力，但是在罹患各种肝脏疾病，包括肝炎，肝纤维化，肝癌，肝脏代谢疾病和肝功能衰竭时，肝脏逐渐失去再生能力，从而导致其生理功能的下降，最终危害着人们健康和生命。由于饮食、环境和遗传等因素的影响，中国是世界上终末期肝病和急性肝衰竭发病人数最多的国家。
[0003]对于终末期肝病以及急性肝衰竭的治疗，目前唯一有效手段是进行肝脏移植。但是由于肝脏供体紧缺以及术后免疫系统对异体器官的排斥，移植手术的发展受到了严重的制约。最近基于肝细胞移植的技术受到广泛的关注。其中一个在临床上已经使用的方法是将供体肝脏消化后得到的肝细胞移植入病人，从而使得一个供体器官可以治疗若干个病人。然而该方法仍旧依赖于捐献的供体器官，并且不能改变移植后的免疫排斥。此外，体外培养的肝细胞还是一个非常好的药物肝脏代谢模型，被制药公司大量使用在药物开发早期检测代谢毒性实验中。因此如何获得稳定而大量的肝细胞来源，成为目前最迫切的需要。随着对干细胞研究的深入和新技术的突破，利用干细胞或其他细胞来分化获得肝细胞被普遍认为是未来的发展方向 。从干细胞获得肝脏细胞主要有以下的一些方法:
[0004]方法一、从人胚胎干细胞(hES细胞)定向分化成肝细胞。最近的研究包括中国科学家在内的工作已经表明，在使用特定的培养基和细胞因子的条件下，hES细胞可以被定向的分化成具有肝细胞功能的细胞。并且利用这些分化的肝细胞，在动物实验也已经验证这些细胞在体内可以表现出功能。
[0005]方法二、利用来源于脐带中分离的间充质干细胞来获得肝细胞。现有的证据表明分离纯化的脐带间充质干细胞可以在体外分化成非常接近肝细胞的细胞，并且脐带间充质干细胞到注射肝脏内后可以分化表达许多肝细胞特异的功能蛋白。中国的科学家也发现用脐带间充质干细胞可以改善晚期肝硬化病人的肝功能。这些研究工作都指出脐带间充质干细胞极有可能是在体外大量获得肝细胞的另一个来源。
[0006]方法三、上述的方法都受到了取材的限制，特别是ES细胞的获得存在很大的伦理道德问题。此外这些干细胞并非来自病人自身，因而由其分化而来的肝细胞还是不能避免移植后免疫排斥的问题。因此有人提出用人类iPS全能干细胞定向分化成为肝细胞。将病人自身终末分化细胞诱导为iPS全能干细胞，再定向分化iPS全能干细胞为有肝细胞功能的细胞。目前中国和美国的科学家已经报道成功的把人类iPS细胞定向分化成了具有肝脏功能的细胞。
[0007]但是无论由ES干细胞，iPS干细胞还是脐带干细胞定向分化获得细胞，都不可能达到完全分化的效率，所以总有少量的干细胞存在于分化的细胞中。这些残存的干细胞注射入动物体内后可以形成畸胎瘤和腺瘤，因此严重影响了这些细胞的应用。最近的研究表明，B淋巴细胞可以在体外直接转变为巨噬细胞，另外成纤维细胞可以在体外直接重编程为神经细胞。这些实验证据提出了这样一种可能性，即各种不同类型的终末分化的动物细胞之间是可以直接转化的。
[0008]在正常生理条件下，人们一般认为动物干细胞向终末分化细胞的分化过程是单向且不可逆的。但人们也发现在自然界存在少量已分化细胞转变为另一类型细胞的例子。最典型的例子包括蝾螈的断肢再生和果蝇成虫足原基转决定为翅膀。这说明已分化细胞依然能被重编程，具有可塑性。人工诱导细胞重编程最早成功于上世纪的五十年代。JohnGurdon用细胞核移植的方法诱导爪蟾成体细胞重编程并获得成功，从而证明脊椎动物终末分化细胞的细胞核也能被重编程到全能状态。2006年Shinya Yamanaga等发现的iPS技术，成功实现了成体细胞退分化为多能干细胞，从而开创了细胞重编程的新领域。
[0009]随着细胞核移植技术和iPS技术的发展，人们又开始关注不经历多能干细胞阶段的成体细胞之间的相互转化。早在上世纪八十年代，人们就发现小鼠的纤维细胞在用小分子化合物处理或表达某些外源基因时可转分化为成肌细胞和脂肪细胞。而近年来，通过过表达特定的基因，人们在体内和体外实现了亲缘关系较近的细胞之间的转化，如:通过在B细胞中过表达C/EBPalpha和C/EBPbeta转录因子将B细胞重编程为巨噬细胞。最近通过在小鼠胚胎纤维细胞中过表达 Ascll、Brn2和Mytl转录因子将其在体外重编程为神经细胞。这些研究说明成体细胞进行跨胚层的转化，即亲缘关系较远的细胞之间的转化是可以实现的。
[0010]关于从其他类型细胞转分化成肝细胞的研究已有近三十年的历史。早期人们发现在一些特殊的病理情况下可在胰腺组织内发现类似肝细胞的细胞。David Tosh等人通过过表达C/EBPbeta，实现了将与肝细胞在发育上亲缘关系非常接近的胰细胞在体外转分化为肝细胞类似细胞。然而由于该实验使用了永生化的胰细胞株AR42J-B13作为起始细胞，该细胞株是否在传代过程中产生遗传变化并不清楚，而且对于这些细胞的体内功能都不明确。更为重要的是，实验中使用了永生化的细胞系，无法了解原代培养的分化成体细胞是否可以在体外重编程获得肝细胞的功能。
[0011]本发明人的前期研究中，在抑制细胞衰老机制的前提条件下，转入3个转录因子Foxa3、Gata4、Hnfla，成功将小鼠尾巴上的纤维细胞转化成了肝脏细胞。这种细胞具有和体内肝脏细胞类似的上皮细胞形态、基因表达谱，且获得了肝脏细胞的功能，如肝糖原积累、乙酰化低密度脂蛋白的转运、药物代谢和吲哚绿的吸收等。将转化型肝脏细胞在移植入模拟人类酪氨酸代谢缺陷疾病的小鼠后，可像正常肝细胞一样，在被移植的肝脏中增殖，重建受体小鼠的肝脏。小鼠的总胆红素、转氨酶、酪氨酸等肝功能指标均出现明显好转，濒临死亡的小鼠得以存活。
[0012]尽管本发明人上述工作对于研究促进肝脏再生的材料及方法具有重大意义，但是所采用的体细胞为小鼠尾巴的纤维细胞，不能直接应用到人类肝癌疾病的治疗中。因此，进一步开发能使人的体细胞直接转化为具有类似功能的肝实质细胞的方法是十分必要的。
【发明内容】
[0013]本发明的目的在于提供一种新的制备肝实质细胞的方法。[0014]在本发明的第一方面，提供一种肝实质细胞的分化诱导方法(优选体外方法)，所述方法包括:在细胞中过表达以下转录因子或其变异体:HNF4A ;选自HNFlA或HNFlB的一个或多个；和选自F0XA1、F0XA2或F0XA3的一个或多个。
[0015]在一个优选例中，还在细胞中过表达选自以下的一种或多种转录因子或其变异体:C/EBP β、GATA4、HHEX、KLF4 或 PROXl。
[0016]在另一优选例中，在细胞中过表达以下转录因子或其变异体:HNF4A、HNF1A、F0XA3。
[0017]在另一优选例中，在细胞中过表达以下转录因子或其变异体:HNF4A、HNF1B、F0XA3。
[0018]在另一优选例中，所述的HNF4A或其变体是:(al)SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的多肽；或(bl)在(al)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较 佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(al)多肽功能的由(al)衍生的多肽；或(Cl)与(al)限定的蛋白序列有90%(较佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(al)多肽功能的由(al)衍生的多肽。
[0019]在另一优选例中，所述的HNFlA或其变体是:(a2) SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽；或(b2)在(a2)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽；或(c2)与(a2)限定的蛋白序列有90%(较佳地95%;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽。
[0020]在另一优选例中，所述的HNFlB或其变体是:(a3) SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的多肽；或(b3)在(a3)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a3)多肽功能的由(a3)衍生的多肽；或(c3)与(a3)限定的蛋白序列有90%(较佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a3)多肽功能的由(a3)衍生的多肽。
[0021]在另一优选例中，所述的FOXAl或其变体是:(a4) SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽；或(b4)在(a4)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a4)多肽功能的由(a4)衍生的多肽；或(c4)与(a4)限定的蛋白序列有90%(较佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a4)多肽功能的由(a4)衍生的多肽。
[0022]在另一优选例中，所述的F0XA2或其变体是:(a5)SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的多肽；或(b5)在(a5)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a5)多肽功能的由(a5)衍生的多肽；或(c5)与(a5)限定的蛋白序列有90%(较佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a5)多肽功能的由(a5)衍生的多肽。
[0023]在另一优选例中，所述的F0XA3或其变体是:(a6)SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肽；或(b6)在(a6)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a6)多肽功能的由(a6)衍生的多肽；或(c6)与(a6)限定的蛋白序列有90%(较佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a6)多肽功能的由(a6)衍生的多肽。[0024]在另一优选例中，所述的C/EBP β或其变体是:(a7) SEQ ID N0:7所示氨基酸序列的多肽；或(b7)在(a7)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a7)多肽功能的由(a7)衍生的多肽；或(c7)与(a7)限定的蛋白序列有90%(较佳地95% ；更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a7)多肽功能的由(a7)衍生的多肽。
[0025]在另一优选例中，所述的GATA4或其变体是:(a8)SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的多肽；或(b8)在(a8)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a8)多肽功能的由(a8)衍生的多肽；或(c8)与(a8)限定的蛋白序列有90%(较佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a8)多肽功能的由(a8)衍生的多肽。
[0026]在另一优选 例中，所述的HHEX或其变体是:(a9) SEQ ID N0:9所示氨基酸序列的多肽；或(b9)在(a9)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a9)多肽功能的由(a9)衍生的多肽；或(c9)与(a9)限定的蛋白序列有90%(较佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a9)多肽功能的由(a9)衍生的多肽。
[0027]在另一优选例中，所述的KLF4或其变体是:(alO)SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的多肽；或(blO)在(alO)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(alO)多肽功能的由(alO)衍生的多肽；或(clO)与(alO)限定的蛋白序列有90%(较佳地95%;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(alO)多肽功能的由(alO)衍生的多肽。
[0028]在另一优选例中，所述的PR0X1或其变体是:(all) SEQ ID N0:11所示氨基酸序列的多肽；或(bll)在(all)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(all)多肽功能的由(all)衍生的多肽；或(cll)与(all)限定的蛋白序列有90%(较佳地95%;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(all)多肽功能的由(all)衍生的多肽。
[0029]在另一优选例中，过表达转录因子或其变异体的细胞来源于体细胞或胚胎细胞。
[0030]在另一优选例中，过表达转录因子或其变异体的体细胞是:成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，胚胎细胞，组织或器官来源的细胞。
[0031]在另一优选例中，所述的细胞是衰老或凋亡途径被破坏(或抑制)的细胞(包括永生化的细胞)。
[0032]在另一优选例中，所述的细胞通过过表达SV40大T抗原，使得衰老或凋亡途径被破坏。
[0033]在另一优选例中，在体细胞中过表达所述的转录因子和/或SV40大T抗原的方法是:(a)提供细胞；(b)用表达载体将所述的转录因子或其变异体和/或SV40大T抗原转入(a)的细胞中；(c)培养(b)获得的细胞，富集获得转入了所述的转录因子或其变异体和/或SV40大T抗原的细胞，该细胞就是肝实质细胞。
[0034]在另一优选例中，(a)中，先将细胞进行体外培养若干代，较佳地为5-9代。
[0035]在另一优选例中，所述的表达载体是病毒。更佳地，所述的病毒是慢病毒。
[0036]在另一优选例中，首先将细胞培养于I型胶原上，将转录因子或其变异体转入细胞0.5-3天后，更换培养基为iHep培养基；更优选地，所述的iHep培养基为外加地塞米松、TGF- a、EGF、ITS、N2、B27、OSM 和 / 或其他成分的 Block，s 培养基。
[0037]在另一优选例中，首先将细胞培养于I型胶原上，将转录因子或其变异体转入细胞0.5-2天后，将培养基换为含有2-巯基乙醇、MEM NEAA和bFGF的DMEM/F12培养基；继续培养0.5-2天后，将培养基换为含有地塞米松、TGF- a、EGF和ITS的改良Block’ s培养基。
[0038]在另一优选例中，将转录因子或其变异体转入细胞中后，在第6-20天(较佳地第8-18天，更佳地10-16天，更佳地14天左右)富集具有上皮样形态的细胞。更佳地，用胰蛋白酶处理(每次处理2-10分钟，每隔1-3天处理一次)细胞以去除纤维细胞。
[0039]在另一优选例中，所述的肝实质细胞具有如下一种或多种性能:1)形成上皮样细胞克隆；2)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白:ALBUMIN;3)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白:CK8和CK18 ；4)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白:AAT，TTR，ASGPRl，GJBl ；5)积累肝糖原；6)转运乙酰化低密度脂蛋白；7)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白:糖代谢、药物代谢、脂肪酸代谢、胆固醇代谢、胆汁酸代谢相关基因或蛋白、调控止血和纤维蛋白溶解的基因或蛋白、第I级和第II级异源物代谢基因、分泌性蛋白基因。
[0040]在另一优 选例中，所述的细胞是哺乳动物细胞；更佳地，所述的细胞是人源的细胞。
[0041]在另一优选例中，所述的哺乳动物包括但不限于鼠、兔、狗、猴、猪、牛、羊、马、人
坐寸ο
[0042]在本发明的另一方面，提供一种肝实质细胞，所述肝实质细胞由前面所述的方法分化诱导产生。
[0043]在本发明的另一方面，提供前面所述的肝实质细胞的用途，用于制备促进肝脏再生或治疗(包括缓解)肝损伤的组合物。
[0044]在另一优选例中，所述的肝损伤包括(但不限于):终末期肝病、肝硬化、酒精肝、糖尿病、肥胖、急性肝衰竭、肝炎、肝纤维化、肝癌、肝脏代谢疾病或肝功能衰竭导致的肝损伤。
[0045]在本发明的另一方面，提供前面所述的肝实质细胞的用途，用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物的研究。
[0046]在一个优选例中，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括:研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生；或肝毒性测试、筛选肝细胞毒性化合物、筛选调节肝细胞功能化合物。
[0047]在本发明的另一方面，提供前面所述的肝实质细胞的用途，用于产生Albumin蛋白。
[0048]在本发明的另一方面，提供前面所述的肝实质细胞的用途，用于制备肝炎病毒(包括乙肝病毒、丙肝病毒等)感染模型，所述的肝炎病毒感染模型用于筛选抗肝炎病毒的药物。
[0049]在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物含有:(有效量的)所述的肝实质细胞；以及药学上可接受的载体。
[0050]在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。
[0051]在另一优选例中，所述的药物组合物用于促进肝脏再生；或治疗(包括缓解)肝损失相关疾病。
[0052]在本发明的另一方面，提供一种转录因子组合，包括以下转录因子或其变异体:HNF4A ;选自HNFlA或HNFlB的一个或多个；和选自FOXAl、F0XA2或F0XA3的一个或多个。
[0053]在本发明的另一方面，提供所述的转录因子组合的用途，用于制备肝实质细胞。
[0054]在本发明的另一方面，提供一种用于分化诱导肝实质细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的转录因子组合。
[0055]在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自以下的一种或多种:用于过表达转录因子或其变异体的细胞；转录因子或其变异体的表达载体(如慢病毒载体)；胰蛋白酶；细胞培养基(如iHep培养基；1型胶原)。
[0056]在本发明的另一方面，提供一种促进肝脏再生或治疗(包括缓解)肝损伤的方法，所述方法包括:给予需要治疗的对象有效量的所述的肝实质细胞。
[0057]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0058]图1A、人iHep细胞的制备的流程示意图。
[0059]图1B、过 表达8因子组合(8TF)的HFF细胞在转染12天后表达肝脏基因的情况；以及8因子减去I因子(8TF-1TF)后表达肝脏基因的情况。
[0060]图1C、过表达6因子组合(6TF)的HFF细胞在转染12天后表达肝脏基因的情况；以及6因子减去I因子(6TF-1TF)后表达肝脏基因的情况。
[0061]图1D、过表达5因子组合(5TF)的HFF细胞表达肝脏基因情况。
[0062]图1E、过表达5因子组合(5TF)的HFF细胞可积累肝糖原。
[0063]图1F、过表达5因子组合(5TF)的HFF细胞能将DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)转运到细胞内。
[0064]图1G、过表达5因子组合(5TF)的HFF细胞可分泌Albumin到培养基中，以H印G2细胞为阳性对照；已过表达GFP的HFF细胞作为阴性对照。
[0065]图2A、过表达5因子组合以及5因子减去I因子(5TF-1TF)诱导的HFF细胞表达肝脏基因的情况。
[0066]图2B、将转录因子HNFlB替换为HNFlA后诱导HFF细胞表达肝脏基因的情况。
[0067]图2C、撤除三因子F0XA3，HNF1A，HNF4A组合(3TF)中的任意一个因子后过表达诱导的HFF细胞表达肝脏基因的情况。
[0068]图3A、HFF过表达3因子后，第8天即有上皮样细胞形成。
[0069]图3B、RT_PCR分析HFF感染慢病毒(过表达3因子)之后不同时间点的基因表达情况。
[0070]图3C、ELISA分析表明hiH印细胞可分泌大量Albumin到培养基中。
[0071]图3D、ELISA分析表明hiH印细胞可分泌大量AAT到培养基中。
[0072]图3E、免疫荧光染色表明50%的3因子诱导的hiH印细胞能够共表达Albumin与AAT。
[0073]图3F、基因表达谱分析各种细胞之间的远近关系。[0074]图3G、PAS染色表明hiifep细胞中有大量的可被染成红色的糖原颗粒。
[0075]图3H、Dil-ac-LDL吸收测试验证hiH印细胞可将ac_LDL从培养基中转运到胞浆里。
[0076]图31、Indocyanine green (ICG)吸收测试验证hiHep细胞可将ICG从培养基中转运到包浆里。
[0077]图3J、油红O染色验证hiH印细胞包浆中可以积累甘油三磷酸及脂滴。
[0078]图3L、hiHep细胞表达介导胆汁排泄的转运分子的基因情况。
[0079]图3K、M、hiHep细胞具有分泌排泄DPDPE、CLF、TCA等代谢功能。
[0080]图3N、hiHep细胞能够诱导表达药物代谢相关的CYP1A2。
[0081]图4a、全基因组表达谱分析结果表明，hiH印细胞表达了大量肝特异的分泌蛋白。
[0082]图4b、全基因组表达谱分析结果表明，hiH印细胞表达了大量肝特异的凝血因子。
[0083]图4c、全基因组表达谱分析结果表明，hiHep细胞表达了大量肝特异的CYP450代谢酶。
[0084]图5a、q-PCR 分析表明另一株原代人胚胎纤维细胞HFF-2不表达胚肝特异的标志基因。
[0085]图5b、FACS分析表明原代人胚胎纤维细胞HFF-2不表达胚肝特异的标志基因CD133 和 EpCAM。
[0086]图5c、过表达3因子后，HFF-2可转化为上皮细胞样的hiH印细胞。
[0087]图5d、HFF-2来源的hiHep细胞表达大量肝特异表达基因。
[0088]图5e、PAS染色结果表明HFF-2来源的hiH印细胞也积累肝糖原。
[0089]图5f、HFF-2来源的hiH印细胞也能转运ac-LDL。
[0090]图6A、HAF过表达3因子后，第8天有上皮样细胞形成。
[0091]图6B、HAF(成年人纤维细胞，Human Adult Fibroblast)细胞中肝脏基因的表达情况。以肝细胞作为阳性对照；以过表达GFP的HAF细胞作为阴性对照；以β -Actin作为内参。
[0092]图6C、免疫荧光染色检测表明过表达3因子诱导的HAF细胞能够共表达AlbuIiiin与 ΑΑΤ。
[0093]图6D、PAS染色表明HAF细胞来源的hiHep细胞中有大量的可被染成红色的糖原颗粒。
[0094]图6E、Dil-ac-LDL吸收测试表明HAF细胞来源的hiH印细胞可将ac-LDL从培养基中转运到胞浆里。
[0095]图7A、HFF过表达3因子后会有明显的细胞增殖阻滞和细胞死亡，而表达SV40大T抗原的IiiHepu细胞有很好的增殖能力。
[0096]图7B、通过shRNA抑制p53，RB和p21均不能让hiH印细胞获得增殖能力。
[0097]图7C、hiHepLT能够形成同时表达上皮样细胞标志基因Z0_1和肝脏标志基因ALB或ASPGRl的上皮样细胞。
[0098]图7D、培养3代hi!fepLT、培养10代的hiH印LT，hiH印细胞中肝脏基因的表达情况。以肝细胞作为阳性对照；以过表达GFP的HFF细胞作为阴性对照；以β -Actin作为内参。
[0099]图7Ε、免疫荧光染色检测hiifepLT细胞中共表达ALB和AAT的情况。[0100]图7F、PAS染色表明hiifepLT细胞以及培养10代hiifepLT细胞的中有大量的可被染成红色的糖原颗粒。
[0101]图7G、Dil-ac-LDL吸收测试验证hi!fepLT细胞以及培养10代hiH印LT细胞可将ac-LDL从培养基中转运到胞浆里。
[0102]图7H、ELISA分析表明hiH印LT细胞以及培养10代hiH印LT细胞可分泌大量Albumin到培养基中。
[0103]图71、基因表达谱分析iH印、iifepM、培养不同时间的iifepM细胞之间的远近关系。
[0104]图8A、由HAF诱导的i!fepw细胞同样能够形成上皮样细胞。
[0105]图8B、由HAF诱导的Ifepw细胞能够表达肝脏功能基因。
[0106]图8C、免疫荧光染色表明由HAF诱导的iifepLT细胞能够表达Albumin (ALB)与MT。
[0107]图8D、由HAF诱导的Ifepw细胞也能积累肝糖原(PAS染色为红色)。
[0108]图8E、由HAF诱导的i!fepw细胞也能转运ac_LDL。 [0109]图9A、hiHepLT细胞不表达胚肝细胞相关标志基因。
[0110]图9B、免疫荧光染色表明hiifepLT细胞不表达EpCAM。
[0111]图9C、hiHepLT细胞不表达胆管上皮细胞相关基因。
[0112]图9D、hiHepLT细胞经过3D培养不能形成胆管。
[0113]图10A、hiH印μ细胞经过长时间培养后仍具有正常的染色体数目。
[0114]图lOB'hiifepLT细胞在裸鼠体内不能形成肿瘤。
[0115]图11A、移植hiH印LT细胞到FahiRagZv-(FA)小鼠的实验流程。
[0116]图11B、移植或不移植hiifepu细胞的F/R小鼠的存活曲线。
[0117]图11C、移植或不移植hiHepw细胞的F/R小鼠血清中ALT和AST的水平。
[0118]图11D、移植或不移植hi!fepLT细胞的F/R小鼠血清中人ALBUMIN的水平。
[0119]图11E、免疫组化染色结果表明移植hiifepu细胞的F/R小鼠肝脏切片中存在共染FAH和人AAT蛋白的细胞，而未移植IiiHepw细胞的F/R小鼠肝脏切片中则不存在。
[0120]图11F、免疫组化染色和H&E染色结果表明移植hiHepU细胞的F/R小鼠肝脏中，共染FAH和人AAT蛋白的细胞具有正常的组织结构。
[0121]图11G、PCR结果分析表明移植hiifepU细胞的F/R小鼠肝脏基因组DNA中存在人特异的ALU序列。
[0122]图11H、移植hi!fepu细胞的F/R小鼠血清中人ALBUMIN、ALT、AST和总胆红素的水平与外源hiifepLT细胞的整合效率匹配。
[0123]图12A、将用 alginate-poly-L-lysine-alginate 微胶囊包裹的 hiHepLT 细胞移植到ConA诱导的暴发性肝炎导致急性肝衰竭小鼠模型中的实验流程。
[0124]图12B、hi!fepLT 细胞包裹到 alginate-poly-L-lysine-alginate 微胶囊中的形态。
[0125]图12C、暴发性肝炎小鼠在移植或不移植微胶囊包裹的hiifepLT细胞情况下的存活曲线。
[0126]图12D、暴发性肝炎小鼠在移植微胶囊包裹的1?Ηθρ?Τ细胞后不同时间点的血清中ALT和AST的水平。
[0127]图12E、暴发性肝炎小鼠在移植微胶囊包裹的hiHepw细胞后不同时间点的血清中人ALBUMIN的水平。[0128]图12F、暴发性肝炎小鼠在移植微胶囊包裹的hiifepLT细胞后不同时间点的肝脏情况。
[0129]图12G、暴发性肝炎小鼠在移植微胶囊包裹的hiifepLT细胞后不同时间点的肝脏切片的H&E染色情况。
[0130]图13A、丙肝病毒的受体 CD81、SRB1、CLDN1 和 Occludin。
[0131]图13B、hi!fep细胞也和经典的丙肝病毒感染模型Huh7.5.1细胞一样，可被携带萤光素酶的丙肝假病毒感染。
【具体实施方式】
[0132]本发明人经过广泛的研究，通过在体细胞(较佳地为人的体细胞)中过表达若干个转录因子，将已经分化的体细胞在体外诱导成了具有功能的肝实质细胞(hiHep细胞)。所述细胞具有典型的上皮细胞形态，表达肝脏基因，并获得了多种肝实质细胞的功能。所述细胞可在肝脏中增殖，并重建肝脏功能。
[0133]术语
[0134]如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”或“用于过表达转录因子的细胞”是指多种类的细胞，只要其能够在转入所述的转录因子后形成肝实质细胞。较佳地，所述的细胞是哺乳动物体细胞或胚胎细胞；更佳地，所述的细胞是上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、血液细胞，神 经细胞，胚胎细胞，组织或器官来源的细胞。所述的细胞可以是已经分化或未分化的。相对于同一个体，尽管有不同的体细胞种类，但各种体细胞的基因组序列均是相同的、其主要组成部分也基本相同，因此易于理解各种体细胞均可用于本申请，只要其能够在转入所述的转录因子后形成肝实质细胞。
[0135]高等动物的动物体内有大约300种不同的分化细胞。大部分的成体分化细胞与全能干细胞一样，携带有完整的遗传信息。造成不同分化细胞之间的主要区别是细胞的表观遗传修饰的不同，导致细胞特异基因表达的不同。成体细胞的表观遗传修饰是可以被修饰的，从而实现不同细胞间的转化。比如成体细胞已被证明可以被重编程到全能干细胞，最近一些研究发现通过过表达某些基因，也可以实现将小鼠胚胎纤维细胞直接重编程为神经细胞。
[0136]如本文所用，所述的“肝实质细胞”是指能形成上皮样细胞克隆，能够表达肝脏基因(如:ALBUMIN、CK8、CK18、AAT、ASGRU CLDN2等)，并可在肝脏中增殖，具有重建肝脏功倉泛。
[0137]如本文所用，所述的“过表达”是指细胞内转录因子的含量(如表达量)超过初始细胞(未转入该外源基因的细胞)的水平；如与初始细胞相比，其含量高20%，较佳地高50% ;更佳地高100%以上，如高200%，300%...500%或更高。一种“过表达”的情形是将外源的转录因子的编码基因转入细胞中且发生表达。
[0138]如本文所用，所述的“低表达”是指细胞中某一基因含量(如表达量)显著低于其正常水平(如与野生型细胞相比，其表达量低20%，较佳地低50% ;更佳地低100%以上，如低200%, 300%...500%或更低)，所述的低表达还包括不表达的情况。低表达可通过基因敲除、基因沉默、蛋白抑制等本领域熟知的技术来实现。
[0139]如本文所用，所述的“哺乳动物”是脊索动物门(Chordata)脊椎动物亚门(Vertebrata)哺乳纲(Ma_alia)的动物。本发明所述的哺乳动物包括人,也包括非人哺乳动物。所述的非人哺乳动物例如是小鼠、大鼠、兔、狗、兔、猿猴、猪、牛、羊、马等等。不管是非人哺乳动物还是人，在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等方面都非常接近。在进化过程中，一些关键的细胞功能或者调控通路在不同的物种之间是非常保守的。比如细胞增殖、凋亡的信号通路在哺乳动物中基本一致。细胞的衰老途径也是一个非常保守的调控机制。
[0140]转录因子及用途
[0141]本发明人选定了 9种转录因子，发现这9种转录因子在导入细胞中过表达后，可以使非肝细胞形成肝实质细胞。所述的9种转录因子以及它们的GenBank登录号如表1。
[0142]表1
[0143]
【权利要求】
1.一种肝实质细胞的分化诱导方法，其特征在于，所述方法包括:在细胞中过表达以下转录因子或其变异体:
HNF4A ； 选自HNFlA或HNFlB的一个或多个；和 选自FOXAl、F0XA2或F0XA3的一个或多个。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还在细胞中过表达选自以下的一种或多种转录因子或其变异体:
C/EBP β、GATA4、HHEX、KLF4 或 PROXl。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，过表达转录因子或其变异体的细胞来源于体细胞或胚胎细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，过表达转录因子或其变异体的体细胞是:成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，胚胎细胞，组织或器官来源的细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞是衰老或凋亡途径被破坏的细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的细胞通过过表达SV40大T抗原，使得衰老或凋亡途径被破 坏。
7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，在体细胞中过表达所述的转录因子和/或SV40大T抗原的方法是: (a)提供细胞； (b)用表达载体将所述的转录因子或其变异体和/或SV40大T抗原转入(a)的细胞中； (c)培养(b)获得的细胞，富集获得转入了所述的转录因子或其变异体和/或SV40大T抗原的细胞，该细胞就是肝实质细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肝实质细胞具有如下一种或多种性倉泛: 1)形成上皮样细胞克隆； 2)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白:ALBUMIN; 3)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白:CK8和CK18; 4)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白:AAT，TTR,ASGPRl，GJBl ； 5)积累肝糖原； 6)转运乙酰化低密度脂蛋白； 7)表达选自以下的一种或多种基因或蛋白:糖代谢、药物代谢、脂肪酸代谢、胆固醇代谢、胆汁酸代谢相关基因或蛋白、调控止血和纤维蛋白溶解的基因或蛋白、第I级和第II级异源物代谢基因、分泌性蛋白基因。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞是哺乳动物细胞；更佳地，所述的细胞是人源的细胞。
10.一种肝实质细胞，其特征在于，所述肝实质细胞由权利要求1-9任一所述的方法分化诱导产生。
11.权利要求10所述的肝实质细胞的用途，用于制备促进肝脏再生或治疗肝损伤的组合物。
12.权利要求10所述的肝实质细胞的用途，用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物的研究。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括: 研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生；或 肝毒性测试、筛选肝细胞毒性化合物、筛选调节肝细胞功能化合物。
14.权利要求10所述的肝实质细胞的用途,用于产生Albumin蛋白。
15.权利要求10所述的肝实质细胞的用途，用于制备肝炎病毒感染模型，所述的肝炎病毒感染模型用于筛选抗肝炎病毒的药物。
16.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有: 权利要求10所述的肝实质细胞；以及药学上可接受的载体。
17.一种转录因子组合；包括以下转录因子或其变异体:
HNF4A ； 选自HNFlA或HNFlB的 一个或多个；和 选自FOXAl、FOXA2或FOXA3的一个或多个。
18.权利要求17所述的转录因子组合的用途，用于制备肝实质细胞。
19.一种用于分化诱导肝实质细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求16所述的转录因子组合。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自以下的一种或多种: 用于过表达转录因子或其变异体的细胞； 转录因子或其变异体的表达载体； 胰蛋白酶； 细胞培养基。
【文档编号】C07K14/47GK103981147SQ201310050796
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年2月8日 优先权日:2013年2月8日
【发明者】惠利健, 黄鹏羽, 张鲁狄, 高义萌 申请人:中国科学院上海生命科学研究院