化学合成呋喃丙烯基荧光二肽金属蛋白酶底物的方法
【专利摘要】本发明属于化学合成领域，涉及呋喃丙烯基荧光二肽及中间体的化学合成方法。本发明先对氨基酸甲酯盐酸盐进行氨解，得到氨基酰胺；用缩合试剂将氨基酰胺与Fmoc-甘氨酸进行肽缩合，得到Fmoc保护的二肽；脱除Fmoc保护基，然后与呋喃丙烯酸缩合得到相应的最终产物。本发明合成方法设计新颖，通过三步反应以高总产率61%-67%完成了呋喃丙烯基类荧光二肽酶底物在克级的制备。
【专利说明】化学合成呋喃丙烯基荧光二肽金属蛋白酶底物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于金属蛋白酶二肽底物的化学技术合成领域，涉及呋喃丙烯基荧光二肽及中间体的化学合成方法。
技术背景
[0002]嗜热溶蛋白芽孢杆菌Cfeci77w5.所产生的嗜热菌蛋白酶是一种含有锌离子的肽链内切酶。因其具有良好的热稳定性，被广泛地应用于蛋白质序列分析、蛋白质纯化、组织解离等众多生命科学前沿领域。以嗜热菌蛋白酶为代表的金属蛋白酶在自然界中广泛存在，并在许多生理过程中起着重要的作用，如消化吸收和血压调节等。在对嗜热菌蛋白酶及其它金属蛋白酶的酶抑制活性研究对于阐明其催化机理和相关的药物开发具有重要意义。由于嗜热菌蛋白酶对含有疏水侧链的氨基酸肽键具有特异性，例如L-苯丙氨酸、L-亮氨酸等。因此，(3-[2_呋喃]丙烯)甘氨酸亮酰胺、(3-[2_呋喃]丙烯)甘氨酸苯丙酰胺等在肽键切断前后具有显著荧光吸收变化的呋喃丙烯基二肽酰胺类酶底物被广泛地应用于嗜热菌蛋白酶及其抑制剂的活性研究。
[0003]目前关于此类金属蛋白酶底物的报道极为有限，且多数为生物发酵方法。其中仅有一种化学合成的方法是Feder和Schuck在1970年报道的用3-[2-呋喃]丙烯酰氯和甘氨酸亮酰胺反应制备FAGLA的方法。虽然该方法的产率一般，但是其中酰氯和亮酰胺的制备条件苛刻，步骤复杂。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为四种呋喃丙烯基二肽金属蛋白酶荧光底物的化学合成提供一种简便、高效的实用方法。
[0005]本发明对呋喃丙烯基二肽荧光酶底物#-(3-[2_呋喃]丙烯)甘氨酸亮酰胺(15)、N- (3_[2_呋喃]丙烯)甘氨酸异売酰胺(16)、Ar- (3_[2_呋喃]丙烯)甘氨酸苯丙酰胺
(17)、#- (3-[2_呋喃]丙烯)甘氨酸缬酰胺(18)(结构式如图3所示)的合成主要包括以下三个步骤及重要中间体:1)对氨基酸甲酯盐酸盐1-4进行氨解，得到氨基酰胺5-8 (如图1)，产率:80 - 83% ;2)用缩合试剂将氨基酰胺5-8与Fmoc-甘氨酸9进行肽缩合，得到Fmoc保护的二肽10-13 (如图2)，产率:77 - 83% ；3)将10-13的Fmoc保护基脱除，然后与呋喃丙烯酸14缩合得到最终产物15-18 (如图3)，产率:78 - 81%。
[0006]如图1所示，在本方法的步骤一中，1-4与浓氨水的摩尔比例为1:5至1:10，反应温度为20 1:至60 °C，反应时间为6小时至12小时。
[0007]如图2所示，在本方法的步骤二中，使用的缩合试剂为2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N N -四甲基脲六氟膦酸酯(HATU)/A N- 二异丙基乙胺(DIEA)，Fmoc-甘氨酸9与缩合试剂的摩尔比例为1:1至1:1.5，反应溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)，反应温度为20至50 °C，反应时间为6小时至24小时。
[0008]如图3所示，在本方法步骤三中，脱除Fmoc保护基过程中，10_13与哌啶的摩尔比例为1:3至1:10，反应温度为O至40 °C，反应时间为10分钟至I小时；肽缩合反应中，使用的缩合试剂为2- (7-偶氮苯并三氮唑)-% % -四甲基脲六氟膦酸酯(HATU)/A 二异丙基乙胺(DIEA)，甘氨酸亮酰胺与缩合试剂的摩尔比例为1:1至1:1.5，与呋喃丙烯酸14的摩尔比例为1:1，反应溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)，反应温度为20至50°C，反应时间为6小时至24小时。[0009]与以往文献报道的方法相比，本发明专利报道的新方法采用先合成Fmoc保护的二肽酰胺片段，再与呋喃丙烯酸缩合得到目标产物的新策略，通过大量反应条件的摸索和优化，选用适当的保护基与肽缩合试剂，通过三步反应以高总产率(61-67%)完成了呋喃丙烯基类荧光二肽酶底物在克级的制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1氨基酰胺的制备。
[0011]图2 Fmoc保护甘氨酸亮酰胺的制备。
[0012]图3呋喃丙烯基荧光酶底物的合成。
【具体实施方式】
[0013]下面结合说明书附图，对本发明技术方案作进一步说明。
[0014]实施例1.N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸亮酰胺15的合成
步骤一:亮酰胺5的合成:向装有10 mL浓氨水(28%，5.0当量)的烧瓶中加入2 g亮氨酸甲酯盐酸盐I (11 mmOl，1.0当量)，加热到60 °C，反应6小时。减压蒸除氨水。残余物硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:15:1至10:1)，得到1.14 g白色粉末状亮氨酰胺5，产率为80%。
[0015]步骤二:FmoC-甘氨酸亮酰胺10的合成:在圆底烧瓶中加入2.3 g(7.7 mmol, 1.0当量)Fmoc-甘氨酸9和4.4 g HATU (11.5 mmol，1.5当量)，加入20 mL干燥的DMF溶解，加入3.75 mL DIEA (23.1 mmol，3.0当量)，室温下搅拌20分钟。向反应瓶中加入I g亮氨酰胺5 (7.7 !1111101，1.0当量)，50 °C下反应6小时。减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:40:1至30:1)，得到2.66 g白色粉末状Fmoc-甘氨酸亮酰胺10，产率为83%。
[0016]步骤三'N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸亮酰胺15的合成:将2 g Fmoc-甘氨酸亮酰胺10 (4.9 mmol，1.0当量)溶于哌啶(24.5 mmol，5.0当量)的DMF溶液(12 mL, 20%)中，室温下，反应10分钟。减压蒸除溶剂，得到淡黄色油状甘氨酸亮酰胺，粗产物直接用于下一步。将 676 mg 呋喃丙烯酸 14 (4.9 mmol，1.0 当量)和 2.8 g HATU (7.35 mmol, 1.5当量)在DMF (20 mL)中溶解，加入2.4 mL DIEA (14.7 mmol，3.0当量)，室温下搅拌20分钟。将脱除保护得到的甘氨酸亮酰胺用DMF (5 mL)溶解，加入反应瓶中，50 °C反应6小时。减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:40:1至30:1)，得到1.22 g白色粉末状N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸亮酰胺15，产率为81%。
[0017]实施例2.N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸异亮酰胺16的合成。
[0018]步骤一:异亮酰胺6的合成:向装有10 mL浓氨水(28%，5.0当量)的烧瓶中加入
2g异亮氨酸甲酯盐酸盐2 (11 mmol, 1.0当量),加热到50 °C,反应10小时。减压蒸除氨水，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:15:1至10:1)，得到1.15 g白色粉末状异亮氨酰胺6，产率为80%。
[0019]步骤二:Fmoc-甘氨酸异亮酰胺11的合成:在圆底烧瓶中加入2.3 g (7.7 mmol,1.0 当量)Fmoc-甘氨酸 9 和 4.38 g HATU (9.24 mmol，1.2 当量)，加入 20 mL 干燥的 DMF溶解，加入3.72 mL DIEA (18.5 mmol，2.4当量)，室温下搅拌20分钟。向反应瓶中加入Ig正纟颜酰胺6 (7.7 mmol, 1.0当量),40 °C下反应10小时。减压蒸除溶剂,硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:40:1至30:1)，得到2.53 g白色粉末状Fmoc-甘氨酸异亮酰胺11，产率为79%。
[0020]步骤三'N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸正缬酰胺16的合成:将2 g Fmoc-甘氨酸异亮酰胺11(4.9 mmol，1.0当量)溶于哌啶(24.5 mmol，5.0当量)的DMF溶液(12 mL, 20%)中，室温下，反应I小时。减压蒸除溶剂，得到淡黄色油状甘氨酸异亮酰胺，用于下一步。将676 mg 呋喃丙烯酸 14 (4.9 mmol，1.0 当量)和 5.88 g HATU (4.9 mmol，1.2 当量)用 20mL DMF溶解，加入1.92 mL DIEA (9.8 mmol，2.4当量)，室温下搅拌20分钟。将脱除保护得到的甘氨酸正缬酰胺用5 mL DMF溶解，加入反应瓶中，40 °C下反应10小时。减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:40:1至30:1)，得到1.18 g白色粉末状(3_[2_呋喃]丙烯)甘氨酸异亮酰胺16，产率为82%。
[0021]实施例3.N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸苯丙酰胺17的合成。
[0022]步骤一:苯丙酰胺7的合成:向装有18 mL浓氨水(28%，10当量)的烧瓶中加入2g苯丙氨酸甲酯盐酸盐3(10 _ο1，1.0当量)，室温下反应12小时。减压蒸除氨水，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:15:1至10:1)，得到1.05 g白色粉末状苯丙氨酰胺7，产率为70%。
[0023]步骤二:Fmoc-甘氨酸苯丙酰胺12的合成:在圆底烧瓶中加入2 g (6.67 mmol,1.0 当量)Fmoc-甘氨酸 9 和 3.16 g HATU (6.67 mmol，1.0 当量)，加入 15 mL 干燥的 DMF溶解，加入2.68 mL DIEA (13.34 mmol，2.0当量)，室温下搅拌20分钟。向反应瓶中加入I g苯丙酰胺7 (6.67 mmol, 1.0当量),30 °C下反应12小时。减压蒸除溶剂,硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:40:1至30:1)，得到2.2 g白色粉末状Fmoc-甘氨酸苯丙酰胺12，产率为77%。
[0024]步骤三'N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸苯丙酰胺17的合成:将2 g Fmoc-甘氨酸苯丙酰胺12 (4.67 mmol，1.0当量)溶于哌啶(23.3 mmol，5.0当量)的DMF溶液(11 mL,20%)中，室温下，反应I小时。减压蒸除溶剂，得到淡黄色油状甘氨酸苯丙酰胺，用于下一步。将 644 mg 呋喃丙烯酸 14 (4.67 mmol, 1.0 当量)，2.2 g HATU (4.67 mmol, 1.0 当量)，加入15 mL干燥的DMF溶解，加入1.88 mL DIEA (9.34 mmol，2.0当量)，室温下搅拌20分钟。将脱除保护得到的甘氨酸苯丙酰胺用5 mL DMF溶解，加入反应瓶中，30 °C下反应12小时。减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:40:1至30:1)，得到1.2 g白色粉末状N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸苯丙酰胺17，产率为79%。
[0025]实施例4.N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸正缬酰胺18的合成。
[0026]步骤一:缴酰胺8的合成:向装有10 mL浓氨水(28%，5.0当量)的烧瓶中加入2 g缴氨酸甲酯盐酸盐4 (12 mmol, 1.0当量),加热到50 °C,反应10小时。减压旋除氨水,娃胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:15:1至10:1)，得到1.11 g白色粉末状缬氨酰胺8，产率为80%。
[0027]步骤二:Fmoc-甘氨酸缬酰胺13的合成:在圆底烧瓶中加入2.3 g(7.7 mmol, 1.0当量)Fmoc-甘氨酸9和3.27 g HATU (8.6 mmol，1.0当量)，加入20 mL干燥的DMF溶解，加入2.8 mL DIEA (17.2 mmol, 2.0当量)，室温下搅拌20分钟。向反应瓶中加入I g缬酰胺8(8.6臟01，1.0当量)，20 °C下反应24小时。减压蒸除除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:40:1至30:1)，得到2.78 g白色粉末状Fmoc-甘氨酸缬酰胺13，产率为82%。
[0028]步骤三'N- (3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸正缬酰胺18的合成:将2 g Fmoc-甘氨酸缬酰胺14 (5.06 mmol，1.0当量)溶于哌啶(25.3 mmol，5.0当量)的DMF溶液(14 mL,20%)中，室温下，反应I小时。减压蒸除溶剂，得到淡黄色油状甘氨酸缬酰胺，用于下一步。将 700 mg 呋喃丙烯酸 14 (5.06 mmol, 1.0 当量)和 1.9 g HATU (5.06 mmol, 1.0 当量)用20 mL DMF溶解，加入1.7 mL DIEAC10.1 mmol, 2.0当量)，室温下搅拌20分钟。将脱除保护得到的甘氨酸缬酰胺用5 mL DMF溶解，加入反应瓶中，20°C下反应24小时。减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:40:1至30:1)，得到 1.17 g白色粉末状ΛΚ3-[2-呋喃]丙烯)甘氨酸正缬酰胺18，产率为78%。
【权利要求】
1.化学合成呋喃丙烯基荧光二肽金属蛋白酶底物的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)对氨基酸甲酯盐酸盐进行氨解，得到氨基酰胺；所述氨基酸甲酯盐酸盐为
2.如权利要求1所述的化学合成呋喃丙烯基荧光二肽金属蛋白酶底物的方法，其特征在于步骤I)中氨基酸甲酯盐酸盐进行氨解，氨基酸甲酯盐酸盐与浓氨水的摩尔比例为1:5至1:10，反应温度为20 1:至60 °C，反应时间为6小时至12小时。
3.如权利要求1所述的化学合成呋喃丙烯基荧光二肽金属蛋白酶底物的方法，其特征在于步骤2)中缩合试剂为2- (7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟膦酸酯HATU或％ 二异丙基乙胺DIEA，Fmoc-甘氨酸与缩合试剂的摩尔比例为1:1至1:1.5，反应溶剂为N，N- 二甲基甲酰胺DMF，反应温度为20至50 °C,反应时间为6小时至24小时。
4.如权利要求1所述的化学合成呋喃丙烯基荧光二肽金属蛋白酶底物的方法，其特征在于步骤3)，脱除Fmoc保护基过程中，Fmoc保护的二肽与哌啶的摩尔比例为1:3至1:10，反应温度为O至40 °C，反应时间为10分钟至I小时；与呋喃丙烯酸缩合反应中，使用的缩合试剂为2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N, N，，-四甲基脲六氟膦酸酯HATU或％ 二异丙基乙胺DIEA，甘氨酸亮酰胺与缩合试剂的摩尔比例为1:1至1:1.5，与呋喃丙烯酸的摩尔比例为1:1，反应溶剂为二甲基甲酰胺DMF，反应温度为20至50 °C，反应时间为6小时至24小时。
【文档编号】C07K1/06GK103467567SQ201310452367
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】孙麒, 龚珊珊, 杨庆昆, 蒲守智, 多树旺 申请人:江西科技师范大学