日本血吸虫Wnt5基因、蛋白及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种日本血吸虫基因，所述基因为编码SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的Wnt5基因。本发明还公开了上述基因编码的Wnt5蛋白质。本发明的日本血吸虫Wnt5基因和蛋白，参与调控血吸虫的生长发育及生殖系统发育，对开发阻断血吸虫生长发育及生殖系统发育的新药具有很高的应用价值。
【专利说明】日本血吸虫Wnt5基因、蛋白及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种日本血吸虫Wnt5基因、蛋白及用途。
【背景技术】
[0002]血吸虫病是由血吸虫感染引起的，分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。目前吡喹酮仍为防治该病的唯一化疗药物。虽然治疗效果令人满意，但长期的单一、反复用药，存在产生耐药性的风险。因此针对血吸虫病的新的治疗药物亟待开发。而要使新药研究取得突破性进展，充分了解血吸虫的生长发育调控机制是重要基础。
[0003]Wnt信号通路是普遍存在于多细胞真核生物中的保守信号途径，对早期胚胎发育及成体内环境的稳定都具有重要的调节作用。该通路的异常调节会使胚胎建成遭到破坏而导致胚胎畸形甚至死亡，而成体fct信号异常激活多产生肿瘤。目前，以Wnt信号通路成员为靶标研究抗肿瘤新药是生物医药的研究热点。本课题组率先在血吸虫上开展了 fct信号通路的研究，希望通过解读这一信号通路对血吸虫发育的调节，来筛选重要的调控分子作为药靶，推进抗血吸虫新药的研发。
[0004]Wnt5是Wnt蛋白家族成员之一，研究表明Wnt5在不同物种的胚胎发育中起多方面的调控作用。fct5蛋白在多种动物的原肠胚形成期，参与调节细胞的汇聚延伸运动，以及细胞的迁移。如fct5信号通路在斑马鱼尾的形成，果蝇的中枢神经系统的发育，小鼠胰脏胰岛细胞的正确迁移等过程 中都起着至关重要的作用。但是，至今国内外尚无日本血吸虫Wnt5基因的研究报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决由于对日本血吸虫的生长发育调控机制缺乏认识而导致在新药研发方面难以取得突破的技术问题，提供一种日本血吸虫fct5基因(简称SjWnt5基因)和蛋白，该SjWnt5基因参与调控血吸虫的生长发育及生殖系统发育，对开发控制血吸虫生长发育及生殖生理的新药具有较高的应用价值。
[0006]此外，还需要提供一种日本血吸虫Wnt5基因和蛋白质的应用。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0008]在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫基因，所述基因为编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的fct5基因。
[0009]优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]在本发明的另一方面，提供了一种日本血吸虫蛋白质，所述蛋白质为SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的fct5蛋白质。
[0011]在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，包含编码SEQ ID N0.1中第67-271位氨基酸序列的核苷酸序列。
[0012]在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，包含上述重组载体。[0013]在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫基因在制备预防或治疗血吸虫病的药物中的应用。
[0014] 所述药物通过阻断血吸虫生长发育或阻断血吸虫生殖系统发育来发挥防治血吸虫病的作用。
[0015]在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫蛋白质在制备预防或治疗血吸虫病的药物中的应用。
[0016]所述药物通过阻断血吸虫生长发育或阻断血吸虫生殖系统发育来发挥防治血吸虫病的作用。
[0017]本发明日本血吸虫Wnt5基因，实时荧光定量PCR分析结果表明SjWnt5mRNA在13天器官分化期表达明显增多，其后的18天合抱配偶期继续增多，23天生殖器官初步建成开始，SjWnt5mRNA在雌虫中表达逐渐下降，而在雄虫中不断上调。在日本血吸虫不同发育阶段SjWnt5蛋白表达量的变化趋势与SjWnt5mRNA表达水平的变化基本一致。结合血吸虫发育的生理特点，推测SjWnt5引发的Wnt信号对虫体发育早期的器官分化有调节作用；对雌虫生殖器官的建成，及性成熟雄虫的进一步发育都可能具有调节作用，本发明SjWnt5基因为开发阻断虫体发育的新药提供了新思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0019]图1是本发明实施例1的SjWnt5的跨膜结构预测结果图；
[0020]图2是本发明实施例1不同物种fct5氨基酸序列多重比对图；
[0021 ] 图3是本发明实施例2日本血吸虫不同期别与性别间的S jWnt5mRNA表达水平柱状图；
[0022]图4是本发明实施例2日本血吸虫25天单性和混合感染的虫体SjWnt5mRNA表达水平柱状图；
[0023]图5是本发明实施例3的SDS-PAGE分析pET28a_Wnt5a- (67aa_271aa)重组质粒的诱导表达图；
[0024]图6是本发明实施例3电泳检测重组蛋白原核表达后的纯化产物图；
[0025]图7 是本发明实施例 3 的 pET28a-Wnt5a-(67aa_271aa)重组蛋白的 Western blot分析结果图；
[0026]图8是本发明实施例4以血吸虫天然虫体蛋白鉴定制备的SjWnt5多抗血清特异性结果图；
[0027]图9是本发明实施例5的不同发育阶段SjWnt5蛋白表达量变化柱状图。
【具体实施方式】
[0028]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京:科学出版社，2002)中所述的方法进行。
[0029]本发明以7d童虫cDNA为模板，通过RACE技术获得日本血吸虫Wnt5 (SjWnt5)全长cDNA序列，再利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的结构。结果表明，该SjWnt5cDNA 全长 1954bp(SEQ ID N0.2)，182 ~1330bp 为编码区，编码 382 个氨基酸(SEQID N0.1)。氨基酸序列分析显示，SjWnt5蛋白没有信号肽，为非分泌型Wnt蛋白。利用荧光实时定量PCR方法分析了 SjWnt5基因在日本血吸虫不同发育阶段mRNA水平的变化。以含有丰富抗原表位的67aa_271aa序列，构建原核表达载体，表达SjWnt5重组蛋白。以纯化的原核表达产物为抗原，免疫动物制备多克隆抗体，以此多克隆抗体为一抗，通过Western blotting分析SjWnt5在日本血吸虫不同发育阶段蛋白水平的变化。实验结果显示SjWnt5mRNA在13天器官分化期表达明显增多，其后的18天合抱配偶期继续增多，23天生殖器官初步建成开始，SjWnt5mRNA在雌虫中表达逐渐下降，而在雄虫中不断上调。在25天单性感染的雌虫中表达水平高于复性感染的雌虫约5倍，而25天单性感染的雄虫低于复性感染的雄虫约5倍。结合日本血吸虫发育的生理特点，推测SjWnt5引发的Wnt信号对虫体发育早期的器官分化有调节作用；对雌虫生殖器官的建成，及性成熟雄虫的进一步发育都可能具有调节作用，表明该SjWnt5基因对开发阻断血吸虫生长发育及生殖系统发育的新药具有很高的应用价值。
[0030]实施例1日本血吸虫Wnt5新基因全长cDNA序列的获得及生物信息学分析
[0031]1.不同期别日本血吸虫收集
[0032]日本血吸虫(安徽株)尾蝴感染新西兰兔，腹部贴片，感染2，000~10，000条尾蝴/只。分别在感染后第7天、13天、18天、23天、35天、42天、52天后剖杀，从肝门静脉灌注加入抗凝剂的PBS溶液冲出虫体，PBS洗涤虫体去除粘附的组织等其它杂质。将23天、35天、42天和52天的虫体进行雌雄分开。收集虫体于液氮中冻存备用。单钉螺逸出的尾蝴腹部贴片感染BALB/c小鼠获得单性雌虫或雄虫，同时多个钉螺逸出的尾蝴混合后感染BALB/c小鼠获得雌雄合抱的虫体，均于感染后的第25天剖杀冲虫。
[0033]2.总RNA的提取和cDNA的合成
[0034]按Trizol试剂盒说明书抽提收集的各期别、性别虫体总RNA，琼脂糖凝胶电泳分析RNA样品的完整性，紫外分光光度计检测RNA的浓度及分析纯度。总RNA置_80°C冰箱冻存备用。取抽提的各期别、性别的总RNA,按照PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒手册，反转录成cDNA，作为实时定量PCR扩增的模板。
[0035]3.日本血吸虫Wnt5全长基因序列的扩增
[0036]参考其他物种的Wnt5蛋白的多重比较结果，包括人、小鼠、爪蟾、斑马鱼、涡虫、华支睾吸虫以及曼氏血吸虫，选择其中保守的氨基酸序列RFRHWNC和CKCHGVSG作为设计引物的位点。在设计引物时考虑日本血吸虫密码子的偏好性，设计一对引物SjWnt5F和Sjffnt5R,扩增日本血吸虫Wnt5的EST片段。以7天虫体RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行克隆测序。测序结果进行BLASTX分析，在确定插入片段为Wnt5基因序列后，再设计RACE引物，进行3’和5’延伸。RACE产物克隆测序后，与EST序列进行电子拼接，拼接序列用NCBI的ORF finder寻找编码框。在确定拼接序列中包含完整编码框后，再在拼接序列的两端设计引物(SjWnt5fulF和SjWnt5fulR)，进行全长序列的扩增。具体引物序列见下表1。
[0037]表1用于扩增SjWnt5EST，RACE及全长cDNA序列的PCR引物序列PrimeScqucnccs (5*?3^
SjWni5F5r CGATTTAGACATTGGAATTGC Si ( SEQ ID NOJ )
SjWntSR5' TCCAGAAACACCATGACATTTACA 3' (SEQ ID N0.4)
|!Wnl-!(；!race<i^5' ATTGCATGAGCGAAGCCAGCCTCAC 3' (SEQ ID N0.5)
[0038]5'TGCTGAAGCATCATTGACAGAACTG 3' (SEQIDN0.6)
SiWnt5/3raceNGSP5' GATTGGATATGGGGTGGTTGTGGAG 3' < SEQ ID N0.7)
SjWntSfuIF *5' AGCAGGTCGTTTGGCTGTCTACAAG 3' (SEQIDN0.8)
SjWnt5IulR5' TTCTTAACAGCTA AATACATGATTG 3' ( SEQ ID N0.9)
'5' ATCATAGTTTATTAATAGmTCTGC 3' (SEQ ID N0.10 )
[0039]4.Sjffnt5生物信息学分析
[0040]将新基因全长cDNA序列在BLASTX数据库进行相似性比对；利用NCBI的ORFfinder预测新基因的编码框；利用ProtParam软件对新基因氨基酸残基数、组成、蛋白质相对分子量等参数进行分析；利用Clustalw2软件对不同物种Wnt5蛋白进行多重比对。利用NetAcet软件对预测蛋白的糖基化位点进行分析；利用Signal P和TMHMM进行信号肽和跨膜结构预测。
[0041]Sjffnt5核苷酸及氨基酸序列的生物信息学分析结果:
[0042]SjWnt5cDNA 全长 1954bp(SEQ ID N0.2)，182 ~1330bp 为编码区，编码 382 个氨基酸(SEQ ID N0.1)。理论分子量为43.63Ku，理论等电点9.25。氨基酸序列的相似性比较显示，SjWnt5与Wnt家族蛋白具有较高同源性，其中与Wnt5a蛋白的同源性最高。氨基酸序列分析显示，SjWnt5蛋白没有信号肽，为非分泌型Wnt蛋白。在N端有跨膜结构(如图1所示)，整个蛋白通过N端的跨膜结构锚定在膜上，C端游离于胞外。与其他的Wnt蛋白家族成员相似，整个SJWnt5蛋白散在24个可交连形成二硫键的半胱氨酸残基，其中50%位于蛋白的羧基端；具有2个潜在的糖基化位点，分别位于aall5~aal 17 (NCS)和aa330~aa332 (NST)。选择不同门类动物的Wnt5氨基酸序列与SjWnt5进行多重比对，包括:人(Homo sapiens, AAH74783.2)、小鼠(Mus musculus, NP_001243153.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis, NP_001079345.1)、斑马鱼(Danio rerio, NP_571012.1)、夏威夷鱿鱼(Euprymnascolopes, ABC96709.1)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni, XP_002575587.1)、地中海润虫(Schmidtea mediterranea, ACJ64864.1)、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,GAA50814.1)等物种。结果如图2所示，同属于扁形动物的日本血吸虫、曼氏血吸虫，华支睾吸虫以及三角润虫，其fct5蛋白在系统发育树上隶属于同一个分支。其他的脊椎动物在一个分支上，且越是高等的脊椎动物，Wnt5蛋白的相似性越高。
[0043]实施例2 Sjffnt5在日本血吸虫不同发育阶段mRNA表达量分析
[0044]1.实验方法
[0045]按照实时定量PCR的引物设计原则设计SjWnt5引物，上游引物:5' CTCAGAGTCCAGGTACAAGAGGTCG3' (SEQ ID N0.11);下游引物:5' GACACTCAACGCGACAACACCAATT3' (SEQID N0.12)。选择 18S rRNA(GenBank 登陆号 AY157226.1)作内参,上游引物:5，CTTAGTTGGTGGAGCGAITTGTCTG3’ (SEQ ID N0.13);下游引物:5’ CGACCACACTACTCCATAAAGAAGC3’ (SEQID N0.14);引物由invitrogen公司合成。
[0046]参照PrimeScript? RT reagent Kit 说明，将 RNA 反转录成 cDNA,以 SYBR GreenI为荧光染料，用SYBR Green PCR Premix Ex Taq进行实时定量PCR扩增。反应条件为:95°C 5min，然后95°C 15s，60°C 5s，共40个循环，每个样品均做三个重复。以7d童虫cDNA作10倍系列稀释后为模板，构建SjWnt5和18S rRNA内参的标准曲线，确保标准曲线的相关系数R2 >0.99。实验结果采用双标曲线法进行分析，得到不同期别相对18S rRNA内参基因的SjWnt5的拷贝数。
[0047]2.结果
[0048]图3显示的是SjWnt5的mRNA在血吸虫不同期别和性别间的相对表达水平。18天前的虫体较小，雌雄分开较难，采用雌雄混合虫体进行分析。23天及其后的成虫，雌雄分开后分别进行分析。SjWnt5mRNA在虫卵和7天童虫中的表达水平接近，到13天时增加了近2倍，到18天时增加了约2.5倍。在23天及其后的雌雄虫中，SjWnt5mRNA表达呈现相反的趋势，在雌虫中表达逐渐下调，52天的雌虫表达水平在所有发育阶段中最低；而SjWnt5在雄虫中表达逐渐上调，52天的雄虫表达水平最高。
[0049]图4是SjWnt5在25天单性和混合感染的虫体中mRNA表达水平。在25天混合感染的虫体中，雄虫SjWnt5mRNA的表达量明显高于雌虫。但25天单性感染的雌雄虫体间Sjffnt5mRNA的表达水平接近。单性感染的雌虫SjWnt5mRNA的表达量高于混合感染的雌虫，而单性感染的雄虫SjWnt5mRNA的表达量明显低于混合感染的雄虫。图4中，25ddf:25天混合感染的雌虫；25ddm:25天混合感染的雄虫；25dsf:25天单性感染的雌虫；25dsm:25天单性感染的雄虫。
[0050]实施例3 日本血吸虫SjWnt5基因重组原核表达质粒的构建、重组蛋白的表达、纯化及Western blot检测
[0051]1.方法
[0052]应用BepiPreb软件预测SjWnt5蛋白的抗原表位,选择抗原表位比较丰富的区段67aa-271aa，设计引物进行PCR扩增。用Primer5.0软件设计引物序列，上游引物:5' GTGGATCCCCACTATGTTTACGTGTTCAAGGTT3' (SEQ ID N0.15)，引入酶切位点BamHI 下游引物:5' GTCTCGAGATAACCTTGACGAAGATAACGACCA3' (SEQ ID N0.16)，引入酶切位点 XhoI，理论上扩增片段长度为612bp。
[0053]以血吸虫23天总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物回收后经BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切与同样双酶切的pET28a(+)质粒16°C过夜连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，挑选单菌落摇菌，进行菌液PCR鉴定及质粒双酶切鉴定，经测序鉴定后获得重组阳性质粒pET28a-SjWnt5。
[0054]将重组质粒转入BL21(DE3)表达型感受态细胞，挑取单克隆进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析经超声破碎后的菌液蛋白，判断蛋白是以可溶性或包涵体形式表达。用切胶纯化方法纯化蛋白，取700ul包涵体加入IOOul的loading buffer煮5分钟后全部上样，用0.25mol/l的KCL染色后将目的蛋白切下。取ImlPBS研磨切下的胶条后离心，取上
清进行定量。
[0055]将纯化的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移到硝酸纤维(NC)膜上。以1: 50比例稀释日本血吸虫虫卵蛋白免疫兔血清作一抗；以1: 1000的比例稀释HRP标记的羊抗兔IgG作二抗。用增强型HRP-DAB显色试剂显色分析结果。
[0056]2.结果
[0057]通过PCR扩增出编码SjWnt5蛋白67aa_271aa的区段，大小为612bp。双酶切后插入原核表达载体pET28a的BamH I和Xho I酶切位点之间，构建成重组质粒。通过菌液PCR和质粒双酶切鉴定，并经测序验证，目的基因大小及读码框准确无误。重组蛋白的预期分子量为28.6kD。将重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)中，经SDS-PAGE分析重组质粒诱导4个小时后的表达产物。如图5所示，诱导产物在约28kDa处有一明显蛋白条带，与重组蛋白的预测分子量一致，而未诱导产物无此条带，表明重组蛋白成功表达(图5中，M:蛋白Maker ；1:未加诱导剂的菌体裂解物；2:pET28a-ffnt5a- (67aa-271aa)重组质粒转化菌诱导产物)。SDS-PAGE分析表达菌裂解上清及沉淀，发现该重组蛋白主要以包涵体形式表达。制备重组蛋白包涵体，并进行切胶纯化，图6所示为纯化的重组蛋白(图6中,M:蛋白Maker ；1:重组蛋白pET28a-Wnt5a-(67aa-271aa))。图7显示纯化的重组蛋白能被虫卵免疫的兔血清识别，表明该重组蛋白具有良好的抗原性，可用于免疫BALB/c小鼠制备针对S jWnt5的多抗(图 7 中，M:蛋白 Maker ；1:加诱导剂的 pET28a-ffnt5a-(67aa-271aa)蛋白)。
[0058]实施例4SjWnt5蛋白多克隆抗体的制备
[0059]取6~10周龄Balb/c雄性小鼠10只随机分成两组，一组5只小鼠，分别为免疫组和佐剂对照组。免疫组是将纯化后的重组蛋白与206佐剂按照体积46: 54比例混合乳化进行首免，背部皮下多点注射，注射剂量为50ug/只。佐剂对照组是用同等体积的206佐剂和PBS混合乳化进行首免，免疫方法同免疫组。以后每隔10天进行加强免疫，免疫剂量25ug/只，途径同于首免。在第5次加强免疫后一周进行摘眼球采血，分离血清。-80°C冰箱冻存备用。
[0060]收集SjWnt5纯化 重组蛋白第5次加强免疫后的BALB/c小鼠血清作为一抗，以23天虫体全蛋白作抗原，进行Western blot分析。结果如图8a所示:SjWnt5蛋白的抗血清能识别虫体天然蛋白中大于70kD的单一蛋白条带，约是SjWnt5理论分子量的2倍。而阴性血清与虫体的天然蛋白不发生反应(图Sb)，说明制备的SjWnt5蛋白多抗具有良好的特异性。图8中，a:Sjffnt5多抗的检测；b:正常血清。
[0061]实施例5 SjWnt5蛋白在不同发育阶段日本血吸虫体内的表达
[0062]按照动物细胞(组织)总蛋白抽提试剂盒(I型)(DBI)说明书，抽提冻存的虫卵、7天、13天、18天、23天、35天虫体蛋白，其中23天和35天雌雄虫分开。抽提的虫体蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移到硝酸纤维(NC)膜上。分别以1: 50比例稀释的SjWnt5蛋白免疫多抗和以I: 1000稀释的tubulin作一抗，以I: 15000的比例稀释IRDye?800标记的羊抗小鼠IgG(Rockland)作二抗。通过Odyssey红外突光扫描成像系统分析显色结果O
[0063]日本血吸虫不同发育阶段SjWnt5蛋白表达结果见图9。图9中显示，以tubulin作为内参，分子量在55ku处，在灰度值都一定的情况下，Sjffnt5蛋白表达的灰度值有明显的不同。SjWnt5蛋白从虫卵到18天表达量增加。在23天及其后的雌雄虫中，SjWnt5蛋白表达呈现相反的趋势，在雌虫中表达逐渐下调，52天的雌虫表达水平在所有发育阶段中最低在雄虫中表达逐渐上调，42天的雄虫表达水平最高。SjWnt5蛋白表达趋势与Sjffnt5mRNA在不同发育阶段表达趋势基本相一致。
[0064]以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0065]序列表
[0066] 〈110〉中国农业科学院上海兽医研究所
[0067]〈120〉日本血吸虫Wnt5基因、蛋白及应用
[0068]<160>16
[0069]<170>PatentIn version 3.3
[0070]<210>1
[0071]<211>382
[0072]<212>PRT
[0073]<213>Schistosoma japonicum
[0074]〈400〉I
[0075]Met Asn He He Lys He His His Arg Gln His Leu Tyr Gln Gln Tyr
[0076]151015
[0077]Ser Leu Asn Gly Leu Leu Val Leu He Leu Leu He Tyr Ala Leu Asn
[0078]202530
[0079]He Asn Gln Thr Asn Ala Phe Gly Asn Met Gly Tyr Trp Trp Asn He
[0080]354045
[0081]Gly Leu Leu Ser Trp Arg Thr He His Gln Ser Pro Ala Phe Leu Leu
[0082]505560
[0083]Ala Pro Lys Pro Leu Cys Leu Arg Val Gln Gly Leu Thr His Ser Gln
[0084]65707580
[0085]Ala Gln Leu Cys Gln Arg Tyr Phe Asp His Met Pro Val He Ser He
[0086]859095
[0087]Gly Ala Lys Leu Gly He Tyr Glu Cys Gln Arg Gln Phe Arg Phe Arg
[0088]100105110
[0089]His Trp Asn Cys Ser Ser Val Asn Asp Ala Ser Ala Phe Gly Pro Val
[0090]115120125
[0091]Thr Leu Thr Gly Ser Arg Glu Ala Gly Phe Ala His Ala He Ser Ala
[0092]130135140
[0093]Ala Gly Val Val His Ala Leu Ala Arg Ser Cys Lys Glu Ala Arg Leu
[0094]145150155160
[0095]Tyr Ser Cys Gly Cys Ser Lys Ala Asp Arg Pro Asp Gln Leu His Arg
[0096]165170175
[0097]Asp Trp He Trp Gly Gly Cys Gly Asp Asn Thr Ala Tyr Ala Tyr Arg
[0098]180185190
[0099]Phe Ala Lys Ala Phe He Asp Val Arg Glu Lys Glu Gln Ser Tyr Pro
[0100]195200205
[0101]Arg His Ser Asn Glu Leu Ala Arg Met Leu Met Asn Leu His Asn Asn
[0102]210215220
【权利要求】
1.一种日本血吸虫基因，其特征在于，所述基因为编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的Wnt5基因。
2.根据权利要求1所述的日本血吸虫基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
3.—种日本血吸虫蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的Wnt5蛋白质。
4.一种重组载体，其特征在于，包含编码SEQ ID N0.1中第67-271位氨基酸序列的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组载体。
6.一种多克隆抗体，其特征在于，该多克隆抗体是用权利要求4所述重组载体表达的重组蛋白免疫动物而制得。
7.权利要求1所述日本血吸虫基因在制备预防或治疗血吸虫病的药物中的应用。
8.权利要求3所述日 本血吸虫蛋白质在制备预防或治疗血吸虫病的药物中的应用。
【文档编号】C07K16/20GK103966237SQ201310199173
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2013年5月24日
【发明者】苑纯秀, 高阳, 邓玲玲, 叶忠雪, 塔娜, 冯新港, 杨健美, 林矫矫 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所