专利名称：替可克肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及替可克肽的制备方法。
背景技术：
替可克肽(Tetracosactide)为人工合成的24肽促皮质素类似物,氨基酸的排列顺序和天然促皮质素(人、牛、猪)氨基端24个氨基酸相同，与天然ACTH具有相同的生理活性。最突出的特点是一般情况下不会产生抗体反应，无严重副作用，特别适用于对于天然猪促皮质素有过敏反应或无效的患者。能诱导肾上腺增生，刺激肾上腺皮质激素，尤其是氢化可的松(皮质醇)和某些盐皮质激素如皮质酮的分泌，也能刺激雄激素的分泌，但作用较弱。对醛固酮的分泌几无影响。半衰期为3小时。2008年FDA批准诺华的替可克肽用于肾上腺皮质功能减退症的诊断。目前Randboud University正在研究其对特发膜性肾病的治疗作用。
目前替可克肽的合成主要采用全液相合成方法进行。该方法步骤繁多，合成起来花费时间较长，并且需要用到昂贵的催化剂和高压设备，因此成本高、杂质多和操作危险、收率低等缺点。有报道采用Z保护策略逐个合成，每步均采用氢化脱除保护基，步骤长，操作繁琐以及成本高，收率低。逐个偶联而导致的丝氨酸易消旋问题，在纯化过程中难以纯化。发明内容
有鉴于此，本发明提供一种替可克肽的制备方法。该方法操作简单，反应时间短，收率高，D-Ser消旋杂质少，易于纯化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种替可克肽的制备方法，包括如下步骤:
步骤1、取第一固相载体与Pro偶联获得固相载体-Pro，再逐步偶联氨基酸，获得第一多肽-第一固相载体，第一多肽的序列如SEQ ID N0.1所示；
步骤2、取第二固相载体与氨基酸偶联，获得第二多肽-第二固相载体，第二多肽的序列如SEQ ID N0.2所示；
步骤3、取第二多肽-第二固相载体经第一裂解，获得第二多肽，经第一纯化后，与第一多肽-第一固相载体偶联，经第二裂解、第二纯化、冻干，即得。
第一多妝-第一固相载体 具体为H-Lys (Boc) -Pro-V a 1-GI y~Ly s (Boc) -Lys (Boc)-Arg (Pbf) -Arg (Pbf) -Pro-Val-Lys (Bo c) -Val-Tyr-Pro-树脂。
第二多妝-第二固相载体具体为Boc-Ser (Trt)-Tyr (tBu)-Ser (Psi (Me, Me) pro)-Met-Glu(OtBu)-His (Trt)-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-G ly_2_CTC。
在本发明的一些实施例中，步骤I第一固相载体与Pro偶联采用的有机碱为DIPEA、NMM, TEA、或 HOBt/DIPCDI/DMAP 体系。
具体的，Fmoc-Pro-OH与2-CTC树脂反应，采用的有机碱为DIPEA，NMM, TEA ；Fmoc-Pro-OH与王树脂反应采用的是HOBt/DIPCDI/DMAP体系在本发明的一些实施例中，步骤2中第二偶联的体系为PyB0P/H0Bt/DIPEA、H0At/DIPCD1、HOBt/DIPCD1、HATU/HOAt/DIPEA、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA。作为优选，步骤2中第二偶联的体系为TBTU/HOBt/DIPEA。在本发明的一些实施例中，第一裂解的裂解液包括TFE和DCM。作为优选，步骤2中第二偶联的体系为TFE与DCM的体积比为1:4。在本发明的一些实施例中，步骤3中第一纯化具体为取第一多肽与极性溶剂混合后加入惰性溶剂析晶。作为优选，极性溶剂选自甲醇、四氢呋喃、乙酸乙酯和二氯甲烷。作为优选，惰性溶剂包括乙醚、正己烷、石油醚或甲基叔丁基醚。 在本发明的一些实施例中，步骤3中偶联的体系为PyBOP/HOBt/DIPEA、HOAt/DIPCD1、HOBt/DIPCD1、HATU/HOAt/DIPEA、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA。作为优选，步骤3中偶联的体系为HOAt/DIP⑶I。在本发明的一些实施例中，步骤3中偶联的溶剂为DCM、DMF、NMP, DMSO中的一种或两者以上的混合溶液。在本发明的一些实施例中，步骤3中第二裂解采用的裂解液包括TFA、PhSMe、TIS、EDT 和 H2O。作为优选，步骤3中第二裂解采用`的裂解液中TFA、PhSMe, TIS、EDT和H2O的体积比为85 90:0 4:1 4:2 4:1 5。作为优选，纯化为反相高效液相色谱纯化。在本发明的一些实施例中，第二固相载体为2-CTC树脂。作为优选，树脂的替代度为 0.4-1.0mmol/go本发明提供一种替可克肽的制备方法。本发明通过取第一固相载体与Pro偶联获得固相载体-Pro，再逐步偶联氨基酸，获得第一多肽-第一固相载体，第一多肽的序列如SEQ ID N0.1所示；取第二固相载体与氨基酸偶联，获得第二多肽-第二固相载体，第二多肽的序列如SEQ ID N0.2所示；取第二多肽-第二固相载体经第一裂解，获得第二多肽，经第一纯化后，与第一多肽-第一固相载体偶联，经第二裂解、第二纯化、冻干，即得。该方法操作简单，反应时间短，收率高，D-Ser消旋杂质少，易于纯化。
图1示实施例18制得的替可克肽粗肽的HPLC图谱；图2示对比例制得的替可克肽粗肽的HPLC图谱。
具体实施例方式本发明公开了一种替可克肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的替可克肽的制备方法中所用原料均可由市场购得。
权利要求
1.一种替可克肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1、取第一固相载体与Pro偶联获得固相载体-Pro，再逐步偶联氨基酸，获得第一多肽-第一固相载体，所述第一多肽的序列如SEQ ID N0.1所不； 步骤2、取第二固相载体与氨基酸偶联，获得第二多肽-第二固相载体，所述第二多肽的序列如SEQ ID N0.2所示； 步骤3、取所述第二多肽-第二固相载体经第一裂解，获得第二多肽，经第一纯化后，与所述第一多肽-第一固相载体偶联，经第二裂解、第二纯化、冻干，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤I所述第一固相载体与Pro偶联采用的有机碱为 DIPEA、NMM、TEA、*HOBt/DIPCDI/DMAP 体系。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述第二偶联的体系为PyBOP/HOBt/DIPEA、HOAt/DIPCD1、HOBt/DIPCD1、HATU/HOAt/DIPEA、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一裂解的裂解液包括TFE和DCM。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述第一纯化具体为取第一多肽与极性溶剂混合后加入惰性溶剂析晶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述极性溶剂选自甲醇、四氢呋喃、乙酸乙酯和二氯甲烷；所述的惰性溶剂包括乙醚、正己烷、石油醚或甲基叔丁基醚。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述偶联的体系为PyBOP/HOBt/DIPEA、HOAt/DIPCD1、HOBt/DIPCD1、HATU/HOAt/DIPEA、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述偶联的溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或两者以上的混合溶液。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述第二裂解采用的裂解液包括 TFA、PhSMe, TIS、EDT 和 H20。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述第二裂解采用的裂解液中TFA、PhSMe、TIS、EDT和H2O的体积比为85 90:0 4:1 4:2 4:1 5。
全文摘要
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及替可克肽的制备方法。该方法通过取第一固相载体与Pro偶联获得固相载体-Pro，再逐步偶联氨基酸，获得第一多肽-第一固相载体，第一多肽的序列如SEQ ID No.1所示；取第二固相载体与氨基酸偶联，获得第二多肽-第二固相载体，第二多肽的序列如SEQ ID No.2所示；取第二多肽-第二固相载体经第一裂解，获得第二多肽，经第一纯化后，与第一多肽-第一固相载体偶联，经第二裂解、第二纯化、冻干，即得。该方法操作简单，反应时间短，收率高，D-Ser消旋杂质少，易于纯化。
文档编号C07K1/06GK103159850SQ201310100839
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者潘俊锋, 覃亮政, 刘建, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司