一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括：对rhG-CSF基因工程菌进行发酵培养，然后将培养菌体混悬于裂解液中，制得包涵体；将包涵体进行变性处理，然后用柱层析进行复性，得rhG-CSF复性液；最后进行阳离子层析和凝胶过滤层析，收集得到重组人粒细胞集落刺激因子。采用柱层析复性的方法，简化了操作方式，使重组人粒细胞集落刺激因子的复性收率高于70%；复性液经过阳离子交换和分子筛层析后制备成rhG-CSF的原液。原液电泳纯度达到99%以上，RP-HPLC的纯度达到98%以上，比活性6.6×107IU/mg。
【专利说明】一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域【技术领域】，特别涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子 (recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rhG-CSF)的制备方法。
【背景技术】
[0002] 人粒细胞集落刺激因子（human granulocyte colony stimulating factor， hG-CSF)属于造血生长因子家族。内毒素、TNF-a和IFN-γ可活化单核细胞和巨噬细胞产 生G-CSF。此外，成纤维细胞、内皮细胞、星状细胞和骨髓基质细胞等在LPS、IL-1或TNF- α 刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病细胞以及CHu-2人口腔癌细胞、5637人膀胱癌细 胞、MIAPa Ca-2胰腺癌细胞可组成性地表达G-CSF。
[0003] 1986年G-CSF cDNA克隆成功，C-CSF基因全长2. 5kb，包括5个外显子和4个内含 子。人类有两种不同的G-CSF cDNA，分别编码含207和204氨基酸的前体蛋白，均有30个 氨基酸的先导序列，成熟蛋白分子分别为177和174个氨基酸，前者除了在成熟分子N端35 位处插入了 3个氨基酸外，其余的序列与174氨基酸分子相同，人G-CSF分子量为19. 6kDa， PI6. 1，0-糖基化，对酸碱（pH2?10)、热以及变性剂等相对较稳定。G-CSF有5个半胱氨 酸，Cys36与Cys42, Cys74与Cys64之间形成两对二硫健，Cysl7为不配对半胱氨酸，二硫 键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素。
[0004] 人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF)是一种在哺乳动物中调节粒细胞(尤其是中性粒 细胞)成熟与生长的造血生长因子。它通过刺激粒细胞巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM)向 粒细胞集落形成单位（CFU-G)的分化和成熟，动员成熟中性粒细胞向外周血的释放，从而促 进中性粒细胞的生长。在临床上用来治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症，有很大的经 济意义和社会意义。
[0005] hG-CSF的天然来源有限，产量甚微，还不能满足临床应用的需要。利用基因工程技 术生产是获取大量hG-CSF的一条途径。天然hG-CSF虽是一种糖蛋白，但文献报导，未经糖 基化和利用大肠杆菌表达的重组hG-CSF具有与天然hG-CSF同样的生物活性。
[0006] 利用基因工程手段构建的表达外源目的基因的菌株常采用大肠杆菌表达系统，目 的蛋白多以包涵体形式表达于菌体内。在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生 物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结 构称为包涵体。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、夕卜 膜蛋白、环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0. 5-lum，难溶于水，只溶于变 性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体的形成主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质 折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
[0007] 包涵体是以表达产物为主，聚集形成的蛋白性质颗粒，目的蛋白具有正确的一级 结构顺序，但缺乏正确的构象，因而不具备其生物活性。表达蛋白必须经过变性和复性的过 程，使包涵体折叠成为正确的高级结构，才能具有生物活性。包涵体在蛋白变性剂的作用 下，成为可溶性的伸展状态，通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复 到正常的折叠结构，形成具有天然生物活性的天然结构。在去除变性剂的同时，分子内部的 二硫键、疏水键等往往来不及形成，从而导致分子间存在大量错误的折叠和聚合，以至蛋白 沉淀。复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，很大程度上与蛋白 质本身的性质有关。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋 白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶 剂和其他添加剂的存在与否等。
[0008] 目前，蛋白质的复性方法主要有稀释复性、透析复性、超滤复性等方法。但这些方 法存在设备要求高、收率低、操作繁琐、易产生蛋白沉淀等诸多问题。因此，把rhG-CSF包涵 体复性为有生物活性的蛋白质，并尽可能提高复性收率，是一个很大的挑战。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是提供一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法， 采用柱层析复性的方法，简化了操作方式，使重组人粒细胞集落刺激因子的复性收率高于 70% ;复性液经过阳离子交换和分子筛层析后制备成rhG-CSF的原液。原液电泳纯度达到 99%以上，RP-HPLC的纯度达到98%以上，比活性6. 6X 107IU/mg。
[0010] 本发明的一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括：
[0011] (1)对rhG-CSF基因工程菌进行发酵培养，然后将培养菌体混悬于裂解液中，经超 声破碎和离心处理，制得包涵体；
[0012] (2)将上述包涵体经洗涤和溶解后，进行变性处理，得到变性蛋白溶液；
[0013] (3)将所得变性蛋白溶液进行稀释，然后用柱层析进行复性处理，得rhG-CSF复性 液；
[0014] (4)将复性液直接进行阳离子层析和凝胶过滤层析，收集得到重组人粒细胞集落 刺激因子。
[0015] 所述步骤（1)中的裂解液为 20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTT1. 5g/L，ρΗ8· 0 ;
[0016] 所述步骤（2)中用溶液6Μ盐酸胍，20mM醋酸-醋酸钠，ρΗ5. 4对包涵体进行变性 处理；
[0017] 所述步骤（3)中用稀释液6Μ盐酸胍，20mM醋酸-醋酸钠，ρΗ5. 4将变性蛋白溶稀 释到1?2mg/ml ;
[0018] 所述步骤（3)中的柱层析，所用层析介质为Sephadex G_25coarse、Sephadex G_25media、Sephadex G_25fine 或 Sephadex superfine ；
[0019] 所述步骤（3)中的柱层析，层析柱直接在5_20cm，柱床高度60-100cm ;
[0020] 所述步骤（3)中的柱层析，层析上样蛋白浓度1. 0?2. Omg/ml，上样体积小于柱床 体积的20%，上样和洗脱流速为5-lOcm/h ;
[0021] 所述步骤（3)中的柱层析，所用洗脱液为pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸钠缓冲液。
[0022] 本发明的柱层析复性主要是使用脱盐的原理，变性剂是高浓度的盐，在层析过 程中，被缓慢的脱去，rhG-CSF随着变性剂浓度逐渐降低，而重新折叠变成具有活性的 rhG-CSF 分子。
[0023] 有益效果
[0024] 本发明采用柱层析复性的方法，简化了操作方式，使重组人粒细胞集落刺激因子 的复性收率高于70%。柱层析所收获的复性液无沉淀，溶液澄清透明，可以直接进行下一步 的纯化分离。复性液经过阳离子交换和分子筛层析后制备成rhG-CSF的原液。原液电泳纯 度达到99%以上，RP-HPLC的纯度达到98%以上，比活性6. 6X 107IU/mg。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为RP-HPLC空白对照图谱；
[0026] 图2为柱层析复性后收集的洗脱峰RP-HPLC纯度检测图谱；
[0027] 图3为rhG-CSF原液RP-HPLC纯度检测图谱；
[0028] 图4为rhG-CSF原液的纯度非还原性SDS-PAGE图谱；
[0029] 图5为rhG-CSF原液的还原性SDS-PAGE图谱。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0031] 实施例
[0032] rhG-CSF包涵体的获取
[0033] rhG-CSF基因工程菌(工程菌株pBVQG8/MM294,由中国军事医学科学院提供）按常 规的高密度发酵(采用分批补料培养方式进行工程菌发酵，当菌体密度达0D值到达30时， 对工程菌进行诱导发酵，表达外源蛋白；其中，补料培养基配方为：酵母浸出粉450g/L、葡 萄糖500g/L ;发酵培养基配方为：蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油4ml/L、葡萄糖20g/L、 磷酸二氢钾2. 31g/L、磷酸氢二钾12. 54g/L、硫酸镁0. 75g/L)后，采用8000g离心力收集菌 体。
[0034] 收集后的湿菌体，放置于_20°C，冻融一次。取400克冻融后的菌体，按固液比1:10 (g/ml)比例混悬于裂解液中（20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTTl. 5g/L，pH8. 0)，混合成均一的悬 液后，使用大功率超声波细胞破碎仪对混悬液进行破菌及匀浆处理，l〇〇〇〇g离心力离心收 集包涵体60克。离心机为Avanti J-25, Beckman公司。
[0035] rhG-CSF包涵体的洗涤和溶解
[0036] 收集的包涵体60g依次用注射用水、A液（ImM EDTA，0. 1M NaCl)、B液 (50mMTris-HCl，5mM DTT，5mM EDTA，1% 脱氧胆酸钠，ρΗ9·0)进行洗涤，采用 10000g 离心力 离心收集包涵体70g ;然后将收集的包涵体70g用C液（50mMTris-HCl，2%十二烷基肌氨酸 钠，PH8. 0)溶解，室温搅拌过夜，用丙酮沉淀蛋白，获得高纯度的包涵体50g。
[0037] rhG-CSF包涵体的变性处理
[0038] 取上述包涵体，用D液（6M盐酸胍，20mM醋酸-醋酸钠，pH5. 4)溶液进行变性，室温 温和搅拌2-3小时，采用33000g离心力离心收集上清液，即为rhG-CSF蛋白变性溶液。采 用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，用D溶液（6M盐酸胍，20mM醋酸-醋酸钠，pH5. 4)将其蛋白 浓度稀释至1. 5mg/ml，准备进行柱上复性。
[0039] rhG-CSF包涵体的柱层析复性
[0040] 使用XK50/100柱子，柱床高度80cm，层析介质为Sephadex G_25media。先用 0. 2MNa0H清洗1个柱体积，注射用水冲洗3个柱体积，用pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸钠缓冲液 平衡柱子至少3个柱体积，待电导和pH值稳定后上样。
[0041] 上样体积200ml，流速5cm/h，上样完毕后，用pH5. 420mM醋酸-醋酸钠缓冲液进行 洗脱，洗脱流速5cm/h，收集洗脱峰，洗脱峰即为rhG-CSF复性液。洗脱峰进行RP-HPLC检测 (图2)，如图所示，正确构象的rhG-CSF的含量高达95. 4%，异构体杂质含量为4. 6%。
[0042] rhG-CSF 的精纯
[0043] 将复性后的rhG-CSF溶液，上样于CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析介 质，用pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸钠缓冲液平衡2个柱体积，用0. 3M NaCl溶液进行洗脱，收集 洗脱峰。上样、平衡和洗脱流速均为lOcm/h。
[0044] 离子交换洗脱峰进行进一步的分子筛凝胶过滤层析。层析介质选用Sephacryl S200层析介质，用pH4. OlOmM醋酸-醋酸钠缓冲进行洗脱，收集洗脱峰。洗脱峰合并即为 rhG-CSF原液。原液进行非还原性SDS-PAGE电泳（图4)和还原性SDS-PAGE电泳（图5)电 泳纯度均为100%。RP-HPLC检测（图3)，其纯度为100%。
[0045] 按照中国药典进行活性检测，其活性高达7. 6X 107IU/mg。
[0046] 虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟 悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明 的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。
【权利要求】
1. 一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括： (1) 对rhG-CSF基因工程菌进行发酵培养，然后将培养菌体混悬于裂解液中，经超声破 碎和离心处理，制得包涵体； (2) 将上述包涵体经洗涤和溶解后，进行变性处理，得到变性蛋白溶液； (3) 将所得变性蛋白溶液进行稀释，然后用柱层析进行复性处理，得rhG-CSF复性液； (4) 将复性液进行阳离子层析和凝胶过滤层析，收集得到重组人粒细胞集落刺激因子。
2. 根据权利要求1所述的一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于： 所述步骤（1)中的裂解液为 20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTT1. 5g/L，ρΗ8· 0。
3. 根据权利要求1所述的一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于： 所述步骤（2)中用溶液6Μ盐酸胍，20mM醋酸-醋酸钠，ρΗ5. 4对包涵体进行变性处理。
4. 根据权利要求1所述的一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于： 所述步骤（3)中用稀释液6Μ盐酸胍，20mM醋酸-醋酸钠，ρΗ5. 4将变性蛋白溶稀释到1? 2mg/ml〇
5. 根据权利要求1所述的一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于： 所述步骤（3)中的柱层析，所用层析介质为Sephadex G_25coarse、Sephadex G_25media、 Sephadex G_25fine 或 Sephadex superfine。
6. 根据权利要求1所述的一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于： 所述步骤（3)中的柱层析，层析柱直接在5-20cm，柱床高度60-100cm。
7. 根据权利要求1所述的一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于： 所述步骤（3)中的柱层析，层析上样蛋白浓度1. 0?2. Omg/ml，上样体积小于柱床体积的 20%，上样和洗脱流速为5-10cm/h。
8. 根据权利要求1所述的一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于： 所述步骤（3)中的柱层析，所用洗脱液为pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸钠缓冲液。
【文档编号】C07K14/53GK104120159SQ201310150982
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2013年4月26日
【发明者】岑仡, 宋宏 申请人:上海三维生物技术有限公司